专利名称：含有s1-5的蛋白质制备物的制作方法
技术领域：
本发明涉及Sl-5基因缺损、呈现老化性疾患或症状的非人基因敲除动 物及其制备方法。此外，本发明还涉及以给予上述动物候选物质为特征的 老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法。此外，本发明还涉及从 该非人基因敲除动物分离的细胞及其用途。进一步涉及Sl-5蛋白及其用途。
背景技术：
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,以下简称RA)是可见关节滑膜组 织内异常增生的全身性慢性炎症疾病。滑膜细胞(synovial cell)是在关节 的滑膜处形成1 ~ 6层上皮样层的成纤维细胞样细胞，被认为向滑膜液提供 蛋白聚糖和透明质酸。在RA患者的关节处可见滑膜组织增生及其引起的多 层结构、炎症细胞浸润等各种症状。本发明人在阐明RA发病及进展背后的分子水平机制的研究的过程中， 发现了在RA患者的滑膜组织中强表达的基因。该基因编码的蛋白与表达组 织即滑膜细胞(synovial cell)有关，因而被命名为滑膜素(Synoviolin)(专 利文献l)。此外，本发明人通过蛋白的生化结合实验证明存在滑膜素结合因子 Sl-5 (又名EFEMP-1、 FBNL或FBLN-3等)。Sl-5是由本发明人首次作为 滑膜素结合因子分离的蛋白。Sl-5是作为人二倍体成纤维细胞中的过量表达基因而被分离的 (Leucka画Czernik, B. " "/., Mol. Cell. Biol. 15: 120-128, 1995)，在结构上，发现 了促进DNA合成(细胞增殖)的表皮生长因子(EGF)样域及血纤蛋白样 域。此外，最近还有报道称Sl-5的变异与Malattia Leventinese(ML)及多因 蜂窝状视网膜营养不良(Doyne honeycomb retinal dystrophy) (DHRD)相关 (非专利文献l)。然而，Sl-5的详细功能至今未知，关于Sl-5缺损时的个体表现型也尚 未明确。专利文献1:国际<^开第WO02/052007号小册子非专利文献1: Stone, E.M.等人，Nature Genetics 22,199-202,1999发明内容本发明所解决的课题本发明的目的是提供Sl-5基因缺损、呈现老化性疾患或症状的非人基 因敲除动物及其制备方法。本发明的目的还在于提供以给予上述动物候选 物为特征的老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法。此外，本发 明目的还有提供从该非人基因敲除动物分离的细胞及其用途，以及Sl-5蛋 白及其用途。解决本i果题的手段本发明人致力于解决上述课题的研究，结果发现丧失Sl-5基因功能的基因 敲除小鼠会出现老化性疾患或症状。而且表明该基因敲除小鼠的骨盐量、 骨密度、骨强度下降，而且骨组织中的破骨细胞数增加。进一步，在体外， 使用该基因敲除小鼠来源的骨髓细胞进行的破骨细胞形成能力分析结果表 明，与野生型小鼠相比，该基因敲除小鼠来源的骨髓细胞中破骨细胞形成 能力亢进且破骨细胞的大小增大。此夕卜，在该体外体系中加入纯化后的Sl-5 蛋白可以抑制破骨细胞形成能力，该细胞的大小减小。进一步，对骨质疏 松症模型小鼠和大鼠施用纯化的Sl-5蛋白，发现Sl-5蛋白具有改善骨质疏 松症的效果。上述认识表明Sl-5蛋白在骨变形、骨质疏松症、骨佩吉特 病(骨A、2工、;/卜病)、甲状旁腺功能亢进症、骨密度低下、骨皮质海绵 化、脱毛、组织损伤或坏死、胂瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤 老化(斑点、无光、松弛、细紋、黑痣等)及指甲老化等老化性疾患的治 疗、预防中发挥作用。即，本发明如下所述。(1) 丧失全部或部分Sl-5基因功能的呈现老化性疾患或症状的非人基 因敲除动物。(2) (l)中所述的动物，其中全部或部分S1-S基因功能的丧失是由Sl-5 基因的损坏或变异引起的。(3) (1)中所述的动物，其中老化性疾病或症状为选自骨变形、骨质疏松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度低下、骨皮质海绵化、脱 毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及 指曱老化中的至少一种。(4) (1)中所述的动物，其是选自斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、 猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩中的任意动物。(5) 从(1)~(4)任意一项所述的非人基因敲除动物中分离的细胞。(6) (5)中所述的细胞，其是破骨细胞、角质化上皮细胞、血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经细 胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色素 细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。(7) 发生老化性疾患的非人基因敲除动物的制备方法，其中使Sl-5基 因的全部或部分功能丧失。(8) (7)中所述方法，其中Sl-5基因全部或部分功能丧失是由Sl^基因 的破坏或变异引起的。(9) (7)中所述方法，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏松症、 骨佩吉特病、甲状旁腺功能亢进症、骨密度、骨皮质海绵化、脱毛、组织 损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指曱老化 中的至少一种。(10) (7)中所述方法，其中动物是斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、 猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩中的任意动物。(11) 老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中4十对(1)~ (4)任意一项所述的基因敲除动物给予所述预防或治疗药物的候选物质。(12) 老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中使老化性 疾患或症状的预防或治疗药物的候选物质与从(l) ~ (4)任意一项所述的基因 敲除动物中分离的细胞相4妄触。(13) (l2)中所述的方法，其中细胞是破骨细胞、角质化上皮细胞、 血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌 细胞、神经细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、 肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。(14) (11) (13)任意一项所述的方法，其中老化性疾患或症状为选自骨 变形、骨质疏松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度低下、骨皮质海绵化、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出 血、皮肤老化及指曱老化中的至少一种。(15) 破骨细胞功能抑制剂的筛选方法，其特征是使破骨细胞功能抑制剂候选物质与(l) ~ (4)任意一项所述的非人基因敲除动物来源的破骨细胞相接触。(16) 下面(a)-(d)任意一项所述的分离的蛋白质。(a) 包含SEQ ID NO:2或4所述氨基酸序列的蛋白质。(b) 由包含SEQ ID NO: 1或3所述碱基序列的编码区的DNA所编码的蛋白质。(c) 包含在SEQ ID NO:2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸 替换、缺失、插入及/或增加的氨基酸序列，在功能上与包含SEQIDNO:2 或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的蛋白质。交的DNA编码，在功能上与包含SEQ ID NO:2或4所述氨基S交序列的蛋白 质等同的蛋白质。(17) (16)所述蛋白质的部分肽。(18) (17)所述的肽，其包含SEQIDNO:6记载的氨基酸序列。(19) 老化性疾患或症状的预防或治疗药物，其含有(16)所述的蛋白质、 或者(17)或(18)所述的肽。(20) (19)所述的预防或治疗药物，其中老化性疾病或症状为选自骨变 形、骨质疏松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度低下、骨皮 质海绵化、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、 皮肤老化及指曱老化中的至少 一种。(21) —种破骨细胞功能抑制剂，其含有(16)所述的蛋白质，或者(17)或 (18)所述的肽。(22) —种抗体，其与(16)所述的蛋白质、或者(17)或(18)所述的肽结合。 附图筒要i兌明(
图1) Sl-5基因缺损的基因打靶载体的结构的示意图。在小鼠Sl-5 基因片段的翻译起始点(翻译成第一个曱硫氨酸的ATG密码子，用*示出) 中导入了 lacZ基因，导入了新霉素抗性(Neo)基因作为正向选择标记基因。此外，还连接了白喉毒素A(DT-A)基因作为负向标记。在发生了同源重组 的个体中Sl-5基因缺损，而代之表达(3-半乳糖苷酶。通过利用这种酶活性 的lacZ染色，可以检测始于Sl-5基因的启动子的表达。该图还示出了用于 进行Southern印迹分析以确认基因型的探针的位置。(图2)是显示Sl-5基因突变小鼠的基因型分析结果的照片。A显示 了从小鼠尾部提取DNA、用Bamffl消化后、使用图1所示的探针进行 Southern印迹分析的结果。B显示了 Northern印迹分析结果。(图3A)显示26月龄Sl-5基因敲除小鼠的表现型的照片。Sl-5-A雄 性(动物编号1101)。可见脊柱后凸、脱毛、面部皮肤损伤、指曱坏死、 胸部肥大，解剖时可见腹水和肝脏肿瘤。(图3B)显示26月龄Sl-5基因敲除小鼠的表现型的照片。Sl-5-A雌 性(动物编号1097)。可见脊柱后凸、止血困难、血细胞比容值低。指 曱坏死、眼底血块，解剖时可见子宫肥大、脂肪组织内血块。(图3C)显示26月龄Sl-5基因敲除小鼠的表现型的照片。Sl-5-A雌 性(动物编号1103)。可见脊柱后凸。(图4 )显示野生型小鼠和Sl-5基因敲除小鼠骨变形情况的X光照片。 (图5)显示野生型小鼠和S1-5基因敲除小鼠骨变形情况的X光照片。 (图6)显示S1-5基因敲除小鼠骨变形情况的X光照片。 (图7) A为显示Sl-5基因敲除小鼠脊柱弯曲角度的照片。B为按周 龄统计Sl-5基因敲除小鼠脊柱弯曲角度发病率的图，其中对各周龄的小鼠 进行X光照像后，测量脊推弯曲的角度，该角度在95。或95。以下则定为后 凸发病。(图8)按周龄统计Sl-5基因敲除小鼠脊柱弯曲角度的图表。(图9)显示Sl-5基因敲除小鼠脊推(胸推(10-12)腰推(1-3))的骨密度测定结果的图和照片。SBl-855等表示动物编号，柱形图内的数字表示周龄，()内的数字表示后凸角度。(图10)显示Sl-5基因敲除小鼠脊推(胸推(10-12)腰稚(1-3))的骨密度测定结果的图。各柱形图表示各组的平均值，柱形图内的数字表示n值。(图11)显示Sl-5基因敲除小鼠股骨骨密度测定结果的图和照片。 SBl-855等表示动物编号，柱形图内的数字表示周龄。(图12)显示Sl-5基因敲除小鼠股骨骨密度测定结果的图。柱形图内的数字表示n值。(图13)显示Sl-5基因敲除小鼠脊推(胸推(10-12))的显《效CT图 像的照片。SBl-855、 LB594等表示动物编号。(图14)显示Sl-5基因敲除小鼠的pQCT检测结果的图表。(图15)显示S1-5基因敲除小鼠尿中NTx值的图表。针对每个个体， 收集合并一周内的尿液进行测定。(图16)按周龄统计Sl-5基因敲除小鼠尿中NTx值的图表。(图17 )显示雌性Sl-5基因敲除小鼠和野生型小鼠的股骨硬组织染色 标本中的骨组织的照片。SB2-卯5、 LB574等表示动物编号。(图18)对于图17所示的雌性Sl-5基因敲除小鼠和野生型小鼠的代 表性例子，对其股骨硬组织染色标本中的骨组织进行放大的照片。SB2-905、 LB574等表示动物编号。(图19)显示Sl-5基因敲除小鼠组织切片中的破骨细胞的照片和显示 TRAP阳性细胞数的图表。(图20 )显示Sl-5基因敲除小鼠组织切片中破骨细胞面积测定结果的图表。(图21A-C)A为实验步骤示意图。B、 C为显示Sl-5基因敲除小鼠来 源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的示意图。B为利用TRAP染色所得的 TRAP阳性多核细胞数测定结果。C为TRAP溶解测定的结果。(图21D-E ) D为显示TRAP阳性多核巨细胞面积测定结果的图表。E 为显示Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的照片。(图22)切断Sl-5基因敲除小鼠的小鼠尾，用滤纸每隔10秒吸取涌 出的血液，图22为显示其结果的照片。SBl-727、 LB438等表示动物编号。(图23 )显示S1-5基因敲除小鼠血细胞比容值的照片。SB1-739、LB438 等表示动物编号。(图24) Sl-5基因敲除小鼠血细胞比容值示意图。SBl-739、 LB438 等表示动物编号。(图25)由采自Sl-5基因敲除小鼠的尾静脉的血液所制作的血液涂片 标本的Giemsa染色照片。LB438、 LB487等表示动物编号。(图26)显示在稳定表达Sl-5-His蛋白的CHO-K1细胞抹(bulk)中Sl-5-His蛋白的表达的照片。N表示未进行转染的CH0-K1细胞，P表示短 暂表达了 Sl-5-组氨酸蛋白的CHO-K1细胞。(图27 )显示克隆化的稳定表达Sl-5-His的CHO-K1细胞抹中Sl-5-His 蛋白的表达的照片。N表示未进行转染的CH0-K1细胞，P表示瞬时表达了 Sl-5-His蛋白的CHO-K1细胞。(图28 )显示克隆化的稳定表达Sl-5-His的CHO-K1细胞抹中Sl-5-His 蛋白的表达的照片。N表示未进行转染的CHO-K1细胞。(图29 ) 250mM咪唑洗脱级分所含的蛋白质经10% SDS-PAGE分离， 然后采用银染法(A)及使用抗Sl-5抗体的Western印迹法(B )进行检测。 图29为显示检测结果的照片。(图30) 50mM (A)和100mM (B)咪唑洗脱级分中所含的蛋白质经 10。/。SDS-PAGE分离，然后采用银染法进行检测。图30为显示4企测结果的 照片。(图31) Sl-5截短蛋白的模式图。(图32A)显示Sl-5-His截短蛋白制备结果的照片。(图32B)显示Sl-5-FLAG截短蛋白制备结果的照片。(图33 )使用抗Sl-5抗体通过Western印迹法检测下列物质的检测结 果的照片用抗FLAG抗体从细胞内纯化的FLAG-Sl-5 ( A)和用抗FLAG 抗体从培养上清液纯化的FLAG-Sl-5 (B)。(图34 )使用抗Sl-5抗体和抗FLAG抗体通过Western印迹法检测从 293F悬浮细胞纯化的Sl-5-FLAG蛋白的检测结果的照片。(图35 )使用抗Sl-5抗体通过Western印迹法检测经糖基肽酶F处理 的Sl-5-His蛋白的检测结果的照片。(图36 )通过Western印迹法检测从大肠杆菌纯化的GST-Sl-5-His截 4豆蛋白和经PreScission蛋白酶(prescission protease )处理的GST-Sl-5蛋白 的检测结果的照片。(图37)通过CBB染色和使用抗Sl-5抗体的Western印迹法检测从大肠 杆菌纯化的MBP-S1-5蛋白的检测结果的照片，1为GST-S1-5蛋白，2为 MBP-S1-5蛋白。(图38)通过CBB染色4企测从大肠杆菌纯化的、且经PreScission蛋白酶 处理的MBP-S1-5蛋白的^r测结果的照片。(图39)A为实验步骤示意图。B为显示CHO-Kl细胞来源的Sl-5-His 蛋白抑制Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的图表。 B中将TRAP阳性多核细胞数图表化。(图40)显示CHO-Kl细胞来源的Sl-5-His蛋白抑制Sl-5基因敲除小 鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的图表。其中将TRAP阳性多核巨 细胞数图表化。(图41 )显示CHO细胞来源的Sl-5-His蛋白抑制Sl-5基因敲除小鼠 来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力的照片。(图42A)显示TRAP阳性多核巨细胞面积由于CHO细胞来源的 Sl-5-His蛋白而减少的图表。(图42B )其形成以依赖于CHO细胞来源的Sl-5-His蛋白浓度的方式 被抑制的TRAP阳性多核巨细胞的染色照片。(图43 )显示Sl-5國His蛋白抑制Sl画5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的 破骨细胞形成能力的图表。其中将TRAP阳性多核细胞数图表化。(图44)显示Sl-5-His蛋白抑制Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的 破骨细胞形成能力的图表。其中将TRAP阳性多核巨细胞数图表化。(图45)显示Sl-5-His截短蛋白抑制Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细 胞的破骨细胞形成能力的照片。(图46)A为实验步骤示意图。B为显示CHO-K1细胞来源的Sl-5-His 蛋白抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的图表。(图47)显示Sl-5-His蛋白抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力 的照片。(图48)显示293F悬浮细胞来源的Sl-5-FLAG蛋白抑制RAW264.7 细胞的破骨细胞形成能力的图表。(图49 )显示无细胞表达系统产生的Sl-5蛋白不抑制RAW264.7细胞 的破骨细胞形成能力的图表。(图50)显示GST-S1-5蛋白抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力 的图表。(图51 )显示GST-S1-5蛋白抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力 的照片。(图52 )显示GST蛋白不抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的图表。(图53 )显示GST蛋白不抑制RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的照片。(图54)显示经PreScission蛋白酶处理的GST-S1-5蛋白抑制 RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的图表。(图55)显示经PreScission蛋白酶处理的GST-S1-5蛋白抑制 RAW264.7细胞的破骨细胞形成能力的照片。(图56 )显示经PreScission蛋白酶处理的GST蛋白不抑制RAW264.7 细胞的破骨细胞形成能力的图表。(图57 )显示经PreScission蛋白酶处理的GST蛋白不抑制RAW264.7 细胞的破骨细胞形成能力的照片。(图58)显示在摘除了卵巢的(OVX)的大鼠中，施用Sl-5蛋白导致 股骨的骨密度得以恢复的图表。(图59)显示在摘除了卵巢的(OVX)的大鼠中，施用Sl-5蛋白导致 股骨的骨强度得以恢复的图表。(图60)显示在摘除了卵巢的(OVX)的大鼠中，施用Sl-5蛋白导致 股骨的骨量得以恢复的照片。(图61) A为显示在摘除了卵巢的(OVX)的大鼠中，施用Sl-5蛋白 抑制了组织中的破骨细胞数的照片。B为其图表。(图62)显示在摘除了卵巢的(OVX)的小鼠中，施用Sl-5蛋白导致 股骨的骨密度得以恢复的图表。实施本发明的最佳方式以下，就本发明进行详细说明。 1.Sl-5基因编码Sl-5的基因是公知的，可利用登录号AAA65590(核苷酸登录号 U03877)、 138849、 NP_061489 (核香酸登录号NM 018894) 、 NP_004096 (核苷酸登录号NM 004105 )或Q12805所限定的Sl-5蛋白及与之类似的、 具有结合人滑膜素蛋白的活性的蛋白(Leucka-Czernik, B. d a/., Mol. Cell. Biol, 15: 120-128， 1995; Heon， E. da/.， Arch. Ophthalmol. 114: 193-198, 1996; Ikegawa, S.a/., Genomics 35: 590-592， 1996; Katsanis, N.a/.， Hum. Genet.106: 66-72, 2000; Giltay， R. e/a/" Matrix. Biol. 18: 469-480， 1999; Stone, E. M. da/., Nat. Genet.22: 199-202, 1999)。Sl-5基因可以从小鼠、大鼠等的基因组文库中获得。例如，可采用杂 交法从细菌人工染色体(BAC)文库中获取目的克隆。此外，也可通过PCR 方法获得。2.非人基因敲除动物本发明提供1)丧失全部或部分Sl-5基因功能的、呈现老化性疾患或 症状的非人基因敲除动物，及2)发生老化性疾患的非人基因敲除动物的制 备方法，其特征是使Sl-5基因的全部或部分功能丧失。Sl-5基因的全部或 部分功能丧失可以是例如Sl-5基因的破坏或者突变所导致的。本发明中，为了制备所述丧失全部或部分Sl-5基因功能的基因敲除动 物，可采用基因打靶方法。Sl-5基因的打靶载体用于通过破坏Sl-5基因而^f吏该基因的全部或部分 功能丧失。这里，"使功能丧失"包括两方面含义，即使基因完全失去功能， 或者使基因的功能处于比野生型更低的状态。为使功能丧失而实施的改变可以是单纯地破坏或缺损基因，也可以进 行修饰，如在基因中引入变异而使翻译阶段中阅读框发生偏移等。本发明的"基因敲除动物"可按以下方法制备。首先，将碱基序列部分或全部发生修饰的Sl-5基因导入分化全能性细 胞，并选择导入了发生修饰的Sl-5基因的分化全能性细胞。接下来，将选 出的接受了基因修饰(缺损、破坏、突变等)的分化全能性细胞导入受精 卵制备嵌合个体，通过所得嵌合个体的交配，产生敲除了同源染色体中一 条或两条上的Sl-5基因的个体。本发明所使用的动物的种类没有特别限制。例如，可以是除人之外的 斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑 猩猩等。本发明优选容易操作和繁殖的小鼠。本说明书中，为使Sl-5基因丧失功能，可以修饰Sl-5基因的部分或全 部碱基序列。所谓"修饰"是指向Sl-5基因DNA的一部分导入引起缺损、替 换或添加的突变。这种突变，例如可以是由基因工程方法造成的碱基序列 的部分或全部去除(缺失)、或者其它基因或碱基序列的插入或替换。例 如，可以通过使密码子阅读框发生偏移、破坏启动子或外显子的功能的方法制备Sl-5缺损基因。由此，Sl-5基因表达产物Sl-5蛋白的功能消失。本发明的基因敲除小鼠可采用公知的基因重组方法(基因打靶法)制 备。基因打靶方法是本领域中为人熟知的技术，在本领域的各种实验手册 中均有讲述。在设计基因打靶载体时，对于可造成Sl-5基因结构变化的位点没有特 别的限定，只要Sl-5基因功能缺失即可。然而，考虑到Sl-5基因的功能及 结构，特别优选设计使得Sl-5基因的EGF样域或血纤蛋白样域缺失。此外，优选联合运用下列方法来选择导入了载体的重组体利用通过 基因打靶载体导入的药物抗性基因的筛选方法，和利用Southern杂交和PCR 的筛选方法。作为药物选择标记基因，可以使用新霉素抗性基因、潮霉素B 磷酸转移酶基因等。此外，对于负向选择基因，可以使用HSV胸苷激酶基 因、白喉毒素A基因等。使用按上述方法制备的基因打靶载体进行同源重组。在本说明书中， "同源重组"是指人工地使发生修饰的Sl-5基因重组到基因组中Sl-5基因 的DNA区域中。为获得目标同源重组体，需要对多个重组体进行筛选。但是，对受精 卵进行多次筛选在技术上是困难的。因此，优选使用与受精卵同样具有多 分化能力且可体外培养的细胞。作为分化全能性细胞，对小鼠(Nature 292:154-156,1981 )、大鼠(Iannaccone， P.M.等人，Dev. Biol. 163. (1): 288-292, 1994 ))、 猴(Thomson, J.A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848，1995 )及兔(Schoonjans, L.等人，Mol. Reprod. Dev. 45 (4): 439-443,1996)而言，已建立的有胚胎干(Embryonic stem, ES)细胞等。此外， 对家猪而言，已建立的有胚胎生殖(embryonic germ, EG )细胞(Shim， H. 等人，Biol. Reprod 57(5):1089-1095.1997 )。因而，本发明中优选以上述动物物种为对象进行制备，特别是以基因 敲除动物制备技术较完备的小鼠为最佳。在小鼠ES细胞方面，现在已建立 起数个小鼠来源的ES纟田月包抹，例如可以使用TT-2细胞才朱，AB-1纟田月包才朱、 Jl细胞抹、Rl细胞株等。至于究竟使用上述哪一种ES细胞抹，可以根据 实验目的与方法做出合适的选择。在建立ES细胞时，通常使用受精后第3.5天的胚泡，除此之外，可以 采集8细胞期胚，然后培养至形成胚泡，从而可以高效地获得多个初期胚。以上述方式获得的ES细胞抹通常具有极好的增殖性能，但也容易丧失 能够个体发育的再生能力，因此传代培养时必须特别注意。例如，可在诸如STO成纤维细胞这样的合适的滋养细胞(feeder cell)上、在白血病抑制 因子(LIF) ( 1 ~ 10000U/mL)存在下，在二氧化碳培养箱内(优选5% 二氧化石灰、95%空气或5%氧气、5%二氧化碳、90%空气)、约37。C条件下 进行培养；传代时，例如可以采用通过胰蛋白酶/EDTA溶液处理实现单细 胞化，然后接种在新鲜制备好的滋养细胞上的方法。这样的传代通常每1 3天进行一次，优选同时进行细胞形态观察。关于针对ES细胞的基因导入，可以采用磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、 脂质体转染法、反转录病毒转染法、凝集法、显微注射法、基因枪法等方 法，但因其可简便地对多个细胞进行处理而优选电穿孔法。对所获得的重组ES细胞进行筛选以确定其是否发生了同源重组。即， 首先使用引入新霉素等的药物抗性因子进行筛选。药物抗性基因包括例如 新霉素抗性基因、潮霉素B磷酸转移酶基因、白喉毒素A基因等；报道基 因包括例如J3-半乳糖苷酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因等。进一步，对于获得的重组ES细胞，可以用位于Sl-5基因上或其附近 的DNA序列为探针进行Southern印迹分析，或者以基因打靶载体上的DNA 序列，以及在基因打靶载体上使用的小鼠来源的Sl-5基因以外的邻近区域 的DNA序列作为引物进行PCR法，来筛选是否确实发生了同源重组。通过上述测定，可以选择出存在于染色体上的野生型Sl-5基因与导入 的Sl-5基因片段间正确地发生同源重组、从而使突变转移至染色体Sl-5基 因的细胞。将已确认发生导入基因整合的ES细胞返回到同种非人哺乳动物来源的 胚内，可整合至宿主胚的细胞团中形成嵌合胚。将ES细胞导入胚泡等胚中 的方法已知有显微注射法、凝集法等，但无论采用何种方法均是可以的， 本领域技术人员可进行适当的修改。当使用小鼠时，首先采用激素剂(例如，使用具有促卵泡激素(FSH) 样作用的孕马血清促性腺激素(PMSG)或具有黄体生成素(LH)样作用的人绒 毛膜促性腺激素(hCG))对雌性小鼠实施过排卵处理，然后使之与雄性小鼠 交配。此后，如使用胚泡，在自受精始的第3.5天、如使用8细胞期胚则在 第2.5天，分别由子宫回收早期发育胚。在体外将利用基因打靶载体进行了同源重组的ES细胞注射到如此回收的胚中，制成嵌合胚。或者摘除小鼠二曰胚(8细胞期胚)的透明带，然后与ES细胞一起培养使之形成细胞团。 该细胞团经一 日培养后形成胚泡。将该胚泡移植入代孕母亲体内使之发育 生长，获得嵌合小鼠。作为代孕母亲的假孕雌小鼠，可以采用使处于正常 性周期的雌小鼠与通过输精管结扎等方式去势的雄小鼠交配的方式获得。针对上述假孕雌小鼠，将按上述方法制备的嵌合胚移植入其子宫内，使之 受孕并生产，可以制备嵌合小鼠。为嵌合胚能够切实地着床和妊娠，优选 釆集受精卵的雌小鼠与作为代孕母亲的假孕小鼠来自于处于同一性周期的 雌小鼠群。接下来从代孕母亲产下的幼仔中筛选嵌合小鼠。如果得到的小鼠个体 来源于ES细胞移植胚，则使这些嵌合小鼠与野生型小鼠交配，然后验证第 二代个体是否表现出来源于ES细胞的性状。当第二代个体表现出ES细胞 来源的性状时，可认为存在ES细胞已经导入嵌合小鼠种系(germ-line)的 可能性。验证ES细胞已经导入种系可采用许多性状作为指标，从验证容易 的角度考虑，优选以毛色为指标。已知小鼠的毛色可以是野鼠灰色(刺豚 鼠色)、黑色、土黄色、巧克力色和白色等。此外，也可以从小鼠身体的 某部位(例如尾尖)提取染色体DNA，然后通过Southern印迹分析或PCR 方法进行选择。嵌合的贡献率高的小鼠，ES细胞导入嵌合小鼠种系的可能 性高。按上述方法选出嵌合小鼠后，使该嵌合小鼠与野生型雌小鼠交配， 获得F1，从而建立突变小鼠系统。按上述方法获得的嵌合动物，是作为仅同源染色体中的 一条存在基因 缺失的杂合子获得的。为了获得两条同源染色体上均存在Sl-5基因缺失的 纯合子基因敲除动物，可以让Fl动物中仅同源染色体中的一条存在Sl-5 基因缺失的杂合子间互相杂交。通过从组织中提取染色体DNA然后进行Southern印迹分析或PCR方 法的方式来确认获得了基因敲除动物。此外，可以观察解剖时各组织、器 官的异常。进一步，还由组织中提取RNA，通过Northern印迹分析来解析 基因的表达模式。更进一步，必要时可以采血，然后实施血液检查或血清 生化检查。这里，制备的纯合子基因敲除动物可能发生胚胎致死或不能发育成为 成熟个体，从而不适于作为模型动物的情况。这种情况下，优选在必要的时期进行基因敲除。此外，为了研究生物体内某特定组织中基因的功能， 优选组织特异性地进行基因敲除。将此类只在特定时期、特定的细胞系中 进行基因敲除的动物，以及仅在体细胞的限定区域进行基因敲除的动物，称为条件性敲除动物(生物手册系列丛书8，基因打靶利用ES细胞制备 变异小鼠，相沢慎一著，羊土社，1995 )。关于条件性基因敲除动物的制备方法，例如可在基因打靶方法中使用 细菌噬菌体P1来源的重组系统即Cre-loxP系统(R.Kuhn. d a/., Science 269: 1427-1429,1995)。 Cre是一种重组酶，它识别称作loxP的34碱基序列，并 使得该位点上发生重组成为可能。因而，通过将欲基因打靶的基因置于两 loxP序列之间，并将Cre重组酶基因整合至特异启动子的下游，可以位点 特异性地且时期特异性地产生Cre，切除夹在loxP之间的基因(即在特定 的位点和时期使目的基因丧失功能)。在本发明中，使用Cre-loxP系统设 计基因打靶载体时，对于造成Sl-5基因结构变化的位点没有特别的限定， 只要Sl-5基因缺损即可。然而，考虑到Sl-5基因的功能及结构，特别优选 设计使得Sl-5基因的EGF样域或血纤蛋白样域的区域发生缺失。3. 从非人基因敲除动物分离的细胞本发明还提供从本发明的基因敲除动物分离的细胞。如后述，从本发 明的基因敲除动物分离的细胞可用于筛选老化性疾患或症状的预防或治疗 药物。作为上述的细胞，例如可以是破骨细胞、角质化上皮细胞、血液细胞、 癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神 经细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、 色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞，但不仅限于此。上述细胞可以通过本领域技术人员公知的方法从该基因敲除动物分离。4. 老化性疾患本发明的非人基因敲除动物呈现老化性疾患或症状。已知的老化模型 小鼠有Klotho突变小鼠(Kuro画o, M.等人,Nature, 6; 390(6655):18 19， 1997 )、 加速老化模型小鼠(SAM) (Takeda， T.等人，Mech Ageing Dev., 17(2)， 183-184， 1981)、韦尔纳综合征(Werner Syndrome)模型小鼠，但上述小 鼠呈现早老，而且寿命很短。本发明的非人基因敲除动物(例如Sl-5基因敲除小鼠)的一个特点是与野生型小鼠相比寿命无变化，且可见多种老化 性疾患或症状的严重化。本发明中，"老化性疾病或症状"是指例如骨变形、骨质疏松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症(hyperparathyroidism)、骨密 度低下、骨皮质海绵化(海綿骨化)、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸 部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化(例如斑点、无光、松弛、细紋、 黑痣等，但不限于此)及指曱的老化等，并表示上述疾病或症状可以单独 或共同出现。这里，"骨变形"是指由老化、RA、骨质疏松症引起的骨软骨强度下降、 骨及软骨变形。"骨质疏松症"是指骨成分整体减少，易骨折的状态。90%以 上的骨质疏松症是未发现明确病因的原发性骨质疏松症，而几乎全部的原 发性骨质疏松症都是发生于中老年时期的退行性疾病。与此相区别的是继 发性骨质疏木》症，其发病原因可以是巴泽多病(Basedow's disease)、库欣 综合征(Cushing，s syndrome)、重症糖尿病、RA、胃部手术、饮酒过量、 服用类固醇药物等。"骨佩吉特病，，是指以骨代谢周转增加和骨改建紊乱为特征的骨疾病ch061a,html)。已知在骨佩吉特病中，在骨的部分区域中破骨细胞和成骨 细胞过度活化，发生骨吸收和骨改建，发生过度活化部分的骨与正常骨相 比变脆。"曱状旁腺功能亢进症"是指曱状旁腺激素PTH的分泌亢进、其作用 异常增强的状态。已知在曱状旁腺功能亢进症中发生骨量减少、破骨细胞 活化等。"曱状旁腺功能亢进症，，包括腺瘤等引起曱状腺PTH分泌亢进的 原发性曱状旁腺功能亢进症，以及由慢性肾衰竭、妊娠等其他原因引起曱 状旁腺功能继发性亢进的继发性曱状旁腺功能亢进症，但不限于此。"肿瘤"是指全部肿瘤发生细胞的生长和增殖以及全部的癌前及癌性细 胞和组织，不论其为恶性或良性。本发明的肿瘤可以是原发性肺瘤，也可 以是转移性肿瘤。术语"癌"及"癌性"，典型地是指以无法控制的细胞生长为 特征的生理学状态，本发明中，"肿瘤"的实例包括癌、肉瘤、白血病及恶性 淋巴瘤。本发明中，癌包括例如乳腺癌、前列腺癌、大肠癌(大腸癌)、 鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰癌、胶质母细 胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌(産卵口癌)、曱状腺癌、肝癌及各 种头部和颈部癌。本发明中，肉瘤包括例如恶性骨瘤和恶性软组织肉瘤，具体地说包括骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏(Ewing，s)肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤及滑膜肉瘤等。5.老化性疾患治疗药物或预防药物的筛选本发明提供老化性疾病或症状的治疗药物或预防药物的筛选方法，其 特征是对非人基因敲除动物给予候选物质。该筛选方法是从老化性疾患或症状预防或治疗药物的候选物质中选择 出具有与基因敲除动物表现型互补的活性的物质。与基因敲除动物的表现 型互补并非仅指完全互补，还包括非完全互补。具体地讲，首先使候选物质与本发明的基因敲除动物或其部分相接触， 然后测定接触了前述候选物质的非人动物或其部分中与目标疾病具有相关 关系的指标值，并与对照相比较，基于该比较结果评价候选物对感兴趣的 老化性疾患的效果。例如，可以用骨密度上升、骨强度上升、破骨细胞功 能抑制、抗肿瘤效果、血细胞等增加、止血能力提高等为指标，测试候选 物的预防、治疗、改善效果。此外，也可在发生皮肤老化(斑点、无光、 松弛、细紋、黑痣等)的动物上进行试验，以筛选具有美白及抗老化效果 的化妆品。"基因敲除动物或其部分"包括动物个体全身及限定的组织或器官两方 面含义。当指限定的组织或器官时，包括已从动物体内取出的组织或器官。候选物质可以包括例如肽、蛋白质、非肽类化合物、合成化合物、发 酵产物、细胞抽提液、植物抽提液、动物组织抽提液、血浆等，上述化合 物可以是新化合物，也可以是公知的化合物。上述候选物质可以成盐，作 为候选物质的盐类，可以使用候选物质与生理上允许的酸(例如无机酸等)、 碱(例如有机酸等)等成的盐，特别优选与生理上允许的酸加成盐。作为 这样的盐，例如可以使用与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等) 或有才几酸(例如醋酸、曱酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、 柠檬酸、苹果酸、草酸、苯曱酸、曱磺酸、苯磺酸等)等成的盐。作为以候选物质处理实验动物的方法，例如可以采用口服、静脉注射、 涂抹、皮下给药、皮内给药、腹腔给药等，可结合试验动物的症状、候选 物的性质等加以适合地选择。此外，候选物质的给药量，可结合给药方法、候选物质的性质等加以合适地选择。例如，筛选预防、治疗、改善骨质疏松症的药物时，可以对本发明的 基因敲除动物等给予候选物质，然后通过随时间测定该动物的骨密度值、 骨强度值、X光照片等，筛选出显示有效性的物质。特别是根据本发明基 因敲除动物中骨质疏松症与脊柱后凸具有相关性，从而提示基因敲除动物 中后凸的程度可以作为测量骨质疏松症进展程度的一项指标。从上述事实 来看，对本发明的基因敲除动物给予候选物，并随时间利用X光照片等测 定该动物脊柱后凸的程度，即可非侵入性地、高效地判断候选物质是否显 示出对于骨质疏松症的有效性。此外，使用从本发明的基因敲除动物分离的细胞，可以进行老化性疾 患或症状的预防或治疗药物的筛选。具体地说，这里提供了老化性疾患或 症状的预防或治疗药物的筛选方法，包含使预防或治疗老化性疾患或症状 的药物的候选物质与从本发明的基因敲除动物分离的细胞相接触的步骤。本发明中的"接触"，例如可以通过向从本发明的基因敲除动物分离的细 胞的培养液中添加该候选物质的方式进行。此外，当该候选物质是蛋白质时，例如可以通过将含有编码该蛋白的DNA的载体导入/人基因敲除动物分 离的细胞的方式进行。本发明中，从预防或治疗老化性疾患或症状的药物的候选物质中，选 择具有与从基因敲除动物分离的细胞的表现型互补的活性的物质。关于与 由基因敲除动物分离的细胞的表现型互补的活性，没有特别的限定，例如 对于破骨细胞而言是破骨细胞活性的抑制、对于骨髓细胞而言是破骨细胞 形成的抑制，对于角质化上皮细胞而言是角质化上皮细胞的增殖、对于血 细胞而言是血细胞分化的促进、对于癌细胞而言是癌细胞增殖的抑制、对 于成纤维细胞而言是成纤维细胞的增殖、对于血管内皮细胞是血管内皮细 胞的增殖、对于真皮细胞而言是毛发形成、对于肌细胞而言是肌细胞变性 的矫正、对于神经细胞而言是神经细胞变性的矫正、对于淋巴细胞而言是 淋巴细胞活化的抑制、对于血管平滑肌细胞而言是增殖的抑制、对于滑膜 细胞而言是功能正常化、对于毛乳头细胞而言是毛发生长、对于肝细胞而 言是功能正常化、对于色素细胞而言可以是黑色素产生抑制、对肺泡细胞 而言是活化异常的矫正、对于脂肪细胞而言是分化增殖的抑制、对于子宫 内皮细胞而言是内皮细胞增殖的抑制等。此外，与该细胞表现型互补并非仅指完全互补，还包括非完全互补的情况。6. 破骨细胞功能抑制剂的筛选本发明还提供破骨细胞功能抑制剂的筛选方法，其包括使破骨细胞功 能抑制剂候选物质与从基因敲除动物分离的细胞相接触的步骤。"破骨细胞功能"包括例如吸收陷窝形成、TRAP产生功能、肌动蛋白环(7夕千乂 U 乂 夕，形成功能、蛋白酶(组织蛋白酶K, MMP-9)产生功能、酸分泌功能，但 并不仅限于此，只要所述功能直接或间接引起骨破坏，均在所述的"破骨细 胞功能"之列。破骨细胞功能抑制剂可以例如用从本发明的基因敲除动物分离的破骨 细胞的形成数多少、大小等为指标进行筛选，但并不仅限于此方法，例如 可如实施例所述，使从本发明的基因敲除动物分离的骨髓细胞分化为多核 巨细胞，然后以TRAP阳性多核巨细胞的数量和TRAP阳性多核巨细胞的 大小等为指标进行筛选(Takahashi N.等人，Endocrinology, 123(5):2660-2， 1988、 Yasuda H.等人,Proc Natl Acad Sci U S A" 31 ;95(7)， 3597-602， 1998 )。此外，破骨细胞功能抑制剂可以将吸收陷窝形成功能作为指标进行筛 选(Hirayama, T. d a/" J. Endocrinol.: Octl75(l): 155-63 2002; Udagawa, N." a/., Bone.: Nov;25(5):517-23 1999)。通过上述方法选出的物质，可作为破骨细胞功能抑制剂应用于研究领 域或医药领域。此外，本发明的破骨细胞功能抑制剂可作为老化性疾患或 症状的预防或治疗药物加以应用。此外，如果对RA患者的骨质破坏部分中增殖的滑膜向骨内侵入的最前 沿进行病理学检查，可以观察到许多多核巨细胞。已经清楚这种细胞为 TRAP阳性，即满足作为破骨细胞的表现型，可以推断在RA骨质破坏中破 骨细胞起非常重要的作用(Urushibara, M. d a/., Arthritis Rheum. Mar;50(3):794-804, 2004; Takayanagi, H. d a/, Biochem. Biophys. Res. Commun. Nov 17;240(2):279-86， 1997)。因此，本发明的破骨细胞功能抑制 剂也可作为RA的预防或治疗药物加以利用。7. 分离的Sl-5蛋白本发明提供l)由包含SEQ ID NO: 1或3所述石威基序列的编码区的DNA 编码的、分离的Sl-5蛋白，以及2)包含SEQIDNO: 2或4所述氨基酸序 列的、分离的Sl-5蛋白。这里，"分离"是指已从天然环境中取出的状态。上述蛋白例如也可以重组体的形式制备。例如，对人Sl-5蛋白而言，可以从表达人Sl-5蛋白的细胞(例如，人二倍体成纤维细胞(human diploid fibroblast)、作为滑膜组织或培养细胞回收的RA患者来源的滑膜细胞)提 取mRNA,以该mRNA为基础获得cDNA文库(Short, J. M.等人，Nucleic Acid Research, 16， 7583,1988 )。然后，使用基于SEQ ID NO:l所示碱基序列而 设计的探针从该文库中篩选杂交克隆，可以分离得到编码S1 -5蛋白的DNA。 利用本领域技术人员公知的蛋白表达系统可以获得由该DNA编码的Sl-5 蛋白。此外，可以从表达人Sl-5蛋白的细胞的培养物中回收、纯化人Sl-5 蛋白。此外，本发明还提供在功能上与上述Sl-5蛋白等同的蛋白质。这样的 蛋白质所来源的生物物种没有特别的限定，例如可以列举出人、斑马鱼、 小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、山羊、绵羊、犬、牛、猴及黑猩猩等。在功能上与上述Sl-5蛋白等同的蛋白质包括例如1)包含在SEQ ID NO: 2或4所述氨基S臾序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入和/ 或添加的氨基酸序列的、在功能上与包含SEQIDNO: 2或4所述氨基酸序 列的蛋白质等同的分离的蛋白质，及2)由可在严紧条件下与包含SEQ ID NO: 1或3所述碱基序列的DNA杂交的DNA编码的、在功能上与包含 SEQ ID NO: 2或4所述氨基S吏序列的蛋白质等同的分离的蛋白质。上述在功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白质可包括例如具有抑制人老化性 疾患或症状的功能的蛋白质、具有与本发明的基因敲除动物或由本发明的 基因敲除动物分离的细胞的表现型互补的功能的蛋白。此外，上述在功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白质可包括例如免疫学上等 同的蛋白质。本发明的"在免疫学上与Sl-5蛋白等同的蛋白质，，，只要可以 与特异性识别Sl-5蛋白的抗体反应，没有特别的限定。例如，作为在免疫 学上与Sl-5等同的蛋白，可以包括Sl-5蛋白的表位肽、含有该表位的Sl-5 蛋白域、或含有该域的蛋白。Sl-5蛋白的片段可通过蛋白酶消化获得。此外，也可通过随机切断SEQ ID NO: 1或3所示的编码Sl-5蛋白的DNA、将其插入噬菌体载体，然后 制成展示域肽(domainpeptide)的噬菌体文库而获得。以识别Sl-5蛋白的 抗体对这些文库进行免疫篩选，可以确定免疫学活性结构域。对克隆的噬 菌体而言，在测定插入片段的碱基序列后，即可明确活性域的氨基酸序列。除免疫学特性之外，根据本发明的在功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白质， 也可基于与滑膜素的结合特性进行定义。即，本发明包含具有滑膜素亲和性的Sl-5蛋白的片段。通过用滑膜素对候选蛋白质进行筛选，本领域技术 人员可以很容易地选择出这样的变异体。例如，Sl-5蛋白需要对应于滑膜 素cDNA上1233-1592位碱基的120个氨基酸作为与滑膜素结合的必要区 域。因此，可与由构成该区域的氨基酸序列组成的蛋白质、或与包含该氨 基酸序列的蛋白质相结合的蛋白质，均构成根据本发明的在功能上与Sl-5 蛋白等同的蛋白质。并且，根据本发明的在功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白质，也可以基于 Sl-5蛋白具有的生化活性进行定义。Sl-5蛋白的生化活性包括例如破骨细 胞形成抑制活性和细胞增殖调控活性(Leucka-Czernik, B. " a/.， Mol. Cell. Biol. 15: 120-128, 1995)。可以使上述在功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白质与其它蛋白质形成融合 蛋白。例如，添加有FLAG标签、HA标签或组氨酸(His)标签、谷胱甘肽S 转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签等附加氨基酸序列的、并保 持上述的作为功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白的至少一种性状的蛋白质，均 包含于上述功能上等同的蛋白质之列。当添加的蛋白质具有异于Sl-5蛋白 的活性时，如果可以保持Sl-5蛋白所具有的至少一种功能，则该融合蛋白 也包含于本发明的功能上等同的蛋白之列。上述在功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白，可由本领域技术人员采用公知 的方法(实验医学分册.基因工程手册，pp246-251、羊土社、1991年发行) 进行分离。例如，如果以关注的文库为对象，以SEQIDNO: 1或3所示的 碱基序列(或其片段)为探针进行筛选，则可以克隆具有高同源性碱基序 列的DNA。这样的文库可以包括例如针对SEQ ID NO: 1或3的碱基序列 引入随机突变的文库、来源于人或人以外的物种的滑膜组织cDNA文库等。作为针对给定的碱基序列引入随机突变的方法，例如通过DNA的亚硝 酸处理引起碱基对替换的方法已为人所熟知(Hirose, S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79: 7258-7260， 1982 )。在该方法中，通过以亚硝酸处理需 引入突变的片段，可在特定片段内随机引入碱基对替换。此外，可在任意 位置引入目标突变的技术有缺口双链体(gapped duplex)方法等(Keamer, W. W a/., Methods in Enzymol. 154: 350-367， 1987)。将克隆有需引入突变的基因的环状双链载体变成单链，使之与在目标位点携带突变的合成寡核苷酸进行杂交。使来源于经限制性酶切割而线性化的载体的互补单链DNA与前述 环状单链载体退火，使用DNA聚合酶填补其与前述合成核苷酸之间的缺口 ， 进而通过连接可以形成完整的双链环状载体。发生修饰的氨基酸的个数，典型地应该在50个氨基酸以内，优选30 个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内(例如1个氨基酸)。一般认为在人为地替换氨基酸时，如果替换成性质相近的氨基酸，则 比较易于维持原蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括在上述氨基酸替换中 发生了保守替换的、在功能上与人Sl-5蛋白(SEQIDNO: 2或4)等同的 蛋白。在替换对蛋白质活性重要的结构域的氨基酸等场合，保守替换被认 为是十分重要的。这种氨基酸的保守替换已为本领域技术人员所熟知。作为相当于保守替换的氨基酸组群，包括例如碱性氨基酸(例如赖氨 酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电 的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、(3支链氨基酸(例如苏氨 酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸、组氨酸)等。此外，非保守替换可导致蛋白质活性等的进一步提高(例如包括组成 性活化型蛋白等)或下降(例如包括显性负突变(dominant negative ))。包含在SEQ ID NO: 2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替 换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，并在功能上与包含SEQIDNO: 2 或4所述氨基酸序列的蛋白质等同的蛋白质，包括天然存在的蛋白质。一 般地，真核生物基因中存在多态性(polymorphism)，如已知的干扰素基因 等。由于这种多态性所导致的碱基序列变化，有时会发生一个或数个氨基 酸的替换、缺失、插入和/或添加。这样的天然存在，具有在SEQIDNO: 2 或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸替换、缺失、插入和/或添加 的氨基酸序列，且在功能上与包含SEQIDNO: 2或4所述氨基S吏序列的蛋 白质等同的蛋白质，为本发明所涵盖。或者，在有些情况下，虽然多态性引起碱基序列的变化，但氨基酸序 列并未发生改变。这样的碱基序列突变称为沉默突变。包含具有沉默突变的碱基序列的DNA所编码的蛋白也包含在本发明中。而且，这里所说的多 态性是指在群体内某基因具有在个体之间不同的碱基序列。多态性与不同 基因出现的比例无关。此外，获取功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白的方法，可以列举利用杂交 的方法。即，以SEQIDNO: 1或3所示的编码本发明的Sl-5蛋白的DNA、 或其片段为探针，分离出可与之杂交的DNA。如果杂交是在严紧条件下进 行的，那么可以选择出碱基序列同源性高的DNA，而作为其结果，在所分 离的蛋白中包含功能上与Sl-5蛋白等同的蛋白的可能性也高。同源性高的 碱基序列，例如是指表现70%以上、优选90%以上的同一性。并且，严紧条件具体地例如在6xSSC、 40%曱酰胺、25。C杂交，以及在 lxSSC、 55。C洗涤的条件。严紧度受盐浓度、甲酰胺浓度或温度等条件的影利用杂交，例如可以分离出人以外的动物物种中编码Sl-5蛋白同源物 (homolog)的DNA。可从人以外的动物物种即斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、 兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩等动物物种获得的DNA所 编码的Sl-5蛋白同源物，构成本发明的在功能上等同的蛋白。上述的在Sl-5蛋白(SEQIDNO: 2或4)中引入突变而得的蛋白质及 由利用如上所述的杂交技术分离的DNA编码的蛋白质，通常在氨基酸序列 上与Sl-5蛋白(SEQ ID NO: 2或4 )具有高同源性。高同源性是指至少30%、 优选至少50%、更优选至少80% (例如至少95%)的序列同一性。碱基序 列或氨基酸序列的同一性，可通过利用因特网的同源性检索网站确定[例如 在日本数据4艮行(DDBJ)中可利用FASTA、 BLAST、 PSI-BLAST及 SSEARCH等同源性检索(例如日本数据银行网站(DDBJ)的同源性检索 ( Search and Analysis ) 网 页 http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html) ]。 jt匕夕卜,在National Center for Biotechnology Information (NCBI)中可使用BLAST进行4企索[例如NCBI 主页网站的BLAST网页http:〃www.ncbi.nlm,nih,gov/BLAST/; Altschul, S. F. 等人，J. Mol. Biol. 215(3):403-10， 1990; Altschul， S. F. W a/" Meth. Enzymol. 266:460-480， 1996; Altschul, S. F.等人，Nucleic Acids. Res. 25:3389-3402, 1997]。例如，Advanced BLAST 2.1中的氨基酸序列同源性计算，程序使用blastp、期望(Expect)值设定为10、滤镜(Filter)设定为全关闭(OFF)、 矩阵(Matrix)使用BLOSUM62、缺口存在损失(Gap existence cost)、每 歹戋基在夹o对员失(Per residue gap cost)禾口 X t匕(Lambda ratio )分另"i殳定为11 、 1和0.85 (默认值)进行检索，可以获得同 一性(identity)的值(％ ) (Karlin, S. & a/" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 1990; Karlin, S. d g/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7 1993)。根据本发明的蛋白质，以及在功能上与之等同的蛋白质，可以是施加 了糖链等生理性修饰、荧光或放射性物质标记或者与其它蛋白融合等各种 修饰的蛋白。特别是对于后述的基因重组体而言，由于表达宿主的不同， 糖链修饰可能存在差异。然而，即使蛋白质在糖链修饰方面有所差异，只 要其显示出与本说明书中公开的Sl-5蛋白相同的性状，均为根据本发明的 Sl-5蛋白或在功能上等同的蛋白质。Sl-5蛋白不仅可从生物材料中获得，还可将编码该蛋白质的基因导入 适当的表达系统以基因重组体(recombinant)的形式获得。为了通过基因 工程方法获得Sl-5蛋白，可将前述的编码Sl-5蛋白的DNA整合入适当的 表达系统并使之表达。作为可应用于本发明的宿主/载体系统，包括例如表 达载体pGEX与大肠杆菌(^c/zehc/z/a co//) 。 pGEX可以与GST形成融合 蛋白的形式表达外源基因(Sm他DB，d"/., Gene, 67:31-40, 1988)，因此采用 热冲击方法将引入了 Sl-5蛋白编码基因的pGEX导入BL21等大肠杆菌菌 株，在经过适当的培养时间后，添加异丙基硫代P-D-半乳糖苷(IPTG)可诱 导GST融合的Sl-5蛋白的表达。Sl-5蛋白的编码基因可以用滑膜细胞 cDNA文库等作为模板通过PCR等方法扩增获得。根据本发明的GST可吸 附于谷胱甘肽-Sepharose 4B,因此通过亲和层析可以4艮容易地对表达产物 进行分离和纯化。作为用于获取S1 -5蛋白基因重组体的宿主/载体系统，除上述之外也可 使用下述产品。首先，当采用细菌为宿主时，有许多商品化的携带组氨酸 标签、HA标签、FLAG标签、GST标签、MBP标签等的融合蛋白表达载 体可供选择。在酵母方面，毕赤氏酵母属(尸/c/n'a)酵母可有效表达具有糖 链的蛋白已是公知的事实。在添加糖基方面，利用以昆虫细胞为宿主的杆 状病毒载体的表达系统也是十分有效的(Bio/Technology，6:47-55, l988)。 进一步，利用哺乳动物细胞，可进行携带CMV、 RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体系统均可作为Sl-5蛋白的表达系统加以应用。 此外，也可利用反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体 (adeno-associated virus )等病毒载体进4亍基因导入。所获得的本发明的蛋白质，可从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分 离，并被纯化为基本上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化可采用一 般蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法，而无任何的限制。例如可适当地 选择、组合层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂抽提、蒸馏、免 疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等方法 进行蛋白质的分离和纯化。层析法包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反 相层片斤、吸附层冲斤等(Marshak等人，Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。上述层析可采用液相层析，例如HPLC、 FPLC等液相层析进行。本发明的蛋白质的表达，优选使用无细胞系统以外的表达系统。此外， 本发明的蛋白优选具有生理的高级结构、糖基化、二硫键连接、脂质化、 曱基化等修饰。本发明的糖链包括例如N连接型糖链、O连接型糖链等。 此外，N连接型糖链可以列举出包括高甘露糖型、混合型(混成型)、复 合型在内的N连接型糖链，O连接型糖链可以列举出包括粘蛋白 (O-AglNAc)型、O-Fuc型、O-Man型和O-Glc型在内的O连接型糖链。此外，本发明的蛋白质优选基本上纯化的蛋白质。这里，"基本上纯化" 是指本发明的蛋白质的纯化度(总蛋白质成分中本发明的蛋白质占的比例) 为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、 100% 或接近100%。纯化度接近100%的上限取决于本领域技术人员的纯化技术 和分析技术，例如可以为99.999%、 99.99%、 99.9%、 99%等。并且，只要是具备上述纯化度的蛋白质，无论其采用何种纯化方法纯 化，均包含于基本上纯化的蛋白质之列。例如通过适当选择或组合上述的 层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂抽提、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等方法而得以基本上 纯化的蛋白质，但不仅限于此。此外，本发明还提供上述本发明的蛋白质的部分肽(部分片段)。该部分肽只要在功能上与本发明的蛋白等同，其长度没有特别限定。本发明的部分多肽可包括例如包含SEQIDNO: 6所记载的氨基酸序列的、比本发 明的蛋白短的肽。利用这种肽，可进行老化性疾患或症状的预防或治疗， 还可以抑制破骨细胞的活性。8、 药物本发明提供含有本发明的蛋白质或其部分肽(以下简称蛋白质等)的 预防或治疗老化性疾患或症状的药物。"老化性疾患或症状"如上所述。进而， 本发明提供含有本发明的蛋白质等的破骨细胞功能抑制剂。这些药物中的 蛋白，只要是分离的，对于其状态没有特别的限定；而只要可作为上述药 物使用，既可使用基本上纯化的蛋白质等，也可以使用处于粗纯化状态的 蛋白质等。此外，药物中的蛋白等优选在无细胞系统之外的表达系统中进 行生产。这些药物可作为人或人以外的动物(例如实验动物、畜养动物、宠物 动物等)的老化性疾病或症状的预防或治疗药物使用，也可作为破骨细胞 功能抑制剂使用。本发明的蛋白可与药学上可接受的载体或介质，例如灭菌水或生理盐 水、稳定剂、赋形剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘合剂 等适当组合构成制剂并进行给药。本发明的药物的形态(剂型)，可以包括例如注射剂、冻干剂、溶液 剂等，但不仅限于此。针对患者的给药方式可以是口服或非口服给药，优选非口服给药，例 如可以是注射给药。作为注射给药的例子可以是通过静脉内注射、肌肉内 注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射等方式进行全身或是局部给药。给药量可根据患者的体重和年龄、给药方法、症状等变化，本领域技 术人员可以适当地选择合适的给药量。 一般的给药量因药物的有效血中浓 度、代谢时间而异，1日的维持量为约O.l mg/kg 约1.0 g/kg，优选约O.l mg/kg~约10 mg/kg，更优选约0.1 mg/kg~约1.0 mg/kg。给药可以分为一 次或多次进^f亍。9. 抗体本发明提供识别Sl-5蛋白等的抗体。以本发明的Sl-5蛋白或其片段为 免疫原，采用公知的方法可以获得Sl-5蛋白等的抗体(Harlow, E.和Lane，D.; Antibodies; A Laboratory manual, Cold Spring Harbor, New York, 1988, Kohler， G.和Milstein， C.， Nature 256:495-7,1975 )。对于免疫，可将本发明的Sl-5蛋白或其片段与合适的佐剂一起针对免 疫动物进行免疫。也可将Sl-5蛋白的片段与载体蛋白相结合构成免疫原。 用于获得免疫原的载体蛋白，可以使用钥孔血蓝蛋白(Keyho limethemocy肌in， KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等。免疫动物一般可以利用兔、小鼠、大鼠、山羊或绵羊等。作为佐剂， 一般可以使用弗氏完全佐剂(FCA)等(Freund, J., Adv. Tubercl. Res.， 1:130-148，1956)。以适当的时间间隔进行追加免疫，在确认抗体效i"介提高后 采血，从而获得抗血清。进一步，纯化抗体级分，可制成纯化抗体(多克 隆抗体)。此外，釆集抗体产生细胞，通过细胞融合等方法进行克隆，也可获得 单克隆抗体。单克隆抗体是在免疫测定中实现高灵敏度和高特异性的重要 工具。此外，作为其它方法，通过随机切断编码滑膜素的DNA，并将其插 入噬菌体载体，制成展示域肽的噬菌体文库，也可以获得识别Sl-5蛋白等 的抗体。以识别滑膜素的抗体对上述文库进行免疫筛选，可确定具有免疫 学活性的域。作为抗体产生细胞，也可利用免疫动物来源的细胞。进一步，以这样获得的免疫动物来源的单克隆抗体产生细胞的抗体基因为基础，可以构建 嵌合抗体或人源化抗体。当对人类给予抗体时，动物抗体将作为异物而被排斥，因此是不优选的。因此，必须使用抗原性强的抗体恒定区被替换为 人类抗体的嵌合抗体，或者不仅是恒定区、甚至可变区骨架也被替换为人 类基因的人源化抗体。识别基于本发明而提供的Sl-5蛋白等的嵌合抗体或人源化抗体对于药 物送递系统(Drug Delivery System, DDS )而言是用的。在使用识别本发明 的Sl-5蛋白的抗体的DDS中，抗体连接后可能有用的物质包括例如抑制破 骨细胞功能的物质(双磷酸酯、护骨蛋白)等。此外，本发明的抗体可以用作Sl-5蛋白等的免疫学检测试剂。利用抗 体对存在于组织、血液中的蛋白质进行免疫学检测等的方法是公知的。此外，本发明的抗体可以用于S1 -5蛋白等或表达S1 -5蛋白等的细胞的 分离或检测。利用抗体进行蛋白质等的分离纯化的方法是本领域技术人员所公知的。此外，本发明的Sl-5蛋白等可用作滑膜细胞、人二倍体成纤维 细胞的标记。即以Sl-5蛋白等的表达为指标，可进行滑膜细胞、人二倍体 成纤维细胞的^r测与分离。抗体可通过适当的荧光等进行标记。例如，可 使用针对Sl-5蛋白等的抗体，采用细胞分选等方式分离出表达Sl-5蛋白等 的细月包。书中。 、 、 、、 、以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明。但本发明并不仅限于 这些实施例。实施例1Sl-5基因的克隆及基因打靶载体的制备使用RA患者滑膜细胞来源的cDNA表达文库筛选结合滑膜素的因子 (竹绳忠臣、渡边俊树编，生物手册UP系列"蛋白质分子间相互作用实验 方法,，.pp.66 - 67、羊土社；Kaelin， W.G.等人，Cell 70, 351-364,1992; Skolnik， E.Y.等人，Cell 65, 83-90, 1991; Sambrook, J.等人，Molecular Cloning, a laboratory manual.第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press 12.16-12.20,1989)。 37。C温育20min以使文库噬菌体侵染大肠杆菌(XLl-BlueMRF，)，然后使培养物与顶层琼脂糖混合后涂布于平板上。42。C培养 3.5小时后，将10mM IPTG浸泡后干燥的硝酸纤维素膜覆盖在平板上，再 于37。C培养3.5小时。回收膜后，用清洗緩冲液[10mM Tris-HCl (pH8.0)， 0.5%脱脂乳，0.1% TritonX-100, 150mM NaCl, ImM EDTA， 5mM MgCl2, ImMDTT,蛋白酶抑制剂(完全，Boehringer Mannheim公司)]清洗5次，每 次5分钟，然后于封闭緩沖液[10mM Tris-HCl (pH8.0)， 5%脱脂乳，0.1% TritonX-100, 150mMNaCl， ImM EDTA, 5mMMgCl2， ImMDTT, 5%甘油，蛋 白酶抑制剂(完全，BoehringerMannheim公司)]中浸泡1小时。用清洗緩沖 液清洗5次,每次5分钟，然后加入作为探针的、用蛋白激酶A进行了 32P 标记的GST-滑膜素(约106cpm/ml)，温育。更换清洗液反复清洗，直至 一张薄膜的放射计数约为lkcpm，通过放射自显影检测信号。结果表明获 得了与滑膜素结合的克隆。针对该cDNA，测定了其5，末端附近100bp及3， 末端附近100bp的碱基序列。基于所获得的碱基序列信息进行数据库检索，发现末端部分lOObp的范围内是与称作Sl-5 (也称作EFEMP-1、 FBNL或 FBLN隱3 ) [ Lecka画Czernik， B， *入，Molecular and Cellular Biology, 15,120-128, 1995;登录号U03877(cDNA)， AAA65590(蛋白质)，Stone, E.M. 等人，Nature Genetics 22, 199-202， 1999;登录号Q12805(蛋白质)]的公知基 因的共有序列。两者的基因及翻译产物的大小几乎相同，这暗示它们可能 为同一种蛋白。本发明中，人Sl-5的cDNA序列及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO: l和2。向小鼠Sl-5基因片段的翻译起始位点(翻译成第 一个甲硫氨酸的ATG 密码子)中导入LacZ基因，构建基因打靶载体(图1)。导入新霉素抗性基 因作为标记基因，同时连接白喉毒素A (DT-A)基因，从而可以排除发生 非同源重组的细胞抹。本发明中，小鼠Sl-5的cDNA序列、氨基酸序列及 基因组序列分别示于SEQIDNO: 3、 4和5。实施例2Sl-5基因敲除小鼠的制备采用电穿孔法将实施例1的基因打靶载体导入小鼠TT-2细胞株，并选 出发生同源重组的细胞抹。将所获细胞注射入8细胞期胚内，然后直接移 植入代孕母亲的输卵管，也可经培养一日发育成胚泡后移植入代孕母亲的 子宫。使所获杂合突变小鼠(Fl)间相互交配，获得杂合和纯合突变小鼠。 在这样获得的突变小鼠中，原本应该表达Sl-5的组织将表达p _半乳糖苷 酶蛋白而不是Sl-5。通过Southern印迹分析确认基因型。从出生后2周龄左右的小鼠尾尖 约3mm处提取DNA,所获DNA以限制性酶BamHI消化，备用。在野生型 中2.4kbp处可检测出条带，在纯合突变小鼠中5.4kbp处可检测出条带，在 杂合突变小鼠中则在以上两个位置均可检测出条带(图2A)。此外，用 Northern印迹分析进行S1 -5基因的肺中mRNA表达的确认，结果未确认该 基因mRNA的表达(图2B)。实施例3Sl-5基因敲除动物的分析对13~117周龄(3~29月龄)的S1-5基因敲除小鼠通过剖检和X光片进行分析。在高龄(8个月~)小鼠中可见脊柱后凸、脱毛、面部皮肤损 伤、指曱坏死、胸部肥大、腹水、肝脏肿瘤、眼底及脂肪组织内的血块和子宫月巴大(图3~6)。 实施例4Sl-5基因敲除小鼠的脊柱后凸分析为将Sl-5基因敲除小鼠的脊柱弯曲程度数值化，使用X光照片测量了 弯曲的角度。结果表明，野生型小鼠中呈95。及95。以下角度的个体很少， 与此相对，Sl-5基因敲除小鼠中呈95。及95。以下角度的个体频繁出现。因 此，将95。及95。以下定义为后凸的发病，并每隔21周龄统计发病率。可知 与雄性相比，雌性的发病频率更高，而且发病时间较早，始于22周龄左右， 并且随年龄增加而加重(图7、 8)。实施例5Sl-5基因敲除小鼠的骨密度测定和显孩t CT分析已确定Sl-5基因敲除小鼠的骨组织中存在异常，因而进行了更为详细 的分析。由野生型小鼠和Sl-5基因敲除小鼠摘取脊推(胸推(10-12)腰推 (1-3))、股骨，用70%乙醇进行固定，然后测定了骨密度。骨密度用 DCS-600EX-IIIR(Aloka)进行测定，切片厚lmm、以10 mm/s的速度扫描， 采用扫描值的平均值。其结果，对于雌性和雄性Sl-5基因敲除小鼠均发现了脊推(胸推(10-12) 腰推(l-3))的骨密度低下。此外，按部位进行测定的结果显示雄性Sl-5基 因敲除小鼠的胸推(10-12)和雌性Sl-5基因敲除小鼠的腰推(l-3)的骨密度尤 为低下(图9、 10)。对于雌性和雄性Sl-5基因敲除小鼠均发现了股骨的骨密度低下。此外， 按部位进行测定的结果显示雄性Sl-5基因敲除小鼠尤其在股骨骨干1/2 处发生骨密度低下，而雌性Sl-5基因敲除小鼠的所有部位均发现了骨密度 低下(图11、 12)。拍摄S1-5基因敲除小鼠和野生型小鼠的显微CT图像，3D构建了胸推 的显微CT图像(图13)，结果发现野生型小鼠的推体表面是光滑的，而与此 相对，在基因敲除小鼠中表面凹凸明显。实施例6Sl-5基因敲除小鼠的pQCT分析进一步，测定了外周定量计算机断层摄影术(peripheral quantitative Computed Tomography) (pQCT),进行了详细分析。结果显示Sl-5基因敲 除小鼠中骨盐量、骨密度下降(图14)。该现象特别是在雌性个体中十分 显著。此外，S1-5基因敲除小鼠中应力-应变系数(stress/strain index, SSI)与 野生型小鼠相比显著减小，且骨强度下降。实施例7已知尿中或血清中的I型胶原交联的N-端肽(Type I collagen cross-linked N-telopeptide， NTx)与骨密度呈负相关，并且反映骨吸收的亢进 (Taguchi Y a/. ， Calcif. Tissue Int. 62; 395-399, 1998)。因而，测定了尿中的 NTx，以研究Sl-5基因敲除小鼠的骨密度低下是否是由骨吸收亢进引起的。 结果表明，在雌性Sl-5基因敲除小鼠中，43周龄以后该值呈高值(图15、 16),这表明Sl-5基因敲除小鼠的骨吸收亢进。实施例8S1 -5基因敲除小鼠股骨的组织学分析摘取Sl-5基因敲除小鼠和野生型小鼠的股骨，然后除去骨周围的软组 织，用70%乙醇进行固定，制作组织标本、硬组织染色标本并进行骨组织 观察。结果，在Sl-5基因敲除小鼠中观察到了骨皮质的海绵化(图17、 18)。 已知一般地，患曱状旁腺功能亢进症则血中PTH上升，其结果导致高的骨 代谢周转，引起骨皮质的海绵化。此外，已知在以骨代谢周转增加和骨改 建紊乱为特征的骨佩吉特病中也可见骨皮质的海绵化。实施例9Sl-5基因敲除小鼠的TRAP染色分析进行骨组织标本的TRAP染色，确定组织中的破骨细胞数。并且，将 等倍数拍摄的各孔的图像采集入计算机，使用Image J (NIH发布)用线围 起相当于破骨细胞的部分，再求出其以像素(pixel)计的面积。结果表明，在Sl-5基因敲除小鼠中破骨细胞的数量增力口(图19)、大小也增大(图20)。 实施例10Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞的破骨细胞形成能力分析 使用Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞，进行体外破骨细胞形成能力 分析。在96孔板上接种口105个骨髓细胞，加入终浓度为50 ng/mL的巨噬 细胞集落刺激因子(M-CSF)， 2日后再加入终浓度为10、 30、 100ng/mL的 NF-kB配体受体活化物(Receptor Activator of NF-kB Ligand, RANKL ) 。 7 日后，固定细胞并进行TRAP染色，考察破骨细胞形成能力(图21A)。 实验按n=6进行。结果表明，在终浓度为30、 100 ng/mL的RANKL存在下， 破骨细胞形成数显著上升(图21B) 。 TRAP溶解测定表明，Sl-5基因敲除 小鼠中TRAP活性值上升(图21C)。而且，加入终浓度为100 ng/mL的 RANKL时，TRAP染色结果表明，与野生型相比，Sl-5基因敲除小鼠中TRAP 阳性多核巨细胞的大小增大(图21D和E)。这些结果暗示SI-5与破骨细 胞的分化抑制相关。实施例11Sl-5基因敲除动物的止血分析针对8周龄~ 111周龄(2 6月龄)的S1 - 5基因敲除小鼠，切断其尾部， 每隔IO秒用滤纸吸取涌出的血液，考察止血程度。结果表明，Sl-5基因敲 除小鼠存在止血困难的倾向(图22)。实施例12Sl-5基因敲除动物的血细胞比容值分析将用于测定微量血细胞比容的毛细管(Capillary tubes for micro-hematocrits ， 长度75mm， 肝素4b, Drummond Scientific Co.)的 一端 插入血液中并保持适当的倾斜，由于毛细管现象血液上升，由此采血直到 血液其上升至毛细管全长的2/3处。用腻子(/《亍)封闭吸入血液的一端。 将一端封闭的毛细管在离心机中1 lOOOrpm离心5分钟，然后^f吏用计凝:板读 出比值(％)。结果表明，Sl-5基因敲除小鼠中存在血细胞比容值低的倾 向，处于贫血状态(图23、 24)。35实施例13Sl-5基因敲除动物的外周血Giemsa染色使用15~ 110周龄的Sl-5基因敲除小鼠，由尾静脉采血后，在PBS中 稀释1000倍，细胞离心涂片(寸,卜7匕°乂 ) ( 800rpm， 5分钟)，进行 了外周血的Giemsa染色。结果可见Sl-5基因敲除小鼠发生贫血，具体地说， 可以观察到红细胞数量减少、红细胞异常(环状红细胞)、染色性差异等 (图25 )。实施例14稳定表达Sl-5-His蛋白的CHO-K1细胞的制备以大量純化Sl-5-His蛋白为目的，制备了稳定表达Sl-5-His蛋白的 CH0-K1细胞。使用Lipofectamine 2000,用20吗pCAGGS隱Sl隱5-His及0,7jig pcDNA3共转染CHO-K1细胞(10cm盘xl) , 24小时后10倍稀释接种于6 个10cm盘中。24小时后，在800pg/mL的遗传霉素(Geneticin )中开始选 择，于11天后挑取集落。每个10cm盘挑取16个集落(合计96个克隆) 接种于96孔板，然后放大至24孔板、6孔板。同时，选取6种总试样(/《 /P夕)分别接种于10cm盘中，将达到汇合状态的6种总试样更换为无血清 培养基，24小时后采用Western印迹法检查细胞提取液和培养上清中的 Sl-5-His表达情况。所使用的抗体是以Sl-5肽(42-56: 15个氨基酸 CKDIDECDIVPDACK:下划线部分为预测的T细胞表位)为抗原免疫兔制备 而成，并且采用Western印迹法确认了其识别Sl-5蛋白。另一方面，对在6 孔板中达到汇合状态的克隆细胞，同样检查了 Sl-5-His蛋白的表达。对于6 孔板的每一个孔使用lmL无血清培养基，将其TCA沉淀物的一半用于表达 检查。结果可确定6个总试样的任意一个在细胞提取液和培养上清液中均 有S1-5-His蛋白的表达，特别是总试样No.l、 2、 3中发现强表达。而且， 确认了 CHO-K1细胞内源性的Sl-5蛋白被分泌到培养上清液中(图26)。 另一方面，针对挑取的96个克隆中确认了存在增殖的90个克隆，检查了 培养上清中Sl-5-His蛋白的表达(图27)。其中，针对克隆No.l、 6、 10、 11、 13、 25、 38、 43、 44、 61、 96再次4企查了 Sl-5画His蛋白的表达(图28 )。 结果检出在克隆No.l、 6、 44、 96中，Sl-5-His蛋白的表达比总试样1更强。最后选择克隆No.96用于以下实验。 实施例15从稳定表达Sl-5-His蛋白的CH0-K1细胞的培养上清液纯化Sl-5-His蛋白将稳定表达Sl-5-His蛋白的CHO-K1细胞的培养上清液60mL用滤器 过滤，然后用Centriplus浓缩至约10mL。将经浓缩的样品对纯化緩冲液 (20mMTris陽HCl (pH7.5)、 500mMNaCl、 10%甘油)透析。将透析后的样 品加至lmL HisTrap柱中，以10mL纯化緩沖液清洗柱。以含10mM和250 mM咪唑的纯化緩冲液(lmL/级分)洗脱吸附的蛋白。将250 mM咪唑洗脱 级分中所含的蛋白经10% SDS-PAGE分离后，采用银染法(图29A)或使 用Sl-5抗体的Western印迹法(图29B )进行才全测。结果使用抗Sl-5抗体 检出了一条带。进一步，将稳定表达Sl-5-His蛋白的CHO-K1细胞的培养上清280mL 用滤器(0.22(xm)过滤，然后加至lmLHisTrap柱中。以10mL纯化緩冲液 (20mM Tris隱HCl (pH7.5)、 500 mM NaCl、 10%甘油)和含10mM咪唑的纯 化緩冲液清洗柱，以含50mM和100mM咪唑的纯化緩冲液(lmL/级分)洗 脱吸附的蛋白。回收洗脱级分(约4mL),对1LPBS溶液透析过夜，用滤 器(0.22pm)过滤样品。将50mM和100mM咪唑洗脱级分中所含的蛋白经 10。/。SDS-PAGE分离后，采用银染法进行检测(图30)。结果表明，与50mM 咪唑相比，在使用含1 OOmM咪唑的纯化緩冲液的洗脱级分中多余条带消失， 获得了纯度更高的Sl-5蛋白。实施例16由CH0-K1细胞制备Sl-5-His截短蛋白在S1-5序列中具有6个EGF样域。为了研究Sl-5的功能，从C末端 开始将EGF样域一个一个地去除，从而制成了 6个构建体(图31)。使用 FuGENE6 (Roche), 用 Sl-5-El画His/pME18S 、 Sl隱5-El画2画His/pME18S、 Sl-5画El-3-His/pME18S、 Sl-5-El-4-His/pME18S、 Sl-5-El-5-His/pME18S、 Sl-5-El-6-His/pME18S和Sl-5 full画His/pME18S转 染CHO-Kl细胞。转染后8小时，将培养基更换为无血清培养基，培养24小时。回收培养上清液，力。Ni-琼脂糖，4。C回旋振荡8小时。以清洗緩冲 液(20mM Tris (pH7.5)、 500 mM NaCl、 10%甘油、10 mM咪唑)清洗Ni-琼脂糖3次，然后用洗脱緩冲液(20mM Tris (pH7.5)、 500 mM NaCl、 10% 甘油、250mM咪唑)洗脱Sl-5蛋白。通过透析将洗脱级分的緩冲液置换为 PBS,采用Western印迹方法计算出Sl-5蛋白的浓度(图32A )。同样地制备Sl-5-FLAG截短蛋白和Sl-5-FLAG蛋白(图32B),用它们 的表达载体分别转染了 CHO-K1细胞(6孔板)。4小时后更换为无血清培养 基(lml)，温育24小时后，将培养上清液(900iuL)用于TCA沉淀。其后，使 用TCA沉淀物和细胞提取液，利用抗FLAG抗体进行了 Western印迹分析。 结果确认任何截短蛋白的表达量均高于全长Sl-5蛋白，其中 S1-5(El-3)-FLAG蛋白的表达量尤其高。实施例17由HEK293细胞制备FLAG-Sl-5截短蛋白进行了 HEK293细胞(大日本制药)表达的FLAG-S1-5截短蛋白的纯 化。将HEK 293细胞以80%~90%的汇合度接种于150mm盘(IWAKI)。 第二天，使用FuGENE6进行转染。操作方法遵照附带的规程。再过2天后， 回收细胞，力卩300|iL溶解緩冲液(50mM Tris-HCl (pH7.4)、 420 mM NaCl、 lmMEDTA、 lmMMgCl2、 0.5mMDTT、 1 mM PMSF )，水上保温20分 钟。加入lOOiaL结合有抗FLAG抗体(SIGMA)的琼脂糖珠子，4'C在回旋 振荡器上搅拌，保温过夜。在清洗緩冲液(50mM Tris-HCl (pH7.4)、 150 mM NaCl、 0.5 mM DTT、 1 mM PMSF )中清洗珠子5次，然后加入lOO^iL的 100吗/mL的FLAG肽(SIGMA) , 4。C在回旋振荡器上搅拌，保温2小时。 离心收集上清，取其中10pL进行SDS-PAGE，采用Western印迹法鉴定从 细胞内纯化的FLAG-S1-5截短蛋白(图33A)，通过CBB染色算出其浓度。 另一方面，转染48小时后回收培养上清液，加入100^L结合有抗FLAG 抗体的琼脂糖珠子，4。C在回旋振荡器上搅拌，保温过夜。此后，进行与上 述相同的操作，鉴定从培养上清液纯化的FLAG-S1-5蛋白，并算出其浓度 (图33B)。结果表明，从细胞内和培养上清液中均纯化出了 Sl-5蛋白(图 33AB)。实施例18由293F悬浮细胞纯化Sl-5-FLAG蛋白和纯化PreScission蛋白酶处理 的Sl-5-FLAG蛋白进行了 293F悬浮细胞强制表达的Sl-5-FLAG蛋白的纯化。首先，按下 述程序进行了在293F细胞质内强制表达的Sl-5-FLAG蛋白的纯化。在90 mL的体积中悬浮培养用pcDNA3-Sl-5-prescission-FLAG质粒转染的293F 细胞，48小时后回收细胞。加入1 mL裂解緩冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF， 0.5 % NP-40),于冰上保温20分钟，加入100nL结合在琼脂糖珠子上的抗FLAG 抗体(SIGMA)， 4。C回旋振荡器上搅拌保温过夜。用清洗緩冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl， 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.5% NP-40)清 洗珠子5次，然后将其转移至迷你柱(mini-column)中，用100 )aL的200 |ig/mL FLAG肽(SIGMA)洗脱3次。洗脱液用PreScission緩冲液(50mM Tris-HCl (pH7.0), 150 mM NaCl， 1 mM EDTA, 1 mM DTT)透析过夜。加入20U的 PreScission蛋白酶，于4。C反应5小时。加入50 jiL的谷月先甘肽sepharose 珠子，4。C回旋振荡器上搅拌保温1小时。回收上清，与纯化各步骤的样品 一起进行SDS-PAGE，釆用Western印迹方法进行鉴定。接下来，对来自转 染293F细胞的培养上清的Sl-5-FLAG蛋白进行了纯化。转染48小时后， 回收培养上清，加入lOOpL结合在琼脂糖珠子上的抗FLAG抗体，4。C回 旋振荡器上搅拌保温过夜。其后，采用与上述相同的方式进行纯化、 SDS-PAGE、 Western印迹法。结果如图34所示。用结合在琼脂糖珠子上的 抗FLAG抗体纯化了细胞质内的Sl-5-FLAG蛋白。此外，与使用抗Sl-5 抗体时检测出相反，使用抗FLAG抗体却几乎不能4企出最终洗脱液中的 Sl-5，这提示发生了 PreScission蛋白酶切割。另一方面，无论在哪个纯化 阶段，采用Western印迹方法均不能从培养上清检测出条带。这些结果说明 采用该方法可以乂人细胞质中纯化FLAG标签脱落的Sl-5蛋白。实施例19关于Sl-5蛋白的糖基化修饰的研究研究了 Sl-5蛋白是否实际上被糖基化修饰。使用从稳定表达Sl-5-His 蛋白的CHO-K1细胞的培养上清中纯化的Sl-5-His蛋白、CHO-K1细胞的细胞提取液以及从HT1080细胞的培养上清免疫沉淀的Sl-5蛋白，进行糖 基肽酶F处理(37。C， 17小时)，利用抗Sl-5抗体进行了 Western印迹法(图 35)。结果发现通过糖基肽酶F处理造成了纯化Sl-5-His蛋白(20ng)的条 带迁移(图35左图)。同样，在从HT1080细胞的培养上清中免疫沉淀的Sl-5 蛋白中，也发现了 Sl-5蛋白的条带迁移(图35右图)。根据这些结果，我们 认为S1-5受到N连接型糖基化修饰。实际上，Sl-5蛋白中的一个位点处存 在共有序列(NX(S/T)X^P)。此外，对于低浓度下检测困难的宽条带(broad band)，通过增加蛋白质量(120 ng)加以研究，结果发现了整体上的条带偏移， 而宽条带并未消失，由此可以认为Sl-5也可能受到O连接型糖基化修饰(图 35中)。实施例20由大肠杆菌制备Sl-5-His截短蛋白制备表达GST融合Sl-5-His蛋白的pGEX载体，转化大肠杆菌，然后 分离了菌落。将分离的菌落接种于10 mL的LB-氨千青霉素培养基(50 mg/mL氨千青霉素)中，37。C培养过夜(前培养)。将经前培养的大肠杆 菌加入200mL的LB-氨节青霉素培养基中，37。C培养2.5小时(主培养)， 然后添加终浓度为0.5mM的IPTG， 30。C继续培养3小时。离心收集菌体， 加入5mL BC500 ( 20mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA, 500 mM KC1, 20% 甘油，1% NP-40, lmM DTT， 0.5mM PMSF， l吗/mL的抑肽酶(aprotinin )、 胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、和亮抑蛋白酶肽(leupeptin) )5mL及100^iL 的100mg/mL的溶菌酶，重悬，超声处理破碎菌体。离心收集上清，加入 500|aL谷胱甘肽S-转移酶偶联琼脂糖珠子(Amersham Pharmacia)GSH树脂， 4。C在回旋振荡器上保温过夜。以BC500清洗GSH树脂5次，然后施加到 ;微柱(micro-column) ( Bio-Red )上，加入500(iL PreScission蛋白酶溶液(10U prescission蛋白酶，50mM Tris-HCl (pH7.0)、 150mM NaCl、 1 mM EDTA、 lmM DTT)，封盖，于4。C静置保温24小时。回收从樣i柱上洗脱的溶液作为切 割的Sl-5-His蛋白的溶液，用Western印迹法进行了鉴定(图36)并用CBB 染色测定了浓度。结果显示从大肠杆菌纯化了 Sl-5蛋白(图36)。实施例2140MBP-S1-5的纯化
除了使用表达MBP融合Sl-5蛋白的pGEX载体外，按与实施例20相 同的提取方法进行了 MBP-Sl-5蛋白的纯化。结果可知洗脱条件使用10mM 的麦芽糖时效率最高。将其回收量与GST-S1-5蛋白进行比较可知 MBP-S1-5更高效地以450 iug/500 mL培养物获得(图37)。此外，在液体层 进行了 PreScission蛋白酶处理也确认了 MBP被切割，与PreScission蛋白酶 处理GST國Sl-5时相同。
实施例22
在Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞中来源于CHO-Kl细胞培养上清 液的Sl-5-His蛋白对破骨细胞形成能力的影响
使用Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞和实施例15中纯化的蛋白，考 察了纯化的Sl-5-His蛋白对体外破骨细胞形成能力的影响。取lxl()S个骨髓 细胞接种于96孔培养板，加入M-CSF至终浓度为50 ng/mL， 2天后加入 RANKL至终浓度为100ng/mL。将Sl-5以PBS稀释后，从加入M-CSF时 起向培养液中连续加入，至终浓度为0、 10、 30、 100ng/mL。 5天后，固定 细胞，进行TRAP染色，考察了 Sl-5-His蛋白对破骨细胞形成能力的影响。 实验取n=5进行。实验结果确认，TRAP阳性多核细胞数依赖于Sl-5-His 蛋白浓度而受到显著地抑制(图39、 41)。并且，TRAP阳性多核巨细胞 形成数也依赖于Sl-5-His蛋白浓度而被抑制(图40、 41)。进一步，除添 加Sl-5-His蛋白至终浓度为0、 10、 30、 100、 200、 500ng/mL夕卜、进行与 上述相同的研究，测定了 TRAP阳性多核巨细胞的面积，发现TRAP阳性 多核巨细胞的大小依赖于Sl-5-His蛋白浓度而减小(图42ABC)。
实施例23
在Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞中截短的Sl-5-His蛋白(Sl-5-His -truncate)对石皮骨细胞形成能力的影响
使用Sl-5基因敲除小鼠来源的骨髓细胞和实施例16中纯化的蛋白，考 察了纯化的Sl-5-El-2蛋白对体外破骨细胞形成能力的影响。实验方法除加 入Sl-5-El-2蛋白至终浓度为0， 10ng/mL以外，其它均与实施例22相同。 实验结果确认了 TRAP阳性多核细胞数被Sl-5截短蛋白所抑制(图43、 45)。
41并且，确认了 TRAP阳性多核巨细胞形成数被更显著地抑制(图44、 45)。 Sl-5-El-2的氨基酸序列示于SEQIDNO:6。
实施例24
RAW264.7细胞中CHO-K1细胞培养上清液来源的Sl-5-His蛋白对破 骨细胞形成能力的影响
使用RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞来源的细胞)和实施例15中纯化 的蛋白，考察了纯化的CHO-K1细胞培养上清液来源的Sl-5-His蛋白对体 外破骨细胞形成能力的影响。取2.5xl()S个RAW264.7细胞接种于96孔培 养板，添加RANKL至终浓度为100ng / mL。将Sl-5-His蛋白以PBS稀释 后，连续地添加至培养液中至终浓度为0、 10、 30、 100、 200、 500ng/mL。 3天后，固定细胞，进行TRAP染色，考察Sl-5-His蛋白对破骨细胞形成能 力的影响。实验取n-5进行。实验结果确认了依赖于Sl-5-His蛋白浓度的 TRAP P曰'l"生多冲亥细月包凄史^卩制(图46、 47)。
实施例25
RAW264.7细胞中293F悬浮细胞来源的Sl-5-FLAG蛋白对破骨细胞形 成能力的影响
使用RAW264.7细胞和实施例18中纯化的蛋白，考察了纯化的 Sl-5-FLAG蛋白对破骨细胞形成能力的影响。实验方法与实施例24相同， 除了下述以外Sl-5-FLAG蛋白来源于293F悬浮细胞，添加无细胞体系 (Abnova,批号H00002202-P01)表达的Sl-5蛋白使其终浓度为0、 10、 30、 100、 200 ng/mL。其结果，添加实施例18中纯化的Sl-5-FLAG蛋白时， 确认了依赖于Sl-5-FLAG蛋白浓度的破骨细胞形成能力抑制(图48)。然而， 添加无细胞体系表达的Sl-5蛋白时，未能确认其抑制效果(图49)。
实施例26
RAW264.7细胞中大肠杆菌来源的GST-S1-5蛋白和PreScission蛋白酶 处理的GST-S1-5蛋白对破骨细胞形成能力的影响的考察
使用RAW264.7细胞和实施例20中纯化的蛋白，考察了纯化的 GST-S1-5蛋白和PreScission蛋白酶处理的GST-S1-5蛋白对破骨细胞形成GST-Sl-5蛋白和PreScission蛋白酶处理的GST-Sl-5蛋白对破骨细胞形成 能力的影响。实验方法与实施例24相同，除了下述以外添加大肠杆菌来 源的GST-Sl-5蛋白和GST蛋白至终浓度为0、 1、3、 10、 30、 100、 200 ng/mL; 添加PreScission蛋白酶处理的GST-Sl-5蛋白和PreScission蛋白酶处理的 GST蛋白至终浓度为0、 1、 3、 10、 30ng/mL。其结果，在添加GST-Sl-5 蛋白、PreScission蛋白酶处理GST-Sl-5蛋白的情况下，确认了依赖于浓度 的抑制效果(图50、 51、 54、 55),与此相对的是，GST蛋白和PreScission 蛋白酶处理GST的蛋白则不影响破骨细胞形成能力(图52、 53、 56、 57)。 可知通过PreScission蛋白酶处理而脱去GST的蛋白不仅保留了其活性， 而且脱去标签后其活性进一步增加。
实施例27
Sl-5蛋白对骨质疏松症模型大鼠的骨密度低下的效果的考察 采用常规方法对7周龄的Wister大鼠实施卵巢摘除术(ovarectomy, OVX)，开始皮下给予实施例20中纯化的蛋白。自实施OVX时起，以1.0 mg/kg/日每周给药5次。手术后经过4周处死大鼠，摘取其左右股骨，用 70%乙醇固定，然后进行了骨密度的测定。骨密度的测定使用 DCS-600EX-IIIR型(Aloka)，对股骨远端部位1/4处以层面厚度(7 ，^ 7 厚)lmm、速度10mm/s 乂人远端部位向近端部位进行20次扫描。与々I手术 大鼠(sham)相比，施用了 GST和PreScission蛋白酶的OVX手术大鼠的骨密 度下降约10%。骨密度下降10%以上则认为制成了 OVX模型(Modder,UI. W a/.， Endcrinology 145: 913-921, 2004)。与此相对，在施用了 PreScission蛋白 酶处理的GST-Sl-5蛋白的OVX手术大鼠中发现了骨密度的增加。由这些 结果推断Sl-5蛋白改善了骨质疏松症(图58)。
实施例28
Sl-5蛋白对骨质疏松症模型大鼠的骨密度减小的效果的考察 使用在27中进行了考察的大鼠股骨进行了骨强度分析。骨强度使用 MZ-500S (Maruto)通过三点弯曲试验进行测定，测压器(load cell)为500N、 支^J争3巨(support span)为13mm、压头速度(head speed)为10mm/min。
结果发现，与假手术大鼠相比，施用了 GST和PreScission蛋白酶的OVX手术大鼠的骨强度减小，但通过施用实施例20中纯化的蛋白，骨强度得以
改善(图59)。 实施例29
Sl-5蛋白对骨质疏松症模型大鼠的效果的显微CT分析 摘取实施例27中研究的大鼠股骨，除去骨周围的软组织，用70%乙醇 进行了固定。然后，拍摄了从生长板软骨起沿骨干方向10。/。处的显微CT图 像。与假手术大鼠相比，施用了 GST蛋白和PreScission蛋白酶的OVX手 术大鼠中骨松质(cancellous bone)减少，与此相对，在施用了实施例20中纯 化的蛋白的OVX手术大鼠中，木>质骨的减少得以改善(图60)。该图像提示 Sl-5蛋白显示破骨细胞抑制效果。
实施例30
S1 -5蛋白对骨质疏松症模型大鼠的效果的组织学分析 摘取实施例27中研究的大鼠股骨，除去骨周围的软组织，用70%乙醇 进行固定。然后，进行骨组织标本的TRAP染色，测定了组织中的破骨细 胞数。结果，与假手术大鼠相比，施用了 GST蛋白和PreScission蛋白酶的 OVX手术大鼠在胫骨近侧干骺端中破骨细胞数增加，与此相对，在施用了 实施例20中纯化的蛋白的OVX手术大鼠中，破骨细胞数的增加受到了抑 制(图61)。
实施例31
S1 -5蛋白对骨质疏松症模型'j、鼠的效果的考察
采用常规方法对7周龄的C57BL/6j小鼠实施OVX，并皮下施用实施例 20中纯化的蛋白。自实施OVX时起，以l.Omg/kg/日每周给药5次。手术 后经过8周处死小鼠，摘取其股骨，用70%乙醇固定，然后进行了骨密度 的测定。骨密度的测定4吏用DCS-600EX-IIIR型(Aloka)，对股骨远端部位1/4 处以层面厚度lmm、速度10mm/s由远端部位向近端部位扫描20次。结果， 与大鼠的情况相同，与假手术小鼠(sham)相比，OVX手术小鼠的骨密度下 降约10%。而与此相对的是，在施用了实施例20中纯化的蛋白的OVX手 术小鼠中，确认了骨密度的增加。由这些结果推断Sl-5蛋白改善了骨质工业实用性
本发明提供Sl-5基因缺损、发生老化性疾病的基因敲除动物及其生产 方法。本发明的动物呈现骨变形、脱毛、组织损伤、肿瘤发生等各种老化 性疾患病或症状，因此该动物可用作模型动物，通过给予该动物对老化性 疾病治疗或预防有效的物质，筛选具有治疗或改善效果的药物组合物。此 外，本发明还提供由从该基因敲除动物分离的细胞。使用该细胞可以筛选 治疗或预防老化性疾病患的治疗或预防药物。与野生型小鼠的骨髓细胞相 比，从该基因敲除动物分离的骨髓细胞分化成破骨细胞时具有更高的耐酒 石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)阳性多核巨细胞形 成能力，因此可以用TRAP阳性多核巨细胞的数量及/或大小为指标进行 破骨细胞功能抑制剂的筛选。
本发明还提供分离的Sl-5蛋白和与Sl-5蛋白结合的抗体。利用分离的 Sl-5蛋白，可以治疗或预防老化性疾病，以及抑制破骨细胞的功能。
权利要求
1. 呈现老化性疾患或症状的非人基因敲除动物，其中S1-5基因的全部或部分功能丧失。
2. 权利要求1的动物，其中全部或部分Sl-5基因功能的丧失是由Sl-5 基因的破坏或突变引起的。
3. 权利要求l的动物，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏 松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度低下、骨皮质海绵化、 脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化 及指曱老化中的至少一种。
4. 权利要求l的动物，其是选自斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、 猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩的任意动物。
5. 从权利要求1 4任意一项的非人基因敲除动物中分离的细胞。
6. 权利要求5的细胞，其是破骨细胞、角质化上皮细胞、血细胞、癌 细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌细胞、神经 细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、肝细胞、色 素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。
7. 发生老化性疾患的非人基因敲除动物的制备方法，其中所述方法包 括使Sl-5基因的全部或部分功能丧失。
8. 权利要求7的方法，其中Sl-5基因全部或部分功能丧失是由Sl-5 基因的破坏或突变引起的。
9. 权利要求7的方法，其中老化性疾患或症状为选自骨变形、骨质疏 松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度、骨皮质海绵化、脱毛、 组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指曱 老化中的至少一种。
10. 权利要求7的方法，其中动物是选自斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、 兔、鸡、猪、绵羊、山羊、犬、牛、猴及黑猩猩的任意动物。
11. 老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中对权利要求 1 ~ 4任意一项的非人基因敲除动物给予所述预防或治疗药物的候选物质。
12. 老化性疾患或症状的预防或治疗药物的筛选方法，其中使所述预防 或治疗药物的候选物质与从权利要求1 4任意一项的非人基因敲除动物中分离的细胞相接触。
13. 权利要求12的方法，其中所述细胞是破骨细胞、角质化上皮细胞、 血细胞、癌细胞、骨髓细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、真皮细胞、肌 细胞、神经细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞、毛乳头细胞、 肝细胞、色素细胞、脂肪细胞、子宫内皮细胞或肺泡上皮细胞。
14. 权利要求11 ~ 13任意一项的方法，其中老化性疾患或症状为选自 骨变形、骨质疏松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度低下、 骨皮质海绵化、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、 出血、皮肤老化及指甲老化中的至少一种。
15. 破骨细胞功能抑制剂的筛选方法，其中使破骨细胞功能抑制剂的候选物质与权利要求1 4任意一项的非人基因敲除动物来源的破骨细胞相接触。
16. 下面(a) - (d)任意一项的分离的蛋白质(a) 包含SEQ ID NO:2或4所述的氨基酸序列的蛋白质；(b) 由包含SEQ ID NO:l或3所述的碱基序列的编码区的DNA编码的蛋白质；(c) 包含在SEQ IDNO:2或4所述氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸 替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质在功能 上与包含SEQ ID NO:2或4所述氨基酸序列的蛋白质等同；(d) 由在严紧条件下与包含SEQ ID NO: 1或3所述石咸基序列的DNA杂交 的DNA所编码的蛋白质，所述蛋白质在功能上与包含SEQ IDNO:2或4所 述氨基酸序列的蛋白质等同。
17. 权利要求16的蛋白质的部分肽。
18. 权利要求17所述的肽，其包含SEQIDNO:6记载的氨基酸序列。
19. 老化性疾患或症状的预防或治疗药物，其含有权利要求16的蛋白 质、或者权利要求17或权利要求18的肽。
20. 权利要求19的预防或治疗药物，其中老化性疾患或症状为选自骨 变形、骨质疏松症、骨佩吉特病、曱状旁腺功能亢进症、骨密度低下、骨 皮质海绵化、脱毛、组织损伤或坏死、肿瘤、胸部肥大、腹水、贫血、出血、皮肤老化及指曱老化中的至少一种。
21. —种破骨细胞功能抑制剂，其含有权利要求16的蛋白质、或者权利要求17或权利要求18的肽。
22. —种抗体，其与权利要求16的蛋白质、或者权利要求17或权利要 求18的肽结合。
全文摘要
发现丧失S1-5基因功能的基因敲除小鼠发生老化性疾患或症状。而且查明该基因敲除小鼠的骨盐含量、骨密度、骨强度下降，而且骨组织中破骨细胞数增加。此外，使用该基因敲除小鼠来源的骨髓细胞进行的破骨细胞形成能力分析结果表明，与野生型小鼠相比，该基因敲除小鼠中破骨细胞形成能力亢进且破骨细胞增大。进一步还表明对骨质疏松症模型小鼠施用纯化的S1-5蛋白，具有改善骨质疏松症的效果。上述认识表明S1-5蛋白在骨质疏松症等老化性疾患的治疗、预防中发挥作用。
文档编号A61P43/00GK101258240SQ20058005147
公开日2008年9月3日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年7月1日
发明者中岛利博, 八木下尚子, 天野彻也 申请人:罗克莫基因株式会社