entraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)、以及美国农业研宄菌种保藏中心北方地区研宄中心 (NRRL)〇
[0167] 可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等等） 分离的微生物或直接从自然材料（例如，土壤、堆肥、水等等）获得的DNA样品鉴定和获得 该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以 通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多 肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领 域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸（参见例如，Sambrook(萨姆布鲁克）等 人，1989,同上）。
[0168] 多核苷酸
[0169] 本发明还涉及编码本发明的多肽或催化结构域的分离的多核苷酸，如在此所述。
[0170] 用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或 cDNA，或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知 的聚合酶链反应（PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达 库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯（Innis)等人，1990,PCR:方法和应用指南（PCR:A GuidetoMethodsandApplication)，学术出版社（AcademicPress)，纽约。可以使用其 他核酸扩增程序例如连接酶链式反应（LCR)、连接激活转录（LAT)和基于多核苷酸的扩增 (NASBA)。这些多核苷酸可以从Nakamurella菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以 是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或物种变体。
[0171] 编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是 必需的。术语"实质上类似"于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以 某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优PH等 方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列（例如其子序 列）形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用 于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序 列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德（Ford)等人，1991，蛋 白表达与纯化（ProteinExpressionandPurification) 2:95-107。
[0172] 核酸构建体
[0173] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制 序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合 适的宿主细胞中的表达。
[0174] 可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载 体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术 是本领域熟知的。
[0175] 该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核 苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表 达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及 杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因 获得。
[0176] 用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例 是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢杆菌 淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀 粉酶基因（amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基 因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（阿盖塞（Agaisse)和勒尔克吕（Lereclus)，1994,分 子微生物学（MolecularMicrobiology) 13:97-107)、大肠杆菌Iac操纵子、大肠杆菌trc 启动子（埃贡（Egon)等人，1988,基因（Gene) 69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基 因（dagA)、以及原核0-内酰胺酶基因（维拉-卡马洛夫（Villa-Kamaroff)等人，1978， 美国科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 75:3727-3731)、以及tac启动子（德波尔 (DeBoer)等人，1983,美国科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特（Gilbert) 等人，1980,科学美国人（ScientificAmerican) 242:74-94的"来自重组细菌的有用蛋白质 (Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)"；以及在萨姆布鲁克（Sambrook)等人， 1989,见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
[0177] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的 实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑 曲霉酸稳定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、 米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶（W0 96/00787)、 镶片镰孢淀粉葡糖苷酶（W0 00/56900)、镶片镰孢Daria(W0 00/56900)、镶片镰孢 Quinn(W000/56900)、米黑根毛霉（Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白 酶、里氏木霉0 -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏 木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内 切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏 木霉木糖苷酶，以及NA2_tpi启动子（一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性a-淀粉 酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代； 非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性a-淀粉酶的基因，其中未翻译的前 导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代）；以及其突变 型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
[0178]在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶（ENO-I)、酿酒 酵母半乳糖激酶（GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH1、ADH2/GAP)、酿 酒酵母丙糖磷酸异构酶（TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白（CUPl)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油 酸激酶。罗马诺斯（Romanos)等人，1992,酵母（Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的 其他有用的启动子。
[0179] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操 作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都 可以用于本发明中。
[0180]用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprH)、地衣芽 孢杆菌a-淀粉酶（amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
[0181] 丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀 菌胰蛋白酶样蛋白酶。
[0182] 用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒 酵母细胞色素C(CYCl)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有 用的终止子由罗马努斯等人，1992,见上文描述。
[0183] 控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加 该基因的表达。
[0184] 适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（W0 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因（化（Hue)等人，1995,细菌学杂志（Journalof Bacteriology)177:3465-3471)〇
[0185] 该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区 域。该子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具 有功能的任何前导子。
[0186] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷 酸异构酶的基因获得。
[0187] 适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶 (EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母a因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油 醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP)。
[0188] 控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列；可操作地连接至该多核苷酸的3' -末端 并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可 以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
[0189] 用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲 霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及 尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0190]有用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列在郭（Guo)和谢尔曼（Sherman)，1995,分 子细胞生物学（Mol.CellularBiol. ) 15:5983-5990 中描述。
[0191] 控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信 号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与 编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5'末 端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编 码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地 替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入 宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
[0192] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编 码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽 孢杆菌0 _内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT、 nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳（Simonen)和帕尔瓦（Palva)，1993,微生物 学评论（MicrobiologicalReviews) 57:109-137 描述了另外的信号肽。
[0193] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽 编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素 酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0194] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母a-因子和酿酒 酵母转化酶。见上文，罗马诺斯（Romanos)等人（1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
[0195] 该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序 列。生成的多肽被称为前体酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原 (zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割 前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌 碱性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT)、嗜热毁丝霉漆酶（W0 95/33836)、米 黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母a因子。
[0196] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的 N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
[0197] 还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽 的表达。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些， 包括调控化合物的存在。原核系统中的调控系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在 酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动 子、米曲霉TAKAa-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是 允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢 叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核 苷酸将与调控序列可操作地连接。
[0198] 表达载体
[0199] 本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组 表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组 表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码 该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核 酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该 载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
[0200] 重组表达载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA 程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载 体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0201] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色 体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自 我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时， 被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用 单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主 细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
[0202] 该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个 或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗 性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0203] 细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗 生素抗性（例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性）的标 记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、 以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺 酶）、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar(草胺膦乙酰转移酶）、hph(潮霉素磷酸转移 酶）、niaD(硝酸还原酶）、pyrG(乳清苷-5' -磷酸脱羧酶）、sC(硫酸腺苷基转移酶）、以 及trpC(邻氨基苯甲酸合酶）、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米 曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus)bar基因。
[0204] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因 组自主复制的一个或多个元件。
[0205] 用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或 该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体 可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一 个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合 的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10, 〇〇〇个碱基对、400至10, 000个碱基对、以 及800至10, 000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此 外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同 源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0206] 对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复 制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语 "复制起点"或"质粒复制子"意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0207] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及pAM|3 1的复制起点。
[0208] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、 ARSl与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
[0209] 在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMAl和ANS1(格姆斯（Gems)等 人，1991，基因（Gene)98:61_67;卡伦（Cullen)等人，1987，核酸研宄（NucleicAcids Res.) 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。AMAl基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建 可根据WO00/24883披露的方法完成。
[0210] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产 生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多 核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在 适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的