NA的试剂可以是本领域 常用的任意的DNA提取试剂，本发明实施例不对DNA提取试剂的具体种类作特殊限定。但是 优选采用Chelex试剂。Chelex是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有 成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和 螯合作用，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物 质与DNA分离。利用Che 1 ex进行DNA提取能够减少有机试剂的使用，降低对人体的伤害以及 对环境的污染，并且提取过程简单快速、始终在同一个管里进行，避免样品污染。Chelex溶 液的质量体积浓度可以为5%，本领域技术人员也可根据实际情况采用其他浓度的Chelex 溶液，例如2 %、3 %、4%、6 %、7 %等。用于配制Che 1 ex溶液的溶剂可以为1 /10的TE缓冲液。 TE缓冲液为Tris(三羟甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制得到的缓冲液（1/10的TE 缓冲液表示Tris的浓度为ImM，EDTA的浓度为0.1 mM)，是分子生物学中常用的缓冲溶液。
[0050] 进一步地，在上述的检测方法中，步骤a中在对中华蜜蜂种群进行采样时，要保证 采集的样品能够反映出该种群中csd等位基因的分布情况。对于有多个蜂群的种群来说，应 当在每个蜂群中分别选择样本。样本总量优选20个以上，以保证检测结果的准确性。
[0051] 本发明实施例中所用的各引物在序列表中的序号如表1所示。
[0052]表1各引物在序列表中的序号
[0054] 需要说明的是，引物F1中，当R和Y进行组合时可以得到4种序列，分别为：
[0055] 5，-CATCGAGAG AACGAT CTCG-3,，
[0056] 5，-CATCAAGAG AACGAT CTCG-3,，
[0057] 5'-CACCGAGAG AACGAT CTCG-3'，
[0058] 5'-CACCAAGAG AACGAT CTCG-3'。
[0059] 引物FI可以是上述4种序列的任意一种，也可以是其中2种或者2种以上的组合。
[0060] 引物R1的序列也包括以下4种情况：
[0061 ] 5 '-CCCAAGGTTTAATCATTATTGG-3 '，
[0062] 5 '-CCCAAGGTTTAACCATTATTGG-3 '，
[0063] 5 '-CCCAAGGTCTAACCATTATTGG-3 '，
[0064] 5 '-CCCAAGGTCTAATCATTATTGG-3 '。
[0065]同样地，引物R1可以是上述4种序列的任意一种，也可以是其中2种或者2种以上的 组合。
[0066] 下面以具体的中华蜜蜂种群为例，对本发明实施例提供的检测方法作进一步详细 描述。
[0067] 以下实施例1~2中所用主要试剂如下：
[0068] Chdex^lOOResin 购自 Bio-Rad 公司；
[0069] lOXBuffer购自Fisher biotec公司；
[0070] dNTPs购自Fisher biotec公司；
[0071 ] TAQ-Ti DNA聚合酶购自Fisher biotec公司；
[0072] LIZ500分子量内标购自Life Technologies公司；
[0073] 引物F1和R1由上海英骏生物技术有限公司合成，其中，F1为上文所述4种序列的混 合物，R1为上文所述4种序列的混合物，R1的5 '端带有荧光标记FAM。
[0074] 以下实施例1~2中所用主要仪器如下：
[0075] Tissue-lyser II组织破碎仪，购自德国QIAGEN公司；
[0076] ABI3130xl型基因测序仪，购自美国应用生物系统公司。
[0077] 实施例1:
[0078]本实施例对未受人工选择压力影响的中华蜜蜂种群中csd等位基因类型进行检 测，检测方法如下：
[0079]步骤1，从该未受人工选择压力影响的中华蜜蜂种群的12个蜂群每个蜂群中随机 挑选2只工蜂作为样本。
[0080]步骤2,分别提取每只样本蜜蜂的DNA。提取方法如下:将采集的样本蜜蜂从酒精中 取出，然后用吸水纸把样本蜜蜂表面的酒精吸干；同时，把镊子放到100 %酒精中浸泡后放 到火上灼烧，用灼烧过的镊子取下样本蜜蜂的一只后足，将后足放入含有不锈钢珠的质量 体积浓度为5 %的Che 1 ex溶液(溶剂为1 /10ΤΕ缓冲液）中提取样本蜜蜂的DNA;提取条件为： 震荡速度25Hz，10分钟，之后100°C水浴15分钟，离心后将上清液放入离心管中，在-20°C的 环境中保存备用。
[0081 ]步骤3,以步骤2提取的DNA作为模板，利用带有FAM标记的引物对F1/R1进行PCR扩 增得到扩增产物，其中，PCR扩增采用5μ1反应体系，反应体系具体组成如表2所示：
[0082] 表2 5μ1反应体系
[0084] PCR扩增程序如下：
[0085] 95°C 预变性 5min; 95°C30s，60°C30s，72°C15s，30 个循环；72°C 延伸 7min。
[0086] 步骤4,采用ABI3130xl型基因测序仪对步骤3所得扩增产物进行毛细管电泳，得到 原始数据后通过GeneMapper软件进行分析而得到扩增产物的片段大小信息。检测条件如 下：按照lml甲酰胺加入1 OyL LIZ500分子量内标的比例配制混合物，每5yL混合物加入lyL PCR产物进行上机检测。分析结果中的横坐标值即为扩增片段的大小，表明不同类型的csd 等位基因。图2所示为一只样本蜜蜂的检测结果，由于工蜂的csd基因中含有两个不同的等 位基因，因此图2中出现两个大小不同的峰值。
[0087] 按照上述方法，在本实施例的中华蜜蜂种群中共检测到13种csd等位基因类型，群 体中csd等位基因类型较多，每只工蜂的两个csd等位基因都能得到很好的区分。具体等位 基因类型如表3所示。
[0088] 表3实施例1的中华蜜蜂种群中csd等位基因类型
[0089]
[0090] 实施例2:
[0091] 本实施例对人工选择后的中华蜜蜂种群中csd等位基因类型进行检测，检测方法 如下：
[0092] 步骤1，从该人工选择后的中华蜜蜂种群的13个蜂群每个蜂群中随机挑选2只工蜂 作为样本。
[0093]步骤2,分别提取每只样本蜜蜂的DNA，提取方法同实施例1。
[0094]步骤3,以步骤2提取的DNA作为模板，利用带有FAM标记的引物对F1/R1进行PCR扩 增得到扩增产物，PCR扩增反应体系和扩增程序同实施例1。
[0095]步骤4,采用ABI3130xl型基因测序仪对步骤3所得扩增产物进行检测，检测条件和 分析方法同实施例1。
[0096] 按照上述方法，在本实施例的中华蜜蜂种群中共检测到8种csd等位基因类型，与 自然群体相比，该群体中csd等位基因类型相对较少，每只工蜂的两个csd等位基因都能得 到很好的区分。具体等位基因类型如表4所示。
[0097] 表4实施例2的中华蜜蜂种群中csd等位基因类型
[0099]综上，本发明实施例通过合理设计带有荧光标记的引物对，采用基于PCR技术的检 测方法对中华蜜蜂种群中csd等位基因类型进行检测，能够快速准确地检测出中华蜜蜂种 群中csd等位基因类型，为中华蜜蜂保种、育种工作过程中种群的选择提供指导，避免蜂群 因 csd等位基因的丢失造成csd纯合而出现生产力下降的不良影响。
[0100]以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制 本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括 以下步骤： 步骤a，从中华蜜蜂种群中采集预设数量的工蜂作为样本； 步骤b，分别提取所采集的每只样本蜜蜂的DNA; 步骤c，以步骤b提取的DNA作为模板，利用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增得到扩 增产物； 步骤d，检测所述扩增产物的大小，根据所述扩增产物的大小判断所述中华蜜蜂种群中 csd等位基因的类型； 步骤c中所用引物对的核苷酸序列为： FI:5，-CAYCRAGAG AACGAT CTCG-3，， R1:5 '-CCCAAGGTYTAAYCATTATTGG-3 '， 其中，引物R1的5 '端带有荧光标记，Y代表T或C，R代表G或A。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤d具体包括： 将所述扩增产物稀释后与分子量内标混合，利用基因测序仪进行毛细管电泳，得到原 始数据； 对毛细管电泳得到的原始数据进行分析得到所述扩增产物的大小信息，根据所述扩增 产物的大小判断所述中华蜜蜂种群中csd等位基因的类型。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物R1带有的荧光标记为FAM、 HEX、NED、VIC或PET。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤c中，PCR扩增程序为： 95°C预变性5min; 95°C30s，60°C30s，72°C15s，30 个循环； 72°C 延伸 7min。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤c中，PCR扩增反应体系为:总体积 为5μ1，其中包括： 双蒸水，2.11μ1; 10XBuffer，0.5ul; 浓度为2mM的MgCh水溶液，0.5μ1; dNTPs，0.4μ1，其中每种 dNTP 的浓度为 10mmol/L; 质量浓度50 %的丙三醇水溶液，0.25μ1; 浓度为20μΜ的F1引物，Ο.?μL; 浓度为20μΜ的R1引物，Ο.?μL; 浓度为5UnitsAxL的TAQ-Ti DNA聚合酶，0.04μ1; 浓度为 16 ~65ng/yL 的 DNA，lyl。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤b中，采用Chelex提取所述样本蜜 蜂的DNA。7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤b中，采用质量体积浓度为5%的 Che 1 ex溶液提取所述样本蜜蜂的DNA;所述Che 1 ex溶液的溶剂为1 /10TE缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法，属于蜜蜂育种、保种技术领域。该检测方法包括以下步骤：步骤a，从中华蜜蜂种群中采集预设数量的工蜂作为样本；步骤b，分别提取所采集的每只样本蜜蜂的DNA；步骤c，以步骤b提取的DNA作为模板，利用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增得到扩增产物；步骤d，检测所述扩增产物的大小，根据所述扩增产物的大小判断所述中华蜜蜂种群中csd等位基因的类型。该检测方法操作简单，能够快速准确地对一个中华蜜蜂种群中的csd等位基因类型进行检测，为中华蜜蜂保种、育种工作过程中种群的选择提供指导。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105524992
【申请号】CN201610007268
【发明人】丁桂玲, 黄家兴, 张红, 刘彦杰, 孙成, 安建东
【申请人】中国农业科学院蜜蜂研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月6日