专利名称：编码能与早老素相互作用的蛋白质的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的核苷酸和多肽序列及它们的医药应用。具体地讲，本发明涉及编码能与早老素(Presenilin)相互作用的蛋白质的核酸，所述蛋白的制备方法以及含有它们的组合物。
阿尔茨海默氏症是最普遍的痴呆，其全球发病率随年龄而增大，在65岁后为5-10％，到80岁则为20％。
现在还没有针对性的诊疗方法，只能给病人一些减轻痛苦的治疗。这种病只有经死后的脑组织分析才能真正确认，因为缺乏准确的早期诊断方法。
阿尔茨海默氏症与脑器官性损伤相关，包括下列组织学迹象老年斑、神经元神经纤维变性、皮层神经元损失和营养不良。
该病的病因复杂，其中涉及众多基因，参与其中的各种病理生理学机制仍未完全了解。
已报道在65岁以下的病人中观察到的脑的解剖学改变与早老性痴呆相关。现在，“阿尔茨海默氏型痴呆”这一术语包括早老性痴呆(65岁前)及具有相同特征的老年性痴呆(65岁以后)。
该疾病存在两种形式偶发性形式，即与遗传不相关的；和家族形式。
该病的偶发形式最常见，涉及60-90％的病人，最常在65岁以后出现。大部分病例中病因未知。但已确认，颅脑创伤、炎症、情感混乱或高应激状态会增加该病出现的概率(Seubert等，1992)。
该病的家族形式占病例的10-40％。它又分为两组迟发形式(65岁后)和早发形式(65岁前)。在早发性病例中，该病以显性特征和常染色体遗传。
1992年证明在14号染色体上存在AD3基因座，1995年分离出了早老素1(PS-1)基因(开始时该基因被称为S182)(Sherrington等，1995)。在70％的该病特早发形式(55岁前)中涉及早老素1基因的突变。很少有早发形式的病例与位于1号染色体上的早老素2基因的突变相关(Levy-Lahad等，1995)。该基因与早老素1基因有67％的相同性。
该基因由12个外显子形成，外显子3-12编码所述蛋白。它以遍在方式表达并产生2.7kb的主要转录本和7.5kb的次要转录本(Kovacs，1996)。该蛋白含467个氨基酸，呈膜蛋白结构。它具有至少8个潜在跨膜结构域。相应于突变触及密码子的氨基酸分布在整个蛋白中，位于疏水区(TM)，也位于亲水环(BL)中，但有两个特别区TM2和BL6。
现在已报道了35个以上的点突变，迄今鉴定的这些突变几乎都是“错义”型的(即它们导致蛋白质序列上氨基酸的点变化)。但近来报道了影响绞接的其他类型的突变(Perez-T
r等，1995)，在此突变中由于丢失了外显子9而改变了基因。
对早老素在正常细胞中的作用还知之甚少。提出了为数众多的假说，其中一种认为早老素1(PS-1)可能在细胞运输中起作用。该假说得到了免疫细胞化学结果的支持，其中在人类神经胶质瘤细胞的内质网和高尔基体中找到了PS-1(Kovacs等，1996)。另外，PS-1可能在细胞联络和胞吞机制及APP的蛋白水解中有作用(Dewji和Singer，1996)。第三种假说认为PS-1参与与细胞骨架、特别是结合Tau蛋白的微管的相互作用(Lew和Wang，1996)。最后，考虑到其结构，PS-1可能作为与参与信号传导的蛋白G偶联的受体或作为转运蛋白的受体或作为一种离子通道而起作用(Van Broeckhoven，1995)。
对与早老素相互作用的配偶体的研究可能有助于理解早老素的确切作用。
本发明是基于申请人发现了编码能与早老素相互作用之蛋白质的核酸。这种核酸的发现使得可以预计制备出可药用的新的多肽。
因而本发明的第一个主题是编码能与早老素相互作用的蛋白质的核苷酸序列。
根据一种具体的实施方案，本发明的核苷酸序列编码能够与早老素PS-1的大环之全部或部分相互作用的蛋白质或多肽。
更优选的本发明的核苷酸序列含有SEQ ID No.1或其衍生序列的全部或部分或SEQ ID No.2或其衍生序列的全部或部分。
在本发明中，衍生的核苷酸序列指因遗传密码子的简并性而与母序列不同、通过一种或多个遗传和/或化学修饰而获得的任何序列，以及与这些序列或其片段杂交并编码本发明多肽的任何序列。对于遗传和/或化学修饰，可以理解为一个或多个残基的任何突变、替代、缺失、添加和/或修饰。衍生序列还可以理解为来自其他细胞来源、尤其是人源细胞或其他生物细胞的与母序列同源的序列。这种同源序列可以通过杂交实验获得。可以用原序列或其片段作为探针在杂交的可变条件下对核酸文库进行杂交(Maniatis等，1989)。
本发明的核苷酸序列可以是或不是人工来源的，可以是基因组序列、cDNA、RNA序列、杂合序列或合成或半合成序列。这些序列通过例如用以上述序列为基础设计的探针筛选DNA文库(cDNA文库、基因组DNA文库)而获得。这种文库可以按本领域技术人员已知的分子生物学常规方法从各种细胞制得。本发明的核苷酸序列还可以通过化学合成或通过包括对文库筛选所得序列进行化学或酶修饰的混合方法获得。一般而言，本发明的核酸可按本领域技术人员已知的任何方法制备。
本发明的另一个主题是能够与早老素相互作用的蛋白质或多肽。优选地，本发明的肽能够与早老素PS-1的大环和/或早老素PS-2的大环相作用。更优选的肽能与早老素PS-1大环的310-463氨基酸的序列相作用。
在本发明中，早老素包括早老素PS-1和PS-2本身以及特别相应于这些蛋白突变形式的其同源形式。
本发明还涉及包含选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2序列或其衍生序列之肽序列全部或部分的多肽。
在本发明中，衍生的多肽序列指通过一个或多个遗传和/或化学修饰获得的与序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2不同、但具有与早老素相作用之能力的任何多肽序列。对于遗传和/或化学修饰可以理解为对一个或多个残基的任何突变、替代、缺失、添加和/或修饰。
制备这种衍生物的目的多样，例如提高基因治疗效率或降低其付作用，或使其具有新的药物动力学和/或生物学特性。
衍生物还可以理解为来自其他细胞来源、尤其是人类细胞或其他生物体细胞并具有同类活性的与母序列同源的序列。
本发明还涉及上述肽序列的片段。这些片段可以按不同的方式产生。尤其是在本申请所给出的序列基础上利用本领域技术人员已知的肽合成仪通过化学途径合成这些片段。还可以通过遗传途径合成这些片段，例如在细胞宿主中表达编码所希望肽的核苷酸序列。在这种情形中，核苷酸序列可以利用寡核苷酸合成仪在本申请中给出的肽序列和遗传密码子基础上化学合成制得。这种核苷酸序列还可以从本申请给出的序列出发通过按本领域技术人员已知的技术进行酶切割、连接、克隆等，或用以这些序列设计的探针筛选DNA文库来制得。
本发明的另一个主题是本发明的多肽在减弱、抑制、刺激或调节早老素之活性中的应用。
实际上，可以想到利用本发明的蛋白质调节早老素的功能，尤其是抑制或减弱突变早老素的活性。
本发明的另一主题涉及本发明多肽的制备方法，其中将含有本发明多核苷酸序列的细胞在所述序列的表达条件下培养并回收多肽产物。对此，一般将编码所述多肽的部分置于允许其在细胞宿主中表达的信号控制之下。这些信号(启动子、终止子、分泌前导序列等)的选择可根据所用的细胞宿主而不同。另外，本发明的核苷酸序列可构成可自主性或整合性复制的载体的一部分。具体地讲，可利用在所选择的宿主中自主复制的序列制备自主复制性载体。对于整合性载体，例如可利用与宿主基因组某些区域同源的区域(允许通过同源重组整合在载体中)来制备。
本发明还涉及用含本发明核苷酸序列的核酸转化的细胞宿主。可用于通过重组方法产生本发明肽的细胞宿主可以是真核宿主也可以是原核宿主。在适用的真核宿主中，可以举出动物细胞、酵母细胞或真菌细胞。具体对酵母而言，可以举出酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、许旺酵母属或汉逊酵母属的酵母。对于动物细胞，可以举出COS、CHO、C127、人成神经细胞瘤的细胞。在真菌中，尤其可以举出曲霉属或木霉菌属的种类。作为原核宿主，优选使用下列细菌大肠杆菌、芽孢杆菌或链霉菌。
根据一种优选方案，这些细胞宿主有利的代表为用于表达本发明核酸并产生由其衍生的蛋白的重组酵母菌株。
优选地，细胞宿主含有选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列的至少一种序列或序列片段，以产生本发明的蛋白质。
本发明核酸序列的另一应用是制备反义寡核苷酸或可用作药物的遗传反义序列。反义序列是与给定基因的编码链互补的小寡核苷酸，因而能够特异性与转录的mRNA杂交，抑制其翻译成蛋白质。本发明因而涉及能够至少部分抑制能与早老素相作用之蛋白的表达的反义序列。这种序列可通过上文定义的核苷酸序列全部或部分构建，还可以通过断裂等或通过化学合成获得。
本发明的序列可用于基因治疗领域，用于在体内转移并产生反义序列或表达能够调节早老素活性的蛋白质或多肽。对此，这些序列可以整合在病毒载体或非病毒载体中，使其在体内给药。载体可以是一种质粒，其获取方法是本领域技术人员已知的。作为适于本发明的病毒载体，尤其可以举出腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或疱疹病毒类型的载体。本申请的另一主题是含有编码本发明多肽的外源核酸序列的缺陷重组病毒。
本发明还可用于制备能与以上定义的核苷酸序列或相应的mRNA杂交、可用于基因治疗领域的、合成或非合成的核苷酸探针。这种探针可在体外用作诊断工具，以检测早老素或显示遗传异常(错误绞接、多态性、点突变等)。这种探针还可以用于在其他细胞来源、特别是人源细胞中显示并分离编码前述定义肽的同源核酸序列。本发明的探针一般含有至少10个碱基，例如它们可以包含多至前述一种序列或其互补链的全部。优选地，这些探针在其使用前进行标记。为此，可使用本领域技术人员已知的各种技术(放射标记、酶标记等)。
本发明的另一主题是抗前述所定义多肽的多克隆或单克隆抗体或抗体片段。这种抗体可以通过本领域技术人员已知的方法制得。具体地讲，这些抗体可通过用序列选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或其片段或衍生序列的多肽免疫动物、然后采血并分离抗体来制备。这些抗体还可以通过按本领域已知的技术制备杂交瘤而制得。本发明的抗体或抗体片段特别可用于抑制和/或显示早老素与前述定义多肽之间的相互作用。
本发明的另一主题涉及一种鉴定能调节或全部或部分抑制早老素与本发明多肽间相互作用的化合物的方法。
按以下步骤揭示和/或分离本发明多肽的调节剂或配体—将分子或含有不同分子(可以是身份不明的分子)的混合物与如上定义表达本发明多肽的重组细胞，在所述分子对所述多肽具有亲和力时允许所述多肽和所述分子间相互作用的条件下接触，及—检测和/或分离与所述本发明多肽结合的分子。
在一种具体的实施方案中，本发明的该方法用于揭示和/或分离早老素与本发明多肽间相互作用的激动剂和拮抗剂。
本发明的另一主题涉及根据上述方法鉴定和/或获得的配体或调节剂作为药物的应用。这种配体或调节剂可能用于治疗某些神经疾病。
本发明还涉及含有至少一种上文定义的多肽作为活性成分的任何药物组合物。
本发明还涉及含有至少一种上文定义的抗体和/或抗体片段、和/或反义寡核苷酸作为活性成分的任何药物组合物，以及含有至少一种上文定义的核苷酸序列作为活性成分的任何药物组合物。
另外，本发明还涉及这样的药物组合物，其中如上定义的肽、抗体和核苷酸序列或它们的片段之间联合或与其他活性成分联合。
本发明还涉及这样的组合物，其中本发明的核苷酸序列整合在病毒或非病毒性重组载体中。
本发明的药物组合物可用于调节早老素的活性。更具体地讲，这些组合物用于减弱或至少部分抑制早老素的活性，尤其是突变形式的活性。更优选用于治疗神经变性疾病如阿尔茨海默氏症和21三体的药物组合物。
图1.早老素1和用于双杂合试验的部分的图示。图2.通过对带有尤其含克隆C(相应于SEQ ID No.1)和克隆D(相应于SEQ ID No.2)的不同质粒之酵母的营养缺陷型试验分离菌株yBM-C和yBM-D。图3.相应于肽C和D的mRNA在人组织中的表达。图4.所用哺乳动物表达载体的图解。图5.融合蛋白C和D在哺乳动物细胞中的表达。图6(a，b，c).主要载体的图示。
材料和方法1)所用的酵母菌株如下酿酒酵母YCM 79(MATa，ade2，trp1，leu2，lys2，ura3，his3，gal4，gal80，met16∷GAL1/10-URA3 lacZ，HIS3∷GAL7-phleoR).酿酒酵母PCY 2(MATa，Dgal4，Dgal80，ade2，trp1，leu2，lys2，his3 URA3∷GAL1/10-lacZ.酿酒酵母HF7 C(MATa，ura3，his3，ade2，trp1，leu2，lys2，gal4，gal80，canR，URA3∷GAL4结合位点-CYC1-lacZ，LYS2∷GAL1-HIS3).酿酒酵母L 40(MATa，his3，ade2，trp1，leu2，lys2，URA3 ∷ LexA-lacZ，LYS2 ∷LexA-HIS3).2)所用的细菌菌株如下大肠杆菌TG1(F’[traD 36，lacIq，lacZ D M15，proA+B+]，supE，thi-1，D(lac-proAB)，D(hsdM-mcrB)5(rK-mK-McrB-).大肠杆菌BL21(DE3)(F-，ompT，hsdSB (rB-mB-)，gal，dcm，(DE3).
3)用于各种菌株的培养基如下用于酵母的完全YPD培养基—Bacto-酵母提取物(10g/l)(Difco)—Bacto-蛋白胨(20g/l)(Difco)—葡萄糖(20g/l)(Merk)该培养基可以通过加入琼脂(20g/l)固化，在高压釜中110℃下20分钟灭菌。
用于酵母的基本YNB培养基—无氨基酸的Bacto-酵母氮源(6.7g/l)(Difco)—葡萄糖(20g/l)(Merk)该培养基可通过加入琼脂(20g/l)固化，在高压釜中灭菌。营养缺陷型酵母生成所需的氨基酸或氮源随后以50mg/l加入。还以100μg/ml加入氨苄青霉素，以避免细菌污染。
用于细菌的完全LB培养基—Bacto-酵母提取物(5g/l)(Difco)—Bacto-胰蛋白胨(10g/l)(Difco)—NaCl(5g/l)(Difco)该培养基可通过加入琼脂(12g/l)固化并在高压釜中灭菌。加入100μg/ml的氨苄青霉素或卡那霉素以挑选被带有相应抗性标志的质粒转化的细菌。
4)所用的质粒如下载体pGBT9(图6(a))是一种能在细菌大肠杆菌和酵母中增殖并被挑选的5.5kb的穿梭质粒。它具有ColE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因(在大肠杆菌中增殖和选择)以及2mm复制起点和TRP1基因(其合成色氨酸，用于在trp 1-缺陷型酵母中选择)。该质粒用于在酵母中表达GAL4的DNA结合域(DLA)与目的肽的融合蛋白。它在GAL4 DLA区的下游有一个多克隆位点，所有元件均位于编码乙醇脱氢酶的ADH1基因的启动子和终止子之间。GAL4的DLA区含有一个核定位信号序列。
相应于PS-I不同部分的序列插入在EcoR I/Sal I克隆位点中。
载体pGAD10(图6(a))是一种6.6kb的穿梭质粒。它具有ColEl复制起点和氨苄青霉素抗性基因，这使其可在大肠杆菌中增殖和挑选。它还含有酵母复制起点(2mm)和LEU2选择基因，用于分离转化的酵母。在ADHl启动子和终止子之间在GAL4的活化区(DA)编码序列下游有一多克隆位点。GAL4的DA区含有一个核定位信号序列。
该质粒已用于制备商业人脑cDNA文库(Clontech)。cDNA的序列被插入在EcoR I克隆位点上。
载体pLex9(图6(b))是一种5kb的穿梭质粒。作为pGBT9，它具有ColEl起点、AmpR基因、以及2mm复制起点和TRPl基因。但编码DNA结合域的序列是细菌阻抑蛋白LexA的。用于融合蛋白表达的启动子和终止子还是ADHl基因的。LexA的DLA含有SV40的核定位信号序列。
相应于PS-I大环的序列被插入在EcoR I/Sal I克隆位点上。
载体pGEX-4T1(图6(b))是一个4.9kb的细菌质粒。它具有pBR322的复制起点、氨苄青霉素抗性基因、用于抑制β-半乳糖苷酶系统的lac Iq基因。该质粒用于在细菌中表达谷脱甘肽S-转移酶(GST)和目的肽的融合蛋白。它在GST基因的下游有一个多克隆位点用于插入编码肽的序列。所有元件都在可被IPTG诱导的高表达水平启动子tac的控制之下。产生蛋白后，可通过凝血酶切割将目的肽与GST分离，因为在这两个区之间已引入了该酶识别和切割的序列。
载体pET-29a(图6(c))是一种5.4kb的细菌质粒。它具有pBR322复制起点、噬菌体f1的复制起点、卡那霉素的抗性基因、lac I q基因。该质粒用于在细菌中表达与S-Tag序列(S蛋白核糖核酸酶的催化部分)和His-Tag序列(10个组氨酸的肽)融合的目的肽，S-Tag和His-Tag序列有助于检测和纯化融合蛋白。在用IPTG诱导后T7转录启动子可产生强表达。被凝血酶识别和切割的序列已引入到S-Tag和His-Tag序列之间。
5)所用的合成寡核苷酸根据PS-I的序列(Sherrington等，1995)，设计了各种寡核苷酸对，以获得相应于PS-I亲水区的DNA片段。这些寡核苷酸使得在PCR扩增后在序列的5′引入EcoR I位点，在3′引入Sal I位点。
oligoA CAA GAA TTC TGT CCG AAA GGT CCA CTT(SEQ ID N°3)oligoB CAA GTC GAC TCA GGT TGT GTT CCA GTC TCC(SEQ ID N°4)寡核苷酸A和B用于获得源自大环的BL6和BM片段。
oligoC CAA GAA TTC TCA ACA ATG GTG TGG TTG(SEQ ID N°5)oligoD CAA GTC GAC TCA TTC CTC TGG GTC TTC ACC(SEQ ID N°6)寡核苷酸C和D用于获得源自大环更短区域的BR片段。
oligoE CAA GAA TTC ACA TTA TTA CTC CTT GCC(SEQ ID N°7)oligoF CAA GTC GAC TCA GAT ATA AAA TTG ATG CAA(SEQ ID N°8)寡核苷酸E和F用于获得源自PSI C-末端部分的Ct片段。
oligoG CAA GAA TTC ATG ACA GAG TTA CCT GCA(SEQ ID N°9)oligoH AA GTC GAC TCA ATG CTT GGC GCC ATA TTT(SEQ ID N°10)寡核苷酸G和H用于获得源自PSI N-末端部分的Nt片段。
寡核苷酸I.J和K用于对质测pGBT9和pGAD10的插入片段进行扩增和测序。它们分别与GAL4的DLA、GAL4的DA和ADH1终止子的序列互补。oligoI GCG ACA TCA TCA TCG GAA GAG AG(SEQ ID N°11)oligoJ CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CC(SEQ ID N°12)oligoK GGC GAA GAA GTC CAA AGC(SEQ ID N°13)6)分子生物学方法质粒DNA的制备按Maniatis等(1989)中描述的方法进行了质粒DNA的小量和大量制备。热稳定性Taq聚合酶作用下的链式扩增(或PCR)PCR可以在热稳定性酶作用下扩增作为引物的寡核苷酸(约20bp)结合的两个已知区域之间的DNA序列。这些反应在100μl的终体积中进行，其中存在DNA模板(50ng)、dNTP(0.2mM)、PCR缓冲液(10mMTrisHCl pH8.5、lmM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶)、两种寡核苷酸(每种500ng)和2.5IU Ampli Taq DNA聚合酶。将此混合物用2滴石蜡油覆盖以限制样品蒸发。
所用的程序包括32个循环一个循环的模板变性(95℃5分钟)、30个循环(95℃变性1分钟、50℃下寡核苷酸与DNA模板杂交1分钟、72℃Taq聚合酶下延伸1分钟)，最后为一个循环的延伸(72℃5分钟)。
PCR可以在指数生长期的细菌或酵母培养物中直接进行。荧光测序所用的测序技术来自Sanger等(1977)的方法，并经改变适于Applied Biosystems开发的荧光测序。所用的操作是该系统的设计者描述的那些(Perkin Elmer，1995)。通过连接在质粒中插入DNA片段将来自质粒DNA或PCR反应的插入片段和质粒载体在其各自的缓冲液(Biolabs)中以1U/μg DNA用限制酶消化1小时。根据克隆位点选择酶，以将插入片段引入与载体其他结构域相同的读框中。
在0.8％琼脂糖的“制备性”凝胶上电泳按大小分离消化产生的片段，在含0.5μg/ml BET的TBE(90mM Tris，90mM硼酸盐，2mM EDTA，pH8)中进行。在上样于凝胶上分子量标志(1kb阶梯，Gibco BRL)旁之前，向样品中加入上样蓝颜料(体积比1/10)。在TBE中在90伏/cm的恒压下进行迁移。
通过插入在碱基间的BET的荧光在紫外线下显示DNA。用解剖刀切下含有所希望大小DNA片段(载体和插入片段)的凝胶块，放在含TBE的透析袋中，在100伏下电泳15分钟。然后回收凝胶的DNA提取物，用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(isoamylate)(25/24/1)处理，在0.25MNaCl存在下用3体积的无水乙醇沉淀，用70％乙醇洗一次，干燥并最后溶在20μl水中。
在凝胶上估测载体和插入片段各自的量以后，将其以1/1的比例在40IU T4 DNA连接酶、1X最终连接缓冲液(50mM TrisHCl pH7.5，10mMMgCl2，10mM DTT，1mM ATP)存在下混合在20μl总体积中。在20℃下连接至少一小时。质粒对细菌的转化1)称为“TSB”的方法(根据Chung和Miller，N.A.R，第16卷，1988)为经DMSO处理使细菌细胞壁脆化，允许DNA进入细胞内。其效率为106转化子/μg DNA。在LB培养液中搅拌下培养细菌约3小时(至A600＝0.6)。以3000rpm离心培养物10分钟，将沉淀用1/10原体积的TSB(LB培养液，10％PEG4000，5％DMSO，10mM MgCl2，10mM MgSO4)溶解，在4℃保温15分钟。向100μl感受态细菌中加入约50ng DNA(对连接产物为10μl)，然后将混合物在4℃保温30分钟。加入TSBglu(TSB，20mM葡萄糖)并于37℃保温45分钟后，将细菌铺在含有质粒所带抗性基因相应的抗生素的LB培养基上。
2)电穿孔是效率为TSB方法的1000倍的一种技术，当只有很少量DNA时(如提取酵母中所含质粒后)使用这种方法。它是通过电击使细菌细胞壁脆化以在细胞中引入DNA。
将细菌在LB液体培养基中搅拌培养至A600＝0.6。将4℃下预保温15分钟的该培养物以3000rpm离心10分钟，沉淀依次用1体积冰水、1/2体积冰水和1/5体积冰冷的10％甘油洗涤。在每次洗涤间，将细菌以3000rpm离心10分钟，最后收集在1/1000体积的冰冷的10％甘油中。在电穿孔杯中混合40μl该细菌悬液和1μl DNA。将此杯置于GenePulser BioRad中以使细菌经受电击(25mF，2.5kV，200W)。37℃培养45分钟后，将细菌铺在含有用于选择的抗生素的LB培养基上。转移至膜上后mRNA的杂交(或Northern印迹)所用的膜是商业硝基纤维素膜Clontech，其中已转移并固定了源自人各种组织的mRNA。
放射活性DNA探针按以下方法制备“Rediprime DNA标记系统”Amersham。该方法可以在37℃保温10分钟后获得DNA片段中大于55％的[32P]dCTP(50mCi)掺入率，在杂交2小时后可以检测到相应于0.5pg的RNA带，在杂交过夜后可进行放射自显影。
将膜于42℃搅拌下与8ml杂交溶液(1M NaCl，10mM NaH2PO4pH7.4；10mg/ml Ficoll，10mg/ml聚乙烯吡咯烷酮，10mg/ml BSA，100mg/ml鲑鱼精子DNA，2％SDS)预杂交约2小时，然后在42℃搅拌下与混合在8ml杂交溶液中的2×106cpm/ml的探针杂交24小时，然后用洗涤溶液1(0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠pH7，0.05％SDS)冲洗多次，在此相同溶液中洗涤40分钟，50℃下在洗涤溶液2(15mM NaCl，1.5mM柠檬酸钠pH7，0.1％SDS)中保温40分钟，最后进行放射自显影。
7)双杂合系统的方法系统原理由Song和Fields从1989年开发的双杂合系统是一种通过体内相互作用进行的酿酒酵母中的克隆技术。它是基于这样的事实某些反式激活性真核细胞只需要两个功能域即可起作用DNA结合功能域(DLA)(其与特异性序列结合)和活化功能域(DA)(它动员转录机器，RNA polII)。当这两个功能域被分离时，DA不能正确定位，不能诱发转录。
在该系统中，DLA与蛋白X融合，DA与蛋白Y融合。如果蛋白X和Y能相互作用，则形成功能性反式激活复合物，并诱导置于DLA所识别序列下游的报道基因的表达。该基因的表达可间接揭示两种蛋白间的相互作用。一个或两个不同质粒对酵母的转化按Gietz(Gietz等，1995)描述的方法用LiAc/PEG处理使酵母转变为感受态。
酵母在YPD固体培养基上28℃培养过夜，然后重悬在1ml无菌溶液I(0.1M LiAc，10mM TrisHCl，1mM EDTA pH7.5)中，以3000rpm离心1分钟，再次重悬在1ml溶液I中。然后将50μl悬液与5μg鲑鱼精子DNA(引导DNA)、1-5μg质粒DNA和300μl无菌溶液II(0.1MLiAc，10mM TrisHCl，1mM EDTA pH7.5，50％PEG4000)混合。将混合物28℃保温30分钟，然后在42℃热处理20分钟。以3000rpm离心1分钟后，用无菌水洗涤细胞一次，重悬在100μl无菌水中。然后将酵母铺在加有其生长所需氨基酸和氮源的琼脂固化的YNB培养基上。为了能选择转化的酵母，不加入相应于选择标志的氨基酸和氮源。将培养皿置于28℃恒温箱中3天。cDNA文库对酵母的转化所用的文库为商业文库(Clontech)，从一个正常人(37岁男子，脑创伤后死亡)脑的mRNA构建而成。这些cDNA已克隆在质粒pGAD10中GAL4的DA区下游的EcoR I位点上。插入片段的平均大小为1.4kb，标准偏差为1kb。文库在大肠杆菌DH5a中扩增一次，获得1.2×106个独立克隆，其中80％含有一个插入片段。
为了保持文库的良好代表性，需要有2-10倍于构建文库时所获独立克隆数的转化子数目。因此我们采用了能获得良好转化效率(约107个转化子/100μg DNA)的操作方法。
以含PS-I一个区相应序列的质粒pGBT9预转化的酵母YCM79在50ml培养基YNB+His+Lys+Ade+Met+Leu+Ura中28℃振荡培养过夜。测定该预培养物的光密度，以评价每毫升中的细胞数，从而计算在250ml YPD培养液中的接种体积，以在28℃振荡培养过夜后获得107细胞/ml的培养物(约A600＝0.8)。
然后以3000rpm离心10分钟收集细胞，用100ml无菌水洗2次，重悬在10ml转化溶液I中。将此悬液以3000rpm离心10分钟，将细胞重悬在2.5ml同样的溶液中。取部分悬液(200μl)一半用作未转化的阴性对照，另一半将用已知转化效率的对照质粒转化。剩余的悬液与100μl 1mg/ml的cDNA质粒文库和20ml溶液II混合。该混合物于28℃振荡培养1小时，然后42℃20分钟，再以3000rpm离心15分钟。细胞沉淀用水洗一次，用PBS洗2次，以彻底去除对酵母有毒性的PEG，然后收集在2.5ml无菌PBS中(50mM Na2HPO4，10mM KCl，1mMMgSO4，pH7)。
用该悬液接种250ml培养基YNB+His+Lys+Ade+Met+Ura，28℃振荡培养4小时，让杂合蛋白表达、可能的话它们相互作用、及报道基因URA3表达。但该步骤会造成阳性克隆数目的扩大。为了评价菌落数目的扩增率，在该培养前后各取1ml培养液，将各种稀释液铺在琼脂固化的培养基YNB+His+Lys+Ade+Met+Ura上。生长后，测定Leu+Trp+克隆的数目，以评价培养期前后的转化频率及从中推定的扩增率。
然后将细胞以3000rpm离心10分钟，用无菌水洗两次，重悬在10ml YNB中并铺在10个435cm2的培养皿中，每个含有200ml选择培养基YNB+His+Lys+Ade+Met。将这些培养皿置于28℃恒温箱中3天。酵母质粒DNA的提取该技术不但可提取质粒，还可以提取酵母中所含的基因组DNA。为了分离质粒，只需转化仅质粒DNA可在其中复制的细菌，分析小量制备后的每个克隆。含有质粒的酵母在选择性YNB固体培养基上28℃培养过夜。然后重悬在200ml裂解溶液中(2％Triton X100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris pH8，1mM EDTA)，其中存在玻璃珠(直径450μm)和200ml苯酚/氯仿。将混合物涡旋振荡15分钟，然后以14000rpm离心2分钟。水相在膜上透析1小时。该溶液可用于电穿孔转化细菌。β-半乳糖苷酶活性的揭示该试验能验证转化的醇母中编码β-半乳糖苷酶的报道基因LacI的表达。
将一张硝酸纤维素膜放在这些单个的酵母克隆上。将该复制片浸在液氮中3次30秒钟，以破坏酵母并能触及β-半乳糖苷酶的底物。然后将该膜菌落朝上置于一张浸有即时配制的PBS/Xgal溶液(100μl 40mg/ml的底物Xgal的二甲基甲酰胺溶液于5ml PBS中)的Whatman滤纸上，然后置于所测酶活性的最佳温度37℃下。
出现揭示β-gal活性的蓝色的时间差异很大，从几分钟到几小时不等。该试验在阳性作用对照(迅速变蓝色)和阴性对照(保持白色)存在下进行。液滴试验该试验可以分析酵母菌株的表型。将一滴(约5ml)稍混浊的酵母悬液置于各种琼脂化的选择性或非选择性培养基上，28℃培养2天后观察酵母的生长。质粒的分离这是在转化酵母的表型与质粒的存在良好相关时的质粒分离试验。
将酵母在YPD完全培养基上28℃培养过夜。这种非选择性培养基允许细胞分裂后保留或不保留质粒的酵母生长。将该培养物的不同稀释液铺在YPD培养基上，以在28℃培养过夜后获得50-100个克隆/培养皿。然后通过用丝绒在各种选择性培养基上复制测定克隆的表型，可在28℃培养2天后估测不含质粒之细胞的几率。
8)体外相互作用试验的方法试验原理这是利用亲和层析的生化技术验证两种蛋白间的相互作用。将含有某蛋白的推测配偶体的细胞提取物加至预先固定了诱饵蛋白的载体中。如果存在该蛋白与其可能配偶体之间的相互作用，该配偶体本身也将保留在载体上。大肠杆菌中融合蛋白的表达融合蛋白是在大肠杆菌BL21(DE3)中借助于表达载体和可被IPTG诱导的pGEX(Studier，1991)而制得。
预先用重组质粒转化的细菌BL21(DE3)在含选择用抗生素(对pGEX为氨苄青霉素，对pET为卡那霉素，100μg/ml)的LB培养液中振荡培养过夜。将5ml该预培养物接种在45ml LB培养基+抗生素中，以在37℃振荡1小时后获得A600＝0.6的培养液。加入0.1mM IPTG诱导蛋白的产生，将细菌置于37℃振荡下1-4小时。以6000rpm离心5分钟收集表达蛋白的细胞。沉淀物于-20℃保存。细菌中所产生蛋白的提取和分析将含有融合蛋白的细菌沉淀重悬在5ml TE中(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA)。用终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶和1％Triton X-100溶解细胞。30℃保温15分钟，然后放在冰上进行超声处理直到细菌悬液变成液体。以10000rpm 4℃离心细菌溶解液15分钟。含有可溶性融合蛋白的上清液可在-20℃下保存。
在此阶段，在变性凝胶(SDS PAGE)上电泳分析所得到的各个部分。取60μl离心前的细菌悬液(全样)、60μl上清液(可溶部分)及60μl重悬于5ml TE中的沉淀(不溶部分)。将各部分中所含蛋白在1/4体积的上样蓝(0.2M TrisHCl pH6.8，5％SDS，5％甘油，0.5％α-巯基乙醇，溴酚蓝)存在下95℃变性10分钟，上样于12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳按分子量分离蛋白。在125伏/厘米下迁移后，通过考马斯蓝对凝胶染色检测蛋白。蛋白的溶解当外源基因在大肠杆菌中表达时可能出现外源蛋白的聚集物，形成包涵体。这样易于通过离心纯化重组蛋白，但蛋白经常难以溶解。
将处于不溶性部分中的蛋白用6M脲和10mM DTT 37℃变性10分钟，然后相继在三个缓冲液中透析来复性(5mM TrisHCl pH8/2M脲；5mM TrisHCl，pH8/1M脲；5mM TrisHCl，pH8)，每次至少6小时。以10000rpm离心15分钟后，约5-10％的蛋白见于上清液中，于-20℃保存。亲和层析为了在良好条件下进行蛋白的保留，样品的蛋白浓度应大于40mg/ml。该浓度可用比色法(如Bradford反应)测定。
将含有非融合GST或GST-BM(早老素1的突变环)的可溶部分200μl在300μl“谷脱甘肽树脂”存在下20℃保温2分钟。除去未保留在树脂珠上的部分。用洗涤缓冲液(20mM TrisHCl pH8，150mM NaCl，0.1％Triton X100)洗树脂4次，以除去因非特异性吸附而固定的蛋白质。将连有GST或GST-BM的树脂150μl在4℃下与600μl含STag或STag-Pep126的可溶部分振荡保温1小时。然后以3000rpm离心琼脂糖珠粒1分钟，在去除非保留部分后用洗涤缓冲液洗4次。
将每个部分(可溶、被珠粒保留和不保留的部分)的试样在上样蓝存在下上样于95℃变性后的SDS PAGE凝胶上，电泳分离。然后将这些蛋白转移到硝基纤维素膜上，膜用丽春红(Ponceau)(20μg/ml)染色以验证蛋白已被良好转移。
为了特异性检测与S-tag融合的蛋白，将硝基纤维素膜用TBST(10mM TrisHCl pH8，150mM NaCl，0.1％Tween 20)中的1％明胶饱和15分钟，并与连有碱性磷酸酶的蛋白S一起保温。用TBST洗涤4次后，按Novagen的方法加入含NBT和BCIP的1X PA缓冲液揭示碱性磷酸酶的活性。
9)在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的方法哺乳动物细胞表达载体的构建为了在哺乳动物细胞中表达，按常规方法将序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2亚克隆到一载体中，处于强病毒启动子(CMV)控制之下。细胞的转染对COS1细胞或CHO细胞建立的方法是，以与DNA 1比8的比例(重量/重量)使用一种脂转染剂和相同比例的一种合成多肽(H1)以优化DNA的紧密度和转染效率。该方法尤其依赖于DNA中磷酸根的电荷被脂转染剂正电荷的中和。
COS1细胞在含4.5g/l葡萄糖并补有3％L-谷氨酰胺、1％青链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养液(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium)中在95％湿度和5％CO2的37℃孵箱中培养。
在转染的前一天夜，以2.5×106细胞/100mm培养皿的密度接种细胞。转染的当天，细胞用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗2次，用OptiMEM(专利组合物，Gibco-BRL)洗一次以在孵箱中适应至少15分钟。
对100mm培养皿而言，向300μl OptiMEM和64μg合成肽(H1)中共加入8μg质粒DNA。在剧烈涡旋10秒钟后，等5分钟再向上述混合物中加入稀释在300μl OptiMEM中的脂转染胺(32μl，即64μg)。将混合物再次剧烈涡旋，然后静置30分钟。每管加入5mlOptiMEM，涡旋后的混合物置于细胞上(其上已预先加了培养基)。然后将细胞置于孵箱中4小时，其间用完全培养基置换其中的混合物。细胞溶解和蛋白的测定细胞通常在转染后48小时进行溶解(一般表达水平最高)。裂解缓冲液含有10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，1％Triton X100，1％NP40和混合蛋白酶抑制剂(Complete，Boebringer-Mannheim)。在用PBS清洗后，向每板中加入800μl冷缓冲液。然后对裂解液进行超声处理，再于4℃下磁棒搅拌过夜。以15000xg离心30分钟分离沉淀和上清液。
然后按BCA试剂盒(Pierce)测定可溶性蛋白，以便为以后的实验建立标准曲线。免疫转移样品(细胞裂解液)在等体积的上样缓冲液(125mM Tris pH6.8，4％m/v SDS，20％甘油，0.02％溴酚蓝，50mM二硫苏糖醇)中95℃变性5分钟。为了分析早老素的表达，样品在8M脲存在下变性，以避免95℃下早老素自身的聚集。
将样品点在Tris-甘氨酸凝胶(Novex)上，其中丙烯酰胺的百分比根据待分辨的分子量而不同。分子量标记也点在胶上(Broad Range，BioRad)。在100伏恒压下在1X最终SDS缓冲液(Novex)中迁移2小时。然后在恒定150mA下凝胶向硝基纤维素膜或PVDF膜上转移约2小时(1X最终转移缓冲液(Novex)加10％甲醇)。
转移后，膜在含2％脱脂奶粉(Merck)的50ml PBS-T(PBS加0.5％Tween)中室温封闭2小时。加入第一抗体(用有或无2％脱脂奶粉的PBS-T稀释至1/1000至1/5000的最佳浓度)后，4℃放置一夜。用PBS-T简单冲洗后，将膜在第二抗体(与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或抗兔IgG，视情况而定)存在下保温45分钟，第二抗体在称为“ECL”的缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween)中稀释至1/5000。
然后将膜在“ECL”缓冲液中冲洗4次15分钟。通过ECL反应(Amersham)，即以等体积即刻混合两种缓冲液来显示。对不同的照相底片进行曝光，然后冲印。实施例实施例1通过筛选大脑cDNA融合文库分离PS1的特异性配偶体为了分离PS1蛋白的特异性配偶体，利用双杂合技术筛选了人脑cDNA文库。使用了与GAL4的DA融合的cDNA文库，将PS-I的亲水区与GAL4的DLA融合构建了各种诱饵蛋白。1.1构建GAL4的DLA与PS1亲水区融合蛋白的表达载体利用pGBT9载体制备了5种融合蛋白，在该载体中在GAL4的DLA序列相同读框中引入了相应于PS1不同亲水区的序列。选择它来鉴定能与蛋白的N-末端区(Nt，密码子1-81)、大环(BL6，密码子263-407)、带有L286V突变的大环(BM)、大环的短区(BR，密码子290-376)及最后C-末端部分(Ct，密码子421-467)相互作用的蛋白质。
通过PCR从PS1 cDNA的全序列获得了相应于这些不同区的DNA片段。所用的不同寡核苷酸使得可以在每个扩增序列的末端引入EcoRI和Sal I位点。因此，这些PCR片段可被插入在pGBT9的多克隆位点的EcoR I和Sal I位点间，位于GAL4的DLA下游并在同一读框中。通过DNA测序证实了所得的各种构建物，pGBT-Nt、pGBT-BL6、pGBT-BM、pGBT-BR和pGBT-Ct。这种验证表明，这些片段不带有由PCR造成的任何突变，并与GAL4的DLA序列完全处在同一个开放读码框架中。1.2获得表达GAL4 DLA与PS1亲水区融合蛋白的酵母菌株由于酵母被两个不同质粒共转化是比被仅一个质粒转化概率低的事件，使用了预先用编码诱饵蛋白的载体转化的酵母菌株，以在筛选cDNA文库时具有可能最好的效率。
为此，用pGBT-Nt、pGBT-BL6、pGBT-BM、pGBT-BR和pGBT-Ct中每一种质粒转化酵母菌株YCM79。含有这些质粒的酵母在不含有色氨酸的培养基上选择具有Trp+表型的含这些质粒的酵母，并分别称为yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt。利用位于插入片段5′和3′的DLA和tADH1序列的互补寡核苷酸对酵母直接进行PCR来验证每个菌株中存在各种质粒。所得PCR片段的大小可用于区别各种菌株，但yBL6和yBM除外。1.3含PS1亲水区的融合蛋白的反式激活活性和与GAL4 DA相作用的试验如果融合蛋白具有反式激活作用或如果它与GAL4的DA相作用，它不能用作双杂合系统中的诱饵蛋白，因为它在任何蛋白-蛋白相互作用之外产生系统性阳性反应。
因而第一个试验是验证PS-I的各亲水区当与GAL4的DLA融合时不具有反式激活作用，该作用为其自身能引起报道基因的转录。这种活性例如与融合蛋白中酸性结构域的存在有关。
为此，直接检测了菌株yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt中报道基因LacZ和URA3的表达。
第二种试验是确定融合蛋白与GAL4的DA间无相互作用。为此，具有Trp+Leu+表型的菌株yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt用编码GAL4的DA的质粒pGAD424(与pGAD10相当)转化。在不含色氨酸和亮氨酸的培养基上选择酵母，对所得克隆测定报道基因LacZ和URA3的表达，这可监控所述相互作用。
两种情况下，β-半乳糖苷酶活性试验和无尿嘧啶的选择性培养基上液滴试验的结果均为阴性。
含有PS-I亲水部分的融合蛋白因而不具有内在的反式激活特性，不能与GAL4的活化域相互作用。它们因而可用作文库筛选的诱饵蛋白。1.4 cDNA融合文库对各种酵母菌株的转化融合文库的筛选可以鉴定表达与诱饵蛋白相作用之GAL4 DA融合肽的克隆。如果存在这种相互作用，它应能重建功能性反式激活蛋白，诱导含诱饵蛋白的菌株中报道基因URA3和LacZ的表达。
为了使筛选具有代表性，需要每个含有文库的独立质粒含于至少一个转化后的酵母中。为此，使用了理论上可使转化子数目大于文库独立质粒数目的方法(参见材料和方法)。
表型为His-、Lys-、Ade-、Met-、Ura-、Leu-的5个菌株yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt相继用100μg融合文库质粒DNA转化，转化的细胞在YNB+His+Lys+Ade+Met培养基上挑选。
第一次挑选后我们得到了32个Ura+表型的yNt菌株的克隆，450个Ura+表型的yBL6克隆，126个yBM、250个yBR和67个yCt克隆。对这些转化子进行β-半乳糖苷酶活性试验，以验证第二个报道基因LacZ的表达。共有6个克隆具有Ura+、β-gal+双重表型一个yNt克隆，一个yBL6克隆，yBM和yBR菌株各2个克隆，yCt菌株没有。这些克隆分别称为yNt.A、yBL6.B、yBM.C、yBM.D。实施例2文库质粒的分离为了鉴定能与PS1的突变环或短环相作用的蛋白，提取了酵母yBM.C和yBM.D中所含的质粒。DNA制备物中的这些质粒用于通过电穿孔转化细菌。
从所获细菌克隆提取的质粒用不同的酶消化。这种分析揭示了5种不同的限制酶切方式。
从酶母yBM.C和yBM.D所提取质粒的消化与质粒pGBT-BM有共同的模式，而含有2900bp SEQ ID No.1相应插入片段(来自菌株yBM.C的pGAD-C)和1400bp SEQ ID No.2相应插入片段(来自菌株yBM.D的pGAD-D)的质粒pGAD10具有两种不同的模式。2.1检验经转化不同酵母菌株所分离的质粒当由脑文库的质粒转化酵母时，有可能多个不同质粒被引入同一个细胞中。为了证实相互作用的结果确是由于所方离的质粒存在而引起的，而不是由于多余的质粒，我们又在菌株YCM79中而且在菌株HF7C和PCY2中试验了对PS-I不同亲水区筛选文库得到的融合蛋白。
HF7C具有两个报道基因HIS3和LacZ。LacZ基因具有不同于菌株YCM79中的启动子环境，这使得可以验证β-gal+克隆的获得与特定的启动子环境无关，而与所试验蛋白质间的相互作用相关。PCY2的优点是只有一个报道基因LacZ，其表达在反式激活蛋白GAL4有功能时在该菌株中比在其他两个菌株中要强。
我们用不同的质粒对pGBT-X/pGAD-Y(X代表Nt、B16、BM、BR或Ct；Y代表C或D)、pGBT9/pGAD424(阴性相互作用对照)和pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65(阳性相互作用对照)(Russo等，1995)转化了三个酵母菌株YCM79、HF7C和PCY2。我们试验了每次转化产生的3-5个克隆的营养缺陷型和β-gal活性。培养皿的结果示于图2中。
考虑到试验敏感性的差异，当转化的酵母YCM79和HF7C在无尿嘧啶或无组氨酸的选择性培养基上生长就可证实相互作用，即它们确实表达其至少一种报道基因。
反应的强度(菌落蓝色的强弱，生长的多少)假设与报道基因的表达率成比例。表达率的差异可以按不同的方式解释。低表达率可能是由于重建反式激活蛋白GAL4的蛋白间相互作用弱造成的。这也可能是由于使复合物的形成不稳定的第三种蛋白的参与，或由于融合蛋白在酵母中不稳定，或由于酵母的状态造成的。这些酵母可能处于弱转录活性的状态，例如与外源蛋白的毒性问题有关。
已分离的脑文库融合蛋白不与PS1的N-末端部分和C-末端部分相作用。但这些蛋白看来都与亲水区BL6、突变的亲水区BL6(BM)以及该区的截短形式(BR)相作用。2.2文库融合蛋白与不含PS1环的蛋白间相互作用的试验该试验可以确定来自文库的融合蛋白是否通过其结构、电荷、疏水性非特异性地与诱饵蛋白(III型假阳性)或GAL4的DLA相作用(II型假阳性)。
我们用下列质粒对转化了菌株YCM79、HF7C和PCY2pGBT9/pGAD-Y(Y代表C或D)、pGBT-LAM/PGAD-Y、pGBT9/pGAD424(阴性对照)和pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65(阴性对照)。pGBT9只编码GAL4的DLA，而由Clontech提供的pGBT-LAM编码GAL4 DLA与核纤层蛋白的融合蛋白，后者非特异性地与其它蛋白的疏水区相作用。
其结果是如此转化的酵母无一能够表达其报道基因。例如，酵母YCM79具有Ura-、β-gal-表型，酵母HF7C均为His-、β-gal-表型，酵母PCY2为β-gal-表型。
这些结果提示如此分离的文库融合蛋白特异性地与PS-I的亲水BL6区相作用，不与核纤层蛋白或GAL4的DLA结合。2.3含PS1环编码区的载体pLex9所转化酵母的相互作用试验该试验保证蛋白的相互作用不是由于BL6各种片段在与GAL4 DLA融合时才采取的结构的结果。
为了证实这一点，将BL6和BM片段与另一DLA融合，即细菌阻抑蛋白LexA的DLA。制备了两种补充的质粒构建体(pLex-BS和pLex-BM)，其中亲水环BL6和其突变形式在质粒pLex9的EcoR I/Sal I位点与LexA基因融合。
然后转化酵母L40，其中通过在LexA的操纵子位点上结合DLA-LexA/DA-GAL4复合物而诱导报道基因HIS3和LacZ的表达。测试了与下列质粒对的相互作用pLex-BL6/pGAD-Y(Y为C或D)、pLex-BM/pGAD-Y、pLex-RAS/pGAD-RAF(相互作用阳性对照)(Vojtek等，1993)如pLex-RAS/pGAD424、pLex-BL6/pGAD424、pLex-BL6/pGAD-RAF、pLex-BM/pGAD424、pLex-BM/pGAD-RAF(相互作用阴性对照)。
无组氨酸选择性培养基上液滴试验的结果和β-gal活性试验的结果对于含pLex-BL6质粒的菌株为阳性，与所试验的pGAD-Y质粒一样。对于含pLex-BM的菌株也是如此，与试验的pGAD-Y质粒一样。该试验表明所观察到的相互作用与PS-I BL6区与GAL4 DNA结合域融合时采取的特定构象无关。实施例3鉴定所筛得质粒的插入片段3.1质粒pGAD-C和pGAD-D插入片段的测序对质粒pGAD-C和pGAD-D的插入片段进行了全部测序。我们利用GAL4的DA及tADH1的互补寡核苷酸开始测序，以便揭示每个插入片段头尾的序列。然后，我们从每个序列的末端构建了合成寡核苷酸，从而得以在两条链上向序列中前进。以此方式，我们测出了插入片段D的共1400bp的序列，相应于SEQ ID No.2的序列。而对于2900bp的插入片段C(SEQ ID No.1的序列)，需要建立限制性图谱，然后将各片段克亚隆，以获得总序列。
插入片段D在其总序列上为一开放读码框架(SEQ ID No.2)。而插入片段C在序列末端含有一终止密码子(SEQ ID No.1)。
它们的肽序列显示出偏亲水性的形象，这与筛选方法的选择一致，该方法更适用于亲水性蛋白质。3.2序列比较该比较应能得知这些插入片段是否编码功能已知的肽结构域。
将插入片段的核酸序列及肽序列与数据库“Gen Bank”和“EMBL”(欧洲分子生物学实验室)中的序列进行了比较。在这些插入片段和这些数据库中登记的基因(或蛋白质)间没有发现任何显著的相似性。
还在插入序列之间进行了比较，它们没有任何相似性。
另外，还研究了可能带来插入片段所编码肽之功能信号的肽基元的存在。发现了几个潜在的糖基化、磷酸化和十四烷基化位点，但这不足以提出关于这些肽可能功能的假说。3.3所选肽相应的mRNA在各种人组织中的表达为了证实体内存在这些肽与PS1相互作用的观点，现证明从文库所分离肽mRNA的表达与PS1 mRNA的表达处于相同的组织中。研究了含所分离序列的基因在特定组织中的表达，用Northern印迹法分析了插入片段C和D相应mRNA在各种人组织中的表达率。
从插入片段C(SEQ ID No.1)制备的放射活性探针与在脑中特异性表达的9.5kb mRNA杂交，该mRNA更特别是在大脑皮层、额叶和颞叶中表达(参见图3)。该mRNA的大小提示所翻译的蛋白分子量大。实施例4体外相互作用试验从该试验可知这种相互作用与酵母环境无关。功能性反式激活蛋白GAL4的重建不总是由于两种蛋白质间的直接相互作用，也可能是在融合蛋白与一种或多种酵母内源性蛋白间形成蛋白复合物的结果。例如，相互作用只有存在来自酵母的中间蛋白时才存在，在此环境之外则不存在。
因此决定在一无细胞系统中证实PS1的亲水区BL6和分别称为PepC和PepD的所分离肽间的相互作用。
在大肠杆菌BL21(DE3)中产生这些蛋白以大量获得。两种分离的肽已与用于检测和与支持物结合的肽标签融合。为此，选择将GST蛋白(其与谷胱甘肽结合)与各种形式的BL6融合，将S-tag肽(被S蛋白特异性识别)与所分离肽融合(试验原理参见材料和方法部分)。4.1 S-tag与cDNA文库筛选分离的肽间融合蛋白的产生为了构建S-tag与两种肽PepC和PepD间的融合蛋白，来自质粒pGAD-C和pGAD-D的各EcoR I/EcoR I片段被插入在载体pET-29a中S-tag序列的同一读码框架中。
在此步中得到了含PepD相应插入片段的质粒(pET-D)。质粒的部分测序表明已在所希望的读框中实现了插入。
用此质粒可获得相应于STag-PepD融合蛋白的52kDa的蛋白质。在细菌BL21(DE3)中用IPTG诱导后产生了蛋白STag-PepD。4.2 GST和PS1亲水环间融合蛋白的产生为了将GST与PS1亲水区BL6三种形式之一融合，使用了载体pGEX-4T1，向其中引入来自质粒pGBT-BL6、pGBT-BM和pGBT-BR的EcoRI/Sal I片段。
获得了相应于PS-I突变环的质粒pGEX-BM。测序表明插入是发生在GST序列的读码框架中。
用此质粒得以在细菌BL21(DE3)中在IPTG诱导后产生42kDa的融合蛋白GST-BM。4.3融合蛋白GST-BM的溶解在细菌溶解后，蛋白GST-BM完全保留在不溶部分，而STag肽以及蛋白STag、PepD和GST部分处于可溶部分。
融合蛋白的溶解对于实现亲和层析是绝对必要的。首先将蛋白GST-BM特异性结合在谷胱甘肽(其以共价方式与琼脂糖珠粒偶联)树脂上，以便随后测定GST-BM与融合在STag上的PS1的肽配偶体间的相互作用(参见材料和方法)。如果蛋白不能被溶解，在无任何特异性结合的情况下与珠粒一起沉淀。
融合蛋白GST-BM溶解后，按材料和方法部分第8段描述的条件进行试验。实施例5PS-I特异性配偶体在哺乳动物细胞中的表达5.1适宜表达载体的构建该试验用于证实在酵母中揭示的蛋白相互作用是否也能在哺乳动物细胞环境中检测到，其中插入的PS1全蛋白在其膜环境中。将配偶体的序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2亚克隆在哺乳动物细胞表达载体pCDNA3中，其还带有5′端的表位myc相应序列和允许与配偶体序列同框亚克隆的限制位点EcoR I(图4)。
分离pGAD-D的1400bp EcoR I限制性片段并同框亚克隆在表达载体的EcoR I位点中。通过限制酶分析选择了以正确取向含有cDNA的构建物。
对于克隆C，首先分离了pGAD-C的EcoR I(1)-HindIII(391)片段。然后通过部分消化分离了第二个片段HindIII(392)-Msc I(2892)(该后一游离末端位点位于载体pGAD10中克隆C的编码区下游)。将片段EcoR I(1)-HindIII(391)和HindIII(392)-Msc I(2892)与经EcoRI和EcoRV(后一位点为游离末端)消化的表达载体连接在一起。通过限制酶分析确定了含有全部C编码序列的正确构建体。
这些构建体可用于产生含有myc表位和分别相应于序列SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2的肽的融合蛋白。5.2哺乳动物细胞中的表达按标准方法将这些构建体转染到COS1细胞中。细胞溶解后，通过免疫转移和抗myc抗体的显示分析样品。通过利用抗Myc抗体9E10的免疫转移检测到了配偶体的表达(图5)。我们还检测到对pepC所预期的很强的120kDa带，表明为强表达(泳道C)。对于D，检测到的条带强度不总是一致的。在CHO细胞中的表达可以检测到。在该类型的细胞中，D可能稍稳定些，显示为迁移至80kDa的蛋白(泳道D)。
因此，这两种蛋白可以在哺乳动物细胞中被表达并检测到。
序列表(1)一般信息(1)申请人(A)名称RHONE-POULENC RORER(B)街道Raymon Aron大街20号(C)城市Antony(E)国家法国(F)邮编92165(G)电话0155716922(H)传真0155717291(ii)发明名称编码能与早老素相互作用的蛋白质的核酸(iii)序列数目2(iv)计算机可读形式(A)载体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作程序PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)长度2892碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟非(iv)反义非(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..2736(xi)序列描述SEQ ID No.1CGG ATG ATT CCC ATC TTT CAT GAC ATG ATG GAC TGG GAG CAG AGA AAA48Arg Met Ile Pro Ile Phe His Asp Met Met Asp Trp Glu Gln Arg Lys1 5 10 15AAT GGC AAC TTC AAA CAG GTG GAG GCC GAG TTG ATT GAC AAG CTG GAC96Asn Gly Asn Phe Lys Gln Val Glu Ala Glu Leu Ile Asp Lys Leu Asp20 25 30AGC ATG GTG TCA GAA GGG AAA GGT GAC GAG AGC TAC AGG GAG CTC TTC144Ser Met Val Ser Glu Gly Lys Gly Asp Glu Ser Tyr Arg Glu Leu Phe35 40 45AGC CTA CTA ACC CAG CTG TTT GGG CCC TAC CCC AGC CTG CTG GAG AAG192Ser Leu Leu Thr Gln Leu Phe Gly Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Lys50 55 60GTT GAA CAA GAA ACA TGG CGC GAG ACC GGC ATT TCC TTT GTG ACC TCA240Val Glu Gln Glu Thr Trp Arg Glu Thr Gly Ile Ser Phe Val Thr Ser65 70 75 80GTC ACC CGC CTC ATG GAA CGT CTT CTT GAC TAC AGG GAC TGC ATG AAA288Val Thr Arg Leu Met Glu Arg Leu Leu Asp Tyr Arg Asp Cys Met Lys85 90 95GGA GAG GAA ACA GAG AAT AAG AAG ATA GGC TGC ACT GTT AAC CTG ATG336Gly Glu Glu Thr Glu Asn Lys Lys Ile Gly Cys Thr Val Asn Leu Met100 105 110AAT TTT TAC AAA TCT GAG ATT AAC AAG GAA GAA ATG TAT ATC CGC TAC384Asn Phe Tyr Lys Ser Glu Ile Asn Lys Glu Glu Met Tyr Ile Arg Tyr115 120 125ATC CAT AAG CTT TGT GAC ATG CAC TTG CAG GCC GAA AAC TAC ACA GAG432Ile His Lys Leu Cys Asp Met His Leu Gln Ala Glu Asn Tyr Thr Glu130 135 140GCC GCA TTT ACC CTG CTC CTT TAC TGT GAG CTG CTG CAG TGG GAG GAC480Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Tyr Cys Glu Leu Leu Gln Trp Glu Asp145 150 155 160CGG CCA CTA CGG GAA TTC CTC CAC TAC CCA TCG CAG ACA GAG TGG CAG528Arg Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Tyr Pro Ser Gln Thr Glu Trp Gln165 170 175CGG AAG GAG GGA CTG TGC CGG AAG ATC ATT CAC TAC TTC AAC AAA GGC576Arg Lys Glu Gly Leu Cys Arg Lys Ile Ile His Tyr Phe Asn Lys Gly180 185 190AAG AGC TGG GAG TTT GGG ATC CCA CTG TGC AGG GAG CTG GCG TGT CAG624Lys Ser Trp Glu Phe Gly Ile Pro Leu Cys Arg Glu Leu Ala Cys Gln195 200 205TAC GAG AGC CTC TAT GAT TAC CAG AGC CTC AGC TGG ATT CGG AAA ATG672Tyr Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Gln Ser Leu Ser Trp Ile Arg Lys Met210 215 220GAG GCC AGC TAC TAT GAC AAC ATT ATG GAG CAG CAA CGC CTG GAG CCT720Glu Ala Ser Tyr Tyr Asp Asn Ile Met Glu Gln Gln Arg Leu Glu Pro225 230 235 240GAG TTC TTT CGG GTC GGC TTC TAT GGC AGG AAG TTT CCT TTC TTT CTT768Glu Phe Phe Arg Val Gly Phe Tyr Gly Arg Lys Phe Pro Phe Phe Leu245 250 255CGG AAC AAA GAA TAC GTG TGC CGT GGC CAT GAC TAC GAG AGG CTG GAG816Arg Asn Lys Glu Tyr Val Cys Arg Gly His Asp Tyr Glu Arg Leu Glu260 GCT GTC GCC ATG864Ala Phe Gln Gln Arg Met Leu Ser Glu Phe Pro Gln Ala Val Ala Met275 280 285CAG CAC CCC AAC CAT CCT GAT GAC GCC ATC CTA CAG TGC GAT GCC CAG912Gln His Pro Asn His Pro Asp Asp Ala Ile Leu Gln Cys Asp Ala Gln290 295 265 270GCC TTC CAG CAG AGG ATG CTC AGT GAG TTT CCG CAG 60; 300TAC TTG CAG ATC TAT GCA GTG ACG CCC ATT CCA GAT TAT GTG GAT GTT960Tyr Leu Gln Ile Tyr Ala Val Thr Pro Ile Pro Asp Tyr Val Asp Val305 310 315 320CTG CAG ATG GAT AGG GTA CCA GAT CGA GTC AAG AGC TTC TAT CGC GTC1008Leu Gln Met Asp Arg Val Pro Asp Arg Val Lys Ser Phe Tyr Arg Val325 330 335AAC AAT GTG AGG AAG TTC CGG TAT GAC AGG CCT TTT CAC AAA GGC CCC1056Asn Asn Val Arg Lys Phe Arg Tyr Asp Arg Pro Phe His Lys Gly Pro340 345 350AAG GAC AAG GAG AAT GAA TTC AAG AGC CTG TGG ATT GAA CGT ACC ACA1104Lys Asp Lys Glu Asn Glu Phe Lys Ser Leu Trp Ile Glu Arg Thr Thr355 360 365CTG ACC CTG ACC CAC AGC TTG CCT GGC ATC TCT CGG TGG TTT GAA GTG1152Leu Thr Leu Thr His Ser Leu Pro Gly Ile Ser Arg Trp Phe Glu Val370 375 380GAG AGG AGG GAA CTG GTG GAG GTG AGC CCT CTG GAG AAT GCC ATC CAA1200Glu Arg Arg Glu Leu Val Glu Val Ser Pro Leu Glu Asn Ala Ile Gln385 390 395 400GTG GTT GAG AAT AAG AAC CAG GAG CTA CGC TCC CTG ATC AGC CAG TAT1248Val Val Glu Asn Lys Asn Gln Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Gln Tyr405 410 415CAA CAC AAG CAG GTG CAT GGC AAC ATT AAC CTG CTA AGC ATG TGC CTG1296Gln His Lys Gln Val His Gly Asn Ile Asn Leu Leu Ser Met Cys Leu420 425 430AAT GGT GTC ATT GAT GCA GCT GTC AAT GGA GGC ATT GCA CGC TAT CAG344Asn Gly Val Ile Asp Ala Ala Val Asn Gly Gly Ile Ala Arg Tyr Gln435 440 445GAG GCC TTC TTT GAT AAA GAT TAC ATC AAC AAG CAC CCA GGA GAT GCT 1392Glu Ala Phe Phe Asp Lys Asp Tyr Ile Asn Lys His Pro Gly Asp Ala450 455 460GAG AAG ATC ACC CAG CTC AAG GAG CTT ATG CAG GAG CAG GTT CAT GTC 1440Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Glu Leu Met Gln Glu Gln Val His Val465 470 475 480CTT GGA GTT GGG CTA GCA GTT CAT GAG AAG TTT GTG CAC CCA GAA ATG 488Leu Gly Val Gly Leu Ala Val His Glu Lys Phe Val His Pro Glu Met485 490 495CGG CCT CTG CAT AAG AAG CTA ATT GAT CAG TTC CAG ATG ATG CGG GCC 1536Arg Pro Leu His Lys Lys Leu Ile Asp Gln Phe Gln Met Met Arg Ala500 505 510AGT CTC TAC CAT GAG TTT CCA GGT TTG GAT AAG CTA AGT CCT GCA TGT 1584Ser Leu Tyr His Glu Phe Pro Gly Leu Asp Lys Leu Ser Pro Ala Cys515 520 525TCA GGC ACC AGC ACC CCA CGG GGA AAT GTT CTG GCA TCC CAT AGC CCC 1632Ser Gly Thr Ser Thr Pro Arg Gly Asn Val Leu Ala Ser His Ser Pro530 535 540ATG AGT CCG GAG AGC ATC AAG ATG ACC CAC CGG CAC AGC CCC ATG AAC 1680Met Ser Pro Glu Ser Ile Lys Met Thr His Arg His Ser Pro Met Asn545 550 555 560TTG ATG GGC ACA GGC CGC CAT TCA TCA TCC TCT CTC TCC TCA CAT GCG 1728Leu Met Gly Thr Gly Arg His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser His Ala565 570 575TCT AGT GAA GCA GGA AAC ATG GTG ATG CTG GGT GAC GGC TCC ATG GGT 1776Ser Ser Glu Ala Gly Asn Met Val Met Leu Gly Asp Gly Ser Met Gly580 585 590GAT GCT CCT GAG GAC CTG TAC CAC CAC ATG CAG CTC GCG TAT CCC AAC 1824Asp Ala Pro Glu Asp Leu Tyr His His Met Gln Leu Ala Tyr Pro Asn595 600 605CCC AGG TAC CAA GGC TCA GTC ACC AAC GTC TCT GTT CTG TCC TCG TCC 1872Pro Arg Tyr Gln Gly Ser Val Thr Asn Val Ser Val Leu Ser Ser Ser610 615 620CAG GCA AGC CCT TCT TCC TCC AGC CTG AGT TCC ACT CAC TCA GCA CCA 1920Gln Ala Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Thr His Ser Ala Pro625 630 635 640TCC CAG ATG ATT ACC TCT GCC CCT TCC AGT GCC CGA GAT AAG TAC CGC 1968Ser Gln Met Ile Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ala Arg Asp Lys Tyr Arg
645 650 655CAT GCC CGT GAA ATG ATG TTG TTG CTG CCC ACA TAC CGG GAC CGC CCA 2016His Ala Arg Glu Met Met Leu Leu Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Arg Pro660 665 670AGC AGT GCC ATG TAT CCA GCA GCC ATC CTG GAG AAC GGA CAG CCG CCG 2064Ser Ser Ala Met Tyr Pro Ala Ala Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Pro675 680 685AAT TTC CAG CGA GCC CTG TTC CAG CAA GTG GTC GGA GCC TGC AAA CCC 2112Asn Phe Gln Arg Ala Leu Phe Gln Gln Val Val Gly Ala Cys Lys Pro690 695 700TGC AGT GAT CCC AAT CTG TCT GTG GCT GAA AAA GGT CAT TAC TCC CTA 2160Cys Ser Asp Pro Asn Leu Ser Val Ala Glu Lys Gly His Tyr Ser Leu705 710 715 720CAC TTT GAC GCC TTC CAC CAC CCT CTG GGT GAT ACC CCC CCA GCC CTC 2208His Phe Asp Ala Phe His His Pro Leu Gly Asp Thr Pro Pro Ala Leu725 730 735CCT GCC CGG ACC CTG CGC AAG TCT CCT CTC CAC CCT ATC CCA GCC TCC 2256Pro Ala Arg Thr Leu Arg Lys Ser Pro Leu His Pro Ile Pro Ala Ser740 745 750CCC ACA AGC CCC CAG TCA GGT CTG GAC GGC AGC AAC TCT ACG CTG TCC 2304Pro Thr Ser Pro Gln Ser Gly Leu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Leu Ser755 760 765GGC AGT GCC AGC AGC GGC GTG TCC TCC TTG AGT GAG AGT AAC TTT GGG 2352Gly Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Leu Ser Glu Ser Asn Phe Gly770 775 780CAC TCC TCG GAG GCC CCA CCT CGC ACT GAC ACC ATG GAC TCC ATG CCA 2400His Ser Ser Glu Ala Pro Pro Arg Thr Asp Thr Met Asp Ser Met Pro785 790 795 800AGT CAG GCC TGG AAT GCT GAC GAA GAT CTT GAG CCA CCC TAC CTC CCT 2448Ser Gln Ala Trp Asn Ala Asp Glu Asp Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro805 810 815GTC CAC TAC AGC CTC TCT GAG TCT GCC GTC CTG GAC TCC ATC AAG GCC 2496Val His Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Ala Val Leu Asp Ser Ile Lys Ala820 825 830CAG CCA TGC CGA AGC CAC TCA GCC CCA GGG TGC GTC ATC CCT CAG GAC 2544Gln Pro Cys Arg Ser His Ser Ala Pro Gly Cys Val Ile Pro Gln Asp835 840 845CCC ATG GAC CCG CCT GCG CTG CCG CCC AAG CCC TAC CAC CCC CGC CTG 2592Pro Met Asp Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Pro Tyr His Pro Arg Leu850 855 860CCG GCC CTG GAG CAC GAT GAG GGG GTG CTG CTG CGT GAA GAG ACT GAG 2640Pro Ala Leu Glu His Asp Glu Gly Val Leu Leu Arg Glu Glu Thr Glu865 870 875 880AGG CCT CGA GGC CTG CAC CGC AAG GCT CCA TTG CCT CCT GGG AGC GCT 2688Arg Pro Arg Gly Leu His Arg Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Ser Ala885 890 895AAG GAG GAG CAG GCC CGC ATG GCC TGG GAG CAC GGC CGA GGG GAG CAG 2736Lys Glu Glu Gln Ala Arg Met Ala Trp Glu His Gly Arg Gly Glu Gln900 905 910TGAGGGGCAA CGAGGCGGCT GGGATGCCGC CCTCAGTAAG CAGCTTGCCA ATCACTCCAG2796GTCTGAAAAG CAAGTCCCCC AGCCCCACCC CAGGGAGCCA GAGAGGCTTG CACTCAGGAG2856AGAACCACCC CCAAGTCTCC GTTCTACTGC CGCCCG2892(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)长度1363碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟非(iv)反义非(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1363(xi)序列描述SEQ ID No.2GAA TTC CGG GGT TGT GTG AAG ATG GAG TTT CCC GGA GGA AAT GAC AAT 48Glu Phe Arg Gly Cys Val Lys Met Glu Phe Pro Gly Gly Asn Asp Asn915 920 925TAC CTG ACG ATC ACA GGG CCT TCG CAC CCC TTC CTG TCA GGG GCC GAG 96Tyr Leu Thr Ile Thr Gly Pro Ser His Pro Phe Leu Ser Gly Ala Glu930 935 940ACA TTC CAT ACA CCA AGC TTG GGT GAT GAG GAA TTT GAA ATC CCA CCT144Thr Phe His Thr Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Phe Glu Ile Pro Pro945 950 955 960ATC TCC TTG GAT TCT GAT CCC TCA TTG GCT GTC TCA GAT GTG GTT GGC192Ile Ser Leu Asp Ser Asp Pro Ser Leu Ala Val Ser Asp Val Val Gly965 970 975CAC TTT GAT GAC CTG GCA GAC CCT TCC TCT TCA CAG GAT GGC AGT TTT240His Phe Asp Asp Leu Ala Asp Pro Ser Ser Ser Gln Asp Gly Ser Phe980 985 990TCA GCC CAG TAT GGG GTC CAG ACA TTG GAC ATG CCT GTG GGC ATG ACC288Ser Ala Gln Tyr Gly Val Gln Thr Leu Asp Met Pro Val Gly Met Thr995 10001005CAT GGC TTG ATG GAG CAG GGC GGG GGG CTC CTG AGT GGG GGC TTG ACC336His Gly Leu Met Glu Gln Gly Gly Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Thr101010151020ATG GAC TTG GAC CAC TCT ATA GGA ACT CAG TAT AGT GCC AAC CCA CCT384Met Asp Leu Asp His Ser Ile Gly Thr Gln Tyr Ser Ala Asn Pro Pro1025103010351040GTT ACA ATT GAT GTA CCA ATG ACA GAC ATG ACA TCT GGC TTG ATG GGG 432Val Thr Ile Asp Val Pro Met Thr Asp Met Thr Ser Gly Leu Met Gly104510501055CAT AGC CAG TTG ACC ACC ATT GAT CAG TCA GAA CTG AGT TCC CAG CTG 480His Ser Gln Leu Thr Thr Ile Asp Gln Ser Glu Leu Ser Ser Gln Leu10601065 1070GGT TTG AGC CTA GGG GGT GGC ACC ATC CTG CCA CCT GCC CAG TCA CCT 528Gly Leu Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Pro Pro Ala Gln Ser Pro107510801085GAA GAT CGT CTT TCA ACC ACC CCT TCA CCT ACT AGT TCA CTT CAC GAA 576Glu Asp Arg Leu Ser Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Ser Leu His Glu109010951100GAT GGT GTT GAG GAT TTC CGG AGG CAA CTT CCC AGC CAG AAG ACA GTC 624Asp Gly Val Glu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Pro Ser Gln Lys Thr Val1105111011151120GTG GTG GAA GCA GGG AAA AAG CAG AAG GCC CCA AAG AAG AGA AAA AAG 672Val Val Glu Ala Gly Lys Lys Gln Lys Ala Pro Lys Lys Arg Lys Lys112511301135AAA GAT CCT AAT GAA CCT CAG AAA CCA GTT TCA GCA TAT GCT TTA TTC 720Lys Asp Pro Asn Glu Pro Gln Lys Pro Val Ser Ala Tyr Ala Leu Phe114011451150TTT CGT GAT ACA CAG GCT GCC ATC AAG GGA CAG AAT CCT AAT GCC ACT 768Phe Arg Asp Thr Gln Ala Ala Ile Lys G1y Gln Asn Pro Asn Ala Thr115511601165TTT GGT GAG GTT TCA AAA ATT GTG GCC TCC ATG TGG GAT AGT CTT GGA 816Phe Gly Glu Val Ser Lys Ile Val Ala Ser Met Trp Asp Ser Leu Gly117011751180GAG GAG CAA AAA CAG GTA TAT AAG AGG AAA ACT GAG GCT GCC AAG AAA 864Glu Glu Gln Lys Gln Val Tyr Lys Arg Lys Thr Glu Ala Ala Lys Lys1185119011951200GAG TAT CTG AAG GCA CTG GCT GCT TAC AAA GAC AAC CAG GAG TGT CAG 912Glu Tyr Leu Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Gln Glu Cys Gln120512101215GCC ACT GTG GAA ACA GTG GAA TTG GAT CCA GCA CCA CCA TCA CAA ACT 960Ala Thr Val Glu Thr Val Glu Leu Asp Pro Ala Pro Pro Set Gln Thr12201225 1230CCT TCT CCA CCT CCT ATG GCT ACT GTT GAC CCA GCA TCT CCA GCA CCA 1008Pro Ser Pro Pro Pro Met Ala Thr Val Asp Pro Ala Ser Pro Ala Pro123512401245GCT TCA ATA GAG CCC CCT GCC CTG TCC CCA TCC ATT GTT GTT AAC TCC 1056Ala Ser Ile Glu Pro Pro Ala Leu Ser Pro Ser Ile Val Val Asn Ser125012551260ACC CTT TCA TCC TAT GTG GCA AAC CAG GCA TCT TCT GGA GCT GGG GGT 1104Thr Leu Ser Ser Tyr Val Ala Asn Gln Ala Ser Ser Gly Ala Gly Gly126512701275 1280CAG CCC AAT ATC ACC AAG TTG ATT ATT ACC AAA CAA ATG TTG CCC TCT 1152Gln Pro Asn Ile Thr Lys Leu Ile Ile Thr Lys Gln Met Leu Pro Ser128512901295TCT ATT ACT ATG TCT CAA GGA GGG ATG GTT ACT GTT ATC CCA GCC ACA 1200Ser Ile Thr Met Ser Gln Gly Gly Met Val Thr Val Ile Pro Ala Thr130013051310GTG GTG ACC TCC CGG GGG CTC CAA CTA GGC CAA ACC AGT ACA GCT ACT 1248Val Val Thr Ser Arg Gly Leu Gln Leu Gly Gln Thr Ser Thr Ala Thr131513201325ATC CAG CCC AGT CAA CAA GCC CAG ATT GTC ACT CGG TCA GTG TTG CAG 1296Ile Gln Pro Ser Gln Gln Ala Gln Ile Val Thr Arg Ser Val Leu Gln133013351340GCA GCA GCA GCT GCT GCT GCT GCT GCT TCT ATG CAA CTG CCT CCA CCC 1344Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Met Gln Leu Pro Pro Pro1345135013551360CGA GTA CAG CCC GGA ATT C 1363Arg Val Gln Pro Gly Ile136权利要求
1.编码一种能与早老素相互作用的蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的核苷酸序列，其特征在于它编码一种能与早老素PS-1大环的全部或部分相作用的多肽或蛋白质。
3.根据权利要求1或2的核苷酸序列，其特征在于它含有序列SEQ ID No.1或其衍生序列的全部或部分。
4.根据权利要求1或2的核苷酸序列，其特征在于它含有序列SEQ ID No.2或其衍生序列的全部或部分。
5.一种多肽，其特征在于它能够与早老素相互作用。
6.根据权利要求5的多肽，其特征在于它能够与早老素PS-1的大环相作用。
7.根据权利要求6的多肽，其特征在于它能够与早老素PS-1大环的310-463氨基酸序列相作用。
8.根据权利要求5的多肽，其特征在于它能够与早老素PS-2的大环相作用。
9.根据权利要求5-8之一的多肽，其特征在于它包含多肽序列SEQ ID No.1或其衍生序列的全部或部分。
10.根据权利要求5-8之一的多肽，其特征在于它包含多肽序列SEQ ID No.2或其衍生序列的全部或部分。
11.权利要求5-10的多肽在制备用于减缓、刺激或调节早老素活性的药物中的应用。
12.制备权利要求5-10之一的多肽的方法，其特征在于将含有权利要求1-4之一的核苷酸序列的细胞在所述序列的表达条件下培养，并回收产生的多肽。
13.用于生产权利要求5-10之一的多肽的细胞宿主，其特征在于它已用含有权利要求1-4之一的核苷酸序列的核酸转化。
14.权利要求3或4的序列的反义寡核苷酸。
15.能与权利要求1-4之一的核苷酸序列或相应的mRNA杂交的核苷酸探针。
16.抗权利要求5-10之一的多肽的抗体或抗体片段。
17.根据权利要求16的抗体或抗体片段，其特征在它针对选自多肽序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或其衍生序列的一种序列。
18.根据权利要求16或17的抗体或抗体片段，其特征在于它具有抑制和/或揭示早老素与权利要求5-10之一的多肽间相互作用的特性。
19.揭示或分离能调节或抑制早老素与权利要求5-10中所定义多肽间相互作用的化合物的方法，其特征在于按以下步骤进行a.将可能不明身份的分子或不同分子的混合物与如上所定义表达本发明多肽的重组细胞，在所述分子对所述多肽具有亲和力时允许所述多肽和所述分子间相互作用的条件下接触，及b.检测和/或分离与所述多肽结合的分子。
20.可按权利要求19的方法获得的如权利要求5-10定义的多肽配体。
21.权利要求20的配体在制备用于治疗神经疾病的药物中的用途。
22.含有编码权利要求5-10之一的多肽之核苷酸序列的缺陷重组腺病毒。
23.含有权利要求1-4之一的核苷酸序列的载体。
24.根据权利要求23的载体，其特征在于它是一种质粒载体。
25.根据权利要求23的载体，其特征在于它是一种病毒载体。
26.根据权利要求25的载体，其特征在于它是一种复制缺陷型病毒。
27.含有权利要求23-26之一的一种或多种载体的药物组合物。
28.含有至少一种权利要求5-10之一的多肽作为活性成分的药物组合物。
29.含有至少一种权利要求16-18之一的抗体或抗体片段、和/或权利要求14的寡核苷酸和/或按权利要求19制备的化合物作为活性成分的药物组合物。
30.权利要求27-29之一的组合物，其用于调节、减缓或抑制早老素或其突变形式的活性。
31.权利要求27-29之一的组合物，其用于治疗神经变性疾病。
全文摘要
本发明涉及新的核苷酸及肽序列和它们的医药应用。更具体地,本发明涉及编码能与早老素相作用的蛋白质的核酸。
文档编号A61K31/711GK1272139SQ9880961
公开日2000年11月1日 申请日期1998年9月30日 优先权日1997年10月1日
发明者A·方尼尔, L·默克肯, L·普拉迪尔, M－F·保罗 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司