，参照王仲怡等 (2015)方法调查发病情况。抗性评价以0~2级为抗病（R)，3~4级为感病（S)。调查F 2 和卩3家系的抗、分离、感病家系的分离比，进行抗性遗传分析并研究G0003967对豌豆白粉 病的抗性遗传规律。
[0032] 调查结果表明，感病亲本坝豌6号的植株被大量白粉菌分生孢子覆盖，级别为4 级，表现为感病（图1右）。而抗病亲本G0003967没有出现任何感病症状，级别为0级，表 现为免疫（图1左）。坝豌6号与G0003967杂交组合衍生的4个F 1植株都为感病植株， 坝豌6号与G0003967杂交组合衍生的102个F2单株中，有78个感病株系，24个抗病株 系，经X 2检验符合期望的3:1 (S:R)的分离比。F3家系对菌株EPYN的抗性鉴定结果表明， 纯和抗病家系为24个，纯和感病家系为31个，杂合型家系为47个。经X 2检验符合期望的 l:2:l(R:Rs:S)的分离比。
[0033] 三、豌豆基因组DNA的提取
[0034] 采用CTAB法提取2个亲本及102个F2植株的基因组DNA。将样品至于液氮中用 打样机研磨成粉末，向离心管中加入800 μ I 65°C预热的CTAB提取缓冲液，混匀后于65°C 水浴中保存30-50分钟；取出离心管，冷却至室温，加入800 μ 1酚：氯仿：异戊醇（25:24:1， 体积比），提取10分钟，轻轻摇荡，使其充分混匀，12000rpm离心10分钟；取上清液到另一 I. 5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)，充分混匀10分钟后，12000离心10分 钟；取上清液移入另一 I. 5ml离心管中，加入0. 8倍体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，与-20°C 下放置30-60分钟，使DNA以沉淀析出；挑出DNA沉淀转移至I. 5ml离心管中，用75%酒精 洗涤2次，最后用无水乙醇脱水，吹干，家如适量灭菌的超纯水。DNA溶解后，用1 %的琼脂 糖凝胶电泳检测DNA的完整性和紫外分光光度法检测DNA样品的浓度。
[0035] 四、G0003967的抗病基因连锁标记分析及定位
[0036] 利用已知的与erl连锁的10个分子标记在亲本G0003967和坝豌6号之间进行 PCR扩增和多态性筛选（表D13PCR反应体系为10 μ 1，包括：2XTaq PCR MasterMix 4 μ 1， 上、下游引物〇. 2ymol/L，模板DNA 20ng/yl，ddH20补足至10μ1。PCR反应程序：95°C预 变性5分钟；94°C 30秒，51°C~67°C 30秒，72°C 30秒，35个循环；72°C 10分钟，4°C保存。 扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0037] 通过亲本筛选，在10个连锁标记中有5个标记在亲本之间具有多态性，将在亲本 之间具有多态性的分子标记进行？ 2群体验证（图2)。分子标记在F2群体中的分尚模式进 行X2检验。其中，2个SCAR标记ScOPE 16-1600和Sc0PD-650为显性标记，其在群体中均呈 现3:1的分布；1个基因标记c5DNAme和2个SSR标记PSAD60和PSMPSA5均为共显性标记， 其在群体中均呈现1:2:1分布。
[0038] 用mapmaker 3. 0软件分析分子标记与抗病基因的连锁关系。使用MapDraw软件 构建遗传连锁图谱，定位抗病基因的区间。使用mapmaker 3. 0软件连锁分析表明，这5对 多态性引物与抗病基因 erl-7均连锁。使用MapDraw软件绘制遗传连锁图谱，erl-7被定位 在基因标记c5DNAme和SCAR标记Sc0PE16-1600之间，遗传距离分别为4. 2cM和8. 3cM(图 2) 〇
[0039] 表1.与erl连锁的分子标记引物序列信息
[0041] 实施例2抗性资源的erl候选基因 PsMLOl cDNA序列鉴定
[0042] 用RNAprep植物总RNA提取试剂盒（离心柱型，购自天根生化）提取豌豆资源 G0003967和感病对照品种坝豌6号的植物总RNA。具体操作方法如下：
[0043] 1)取约IOOmg豌豆幼嫩叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ L RL(使用前加 入β -巯基乙醇至终浓度为1 % )，涡旋剧烈震荡混匀；
[0044] 2)将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），12000rpm离心 5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中；
[0045] 3)缓慢向离心管中加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起 转入吸附柱CR3中，静置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；
[0046] 4)向吸附柱CR3中加入500 μ L去蛋白液RW1，静置2min，12000rpm离心lmin，倒 掉收集管中的废液；
[0047] 5) DNase I工作液的配制：取10 μ L DNase I储存液放入新的RNase-free离心 管中，加入70 μ L RDD溶液，轻柔混匀；
[0048] 6)向吸附柱CR3中央加入80 μ L的DNase I工作液，室温放置20min ;
[0049] 7)向吸附柱CR3中加入350 μ L去蛋白液RW1，静置2min，12000rpm离心lmin，倒 掉收集管中的废液；
[0050] 8)向吸附柱0?3中加入500以1^票洗液1^(使用前加入无水乙醇），室温静置21^11， 12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；
[0051] 9)重复步骤8);
[0052] 10) 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，彻底晾干 残留的漂洗液；
[0053] 11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间位置悬空 滴加 50 μ LRNase-free ddH20,室温放置 lOmin，12000 rpm 离心 2min，得到 RNA 溶液；
[0054] 12) RNA完整性检测：普通琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：胶浓度1. 2 % ; I X TBE电泳 缓冲液；150V ;15min。
[0055] 用BioRT逆转录扩增（RT-PCR)试剂盒（两步法）合成mRNA第1条cDNA链，用 PsMLOl 特异性引物对 PsML01F/PsML01R(5' -AAAATGGCTGAAGAGGGAGTT-3' /5' -TCCACAAATCA AGCTGCTACC-3'）进行 PCR 扩增（Pavan et al.，2013)。PCR 扩增产物经 I. 5% TBE 琼脂糖 凝胶电泳检测，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型，购自天根生化）回收并纯 化PCR产物。将纯化后的PCR产物克隆到pZeroBack载体或pMG-T载体（购自天根生化） 中，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，利用ClustalX2软件分析抗病、感病品种 之间的PsMLOl cDNA序列差异，并与已知的野生型豌豆品种PsMLOl cDNA序列（GenBank : FJ463618)进行比对分析（Humphry et al. 2011)。
[0056] 结果表明，感病对照坝豌6号的PsMLOl cDNA序列与野生型PsMLOl序列 (FJ463618)完全相同，抗病资源G0003967的PsMLOl cDNA与野生型PsMLOl cDNA序列相 比，发生第111~120个碱基缺失，从而引起PsMLOl蛋白功能（Seq ID No. 1)的变化。这 种小片段缺失目前还没有相关报道，是一种新的PsMLOl突变形式（Seq ID No. 2)，该结果表 明G0003967中含有新的抗白粉病等位基因，将其命名为erl-7。该等位基因位于豌豆遗传 图谱第VI连锁群的erl基因座位上，该抗病基因对豌豆白粉病具有广谱抗性，可有效控制 我国豌豆白粉病的发生，减轻该病害造成的产量损失。该基因可有效应用到分子育种中，对 豌豆生产和育种工作具有重要意义。
[0057] 豌豆抗白粉病资源G0003967的PsMLOl cDNA对应的CDS序列及其编码氨基酸序 列见 Seq ID No. 25。
[0058] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0059] 参考文献
[0060] Fondevilla SjCarver TLffjMoreno MTjRubiales D (2006) Macroscopic and histological characterisation of genes erI and er2 for powdery mildew resistance in pea. Eur J Plant Pathol 115:309 - 321
[0061] Fondevilla SjRubiales D(2012)Powdery mildew control in pea:a review. Agron Sustainable Dev 32:401 - 409
[0062] Fondevilla S，Torres AM，Moreno MT, Rubiales D(2007)Identification of a new gene for resistance to powdery mildew in Pisum fulvum, a wild relative of pea. Breed Sci 57:181-184
[0063] Ghafoor AjMcPhee K(2012)Marker assisted selection(MAS)for developing powdery