用于检测莱姆病螺旋体的rpa引物和探针及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种用于检测莱姆病螺旋体的 RPA引物和探针及检测方法。
【背景技术】
[0002] 莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(Bolrelia burgdorferi)引起的一种 慢性自然疫源性疾病。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间 传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害一慢性游走性红斑(ECM)，同时伴有头痛、发 热、寒战、疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运动系统等 呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、病死率较高等特点。如能早期诊 断、早期治疗常可痊愈，否则会出现严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技 术，对莱姆病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。
[0003] 目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。病原学检测包括 直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(real-time PCR);常用的 特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印 迹法(WB)。
[0004] 直接镜检法需要操作者具备丰富的检验经验，然而对于混合感染的情况，则无法 检测到，而且该法容易漏检，与其他诊断方法相比，直接检查的检出率相对较低。病原分离 培养法的分离率低，耗时较长，敏感性差。IFA只能检测到菌体表面的抗原，灵敏度和特异性 都比较低，且IFA受实验因素影响大，易造成假阳性或假阴性。ELISA主要对莱姆病特异抗体 IgG进行检测，传统ELISA检测方法，存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易误 诊。WB可以判断和验证IFA和ELISA的真假阳性，但由于莱姆病螺旋体有不同的致病基因型， 而这几种基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各国应根据实际情况，制定出针对本 国流行的基因型的WB阳性诊断标准，而且WB的操作比较复杂，不利于推广。PCR技术的不足 之处在于：（1)靶基因易被污染；（2)易出现非特异性扩增；（3)扩增反应易受多种因素的影 响；（4)需要投入比较昂贵的精密仪器(如PCR仪、凝胶电泳仪及凝胶成像系统）；（5)耗时长， 需要2~3h的反应时间和1~2h的电泳时间。这些均不利于现场的快速检测，给技术的基层 推广造成了极大障碍。
[0005] 重组酶聚合酶扩增法（Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是2014年 兴起的一种新的恒温扩增方法，其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地 扩增靶基因序列。目前RPA技术主要应用于病原微生物的快速检测，包括病毒、细菌、真菌、 支原体、寄生虫等，在临床疾病诊断、食品卫生检验及环境监测方面应用广泛，然而目前未 见利用RPA技术进行莱姆病螺旋体检测的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针以及含有所述 引物和探针的检测试剂盒。
[0007]本发明的另一目的是提供一种检测莱姆病螺旋体的RPA法。
[0008]为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，所 述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列如下：
[0009] LF-F:5 '-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 '
[0010] LF-R:5 '-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 '
[0011]所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5'端用FAM标记，3'端进行 C3Spacer修饰，且在探针中间距5'端30bp处进行dSpacer或THF修饰。
[0012] 引物和探针序列分别如下：
[0013] LF-F:5 '-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 '
[0014] LF-R:5 '-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 '
[0015] LF-P:5,-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT (C3Spacer)-3，
[0016] 本发明还提供含有所述引物LF-F、LF-R和探针LF-P的用于RPA法检测莱姆病螺旋 体的试剂盒。
[0017] 优选地，所述试剂盒还包括RPA反应管、反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一 种(RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号TANF002KIT;其中，Bsu DNA 聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用1 X反应缓冲液溶解，整个 RPA反应在RPA反应管中进行）。
[0018] 本发明还提供所述RPA引物和探针及其检测试剂盒在鉴定莱姆病螺旋体中的应 用。
[0019] 本发明进一步提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA法，包括以下步骤：
[0020] 1)提取样品中的DNA;
[0021] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用所述引物LF-F、LF-R和探针LF-P，在RPA反应 管中进行RPA扩增反应；
[0022] 3)分析RPA扩增产物。
[0023] 其中，RPA反应体系以50μ1计为： 模板ΟΝΑ ΙμL ΙΟμηιοΙ/L引物 LF-F 2 ΙμL ΙΟμηιοΙ/Ι 引物 LF-R 2.1μ1
[0024] ΙΟμηιοΙ/Ι...探针 LF-P 0.6μ1 lx反应缓冲液 29.5μ1 280mmol/L TVlg2 缓冲液 2.5μΙ ddH.O 补足至50μ1
[0025] RPA反应条件为:30-45°C (优选37°C)，20分钟，冰上终止反应。
[0026] 步骤3)中采用Hybridetect 2T试剂盒（含侧流层析试纸条，购自德国Milenia Biotec公司，商品编号MILENIA01)检测RPA扩增产物。检测方法如下：将扩增产物与 Hybridetect 2T试剂盒中的缓冲液按1: 20的体积比混合，然后将Hybridetect 2T试纸条置 于上述混合液中，5分钟后判读结果;如果试纸条的检测线上出现条带，而且质控线正常，则 表明该样品中含有莱姆病螺旋体，如果仅是质控线上出现条带，则表明该样品中不含莱姆 病螺旋体。
[0027]本发明将RPA引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联用，可从疑似病人血清中快速 准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基 因型的莱姆病螺旋体进行检测，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时 可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例2中利用RPA引物恒温扩增不同基因型的莱姆病螺旋体、非莱 姆病螺旋体的Hybridetect 2T试纸条检测结果;其中，A图为扩增36株莱姆病螺旋体的结 果，对应于表1中各菌株，N为阴性对照;B图为扩增非莱姆病螺旋体的结果，B31为阳性对照， 1为埃立克体，2为横赛巴尔通体，3为无形体，4为贝氏柯克斯氏体，5为钩端螺旋体，6为大肠 埃希菌，7为阴性对照。
[0029] 图2为本发明实施例3中RPA引物恒温扩增反应体系的灵敏度检测结果;其中，N为 阴性对照，模板浓度梯度依次为l〇pg，lpg，l〇〇f g，50f g，10f g。。
[0030] 图3为本发明实施例3中普通PCR扩增反应体系的灵敏度检测结果;其中，M为lOObp Ladder，1-5分别代表模板浓度为60ng/yl、lOng/μΙ、lng/μL、lOOpg/μΙ、lOpg/μΙ，6为阴性对 照。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0032] 以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号 TANF002KIT;其中，Bsu DNA聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中，使用时， 用1 X反应缓冲液溶解，整个RPA反应在RPA反应管中进行。
[0033]实施例1用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针的合成
[0034]将莱姆病螺旋体菌株B31用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针的筛选。以recA 基因为革El基因，根据TwistDX操作手册要求，利用Primer 5设计5对可用于Basic RPA试剂盒 的引物。利用Basic RPA试剂盒对这5对引物进行筛选，得到可稳定扩增目的产物，且灵敏度 和特异性最好的一对引物。筛选得到的最佳引物序列见Seq ID No: 1和2。然后在此引物的 基础上根据Twist DX公司RPA nfo试剂盒操作手册要求对上述引物进行改造，在反向引物 5'端加入一个生物素标记位点，另外，根据RPA引物序列设计一条大小为46-52bp的探针，探 针的5 '端用FAM标记，3 '端进行C3Spacer(C3间臂）修饰，且在探针中间距5 '端30bp处进行 d