用编码分泌蛋白质如干扰素－β的基因进行治疗的方法和组合物的制作方法

专利名称：用编码分泌蛋白质如干扰素－β的基因进行治疗的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗。更具体地，本发明涉及编码分泌蛋白质如干扰素蛋白质的DNA在人体和动物体内的递送。
背景技术：
干扰素(也称作“IFN”)指有多种生物活性的蛋白质，其中有些有抗病毒、免疫调节和抗增殖活性。它们为相对小型、种属特异的单链多肽，由哺乳动物细胞应答接触各种诱导物如病毒、多肽、促分裂原等的物质后产生。干扰素可保护动物组织和细胞免受病毒侵袭，是重要的宿主防御机制。多数情况下，比起其它类型的组织和细胞，干扰素对其来源组织和细胞的保护效果更佳，这表明人源干扰素较其它来源的干扰素在治疗人类疾病方面更有效。
人类干扰素有几种不同的类型，一般分为白细胞(干扰素α[α])、成纤维细胞(干扰素β[β])和免疫(干扰素γ[γ])，及许多其变异体。可在各种教科书和专论中得到干扰素的一般讨论，这些文章包括干扰素系统(The Interferon System)(W.E.Stewart，II，Springer-Verlag，N.Y.1979)；干扰素治疗(Interferon Therapy)(世界卫生组织技术报告集676(World Health Organization Technical Reports Series 676)，世界卫生组织(World Health Organization)，日内瓦1982)，在此引入供参考。
由于干扰素分子可在多水平上发挥抗肿瘤活性，可望将其用于治疗许多人类癌症。首先，干扰素蛋白质可直接抑制人类肿瘤细胞增殖。该抗增殖活性也与各种已被承认的化疗药物如顺铂、5FU和紫杉醇有协同作用。其次，干扰素蛋白质的免疫调节活性可诱导抗肿瘤免疫反应。该反应包括活化NK细胞、刺激巨噬细胞活性和诱导MHCI类表面分子表达，从而诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞的活性。另外，一些研究还表明IFN-β蛋白质可能具有抗血管生成活性。血管生成，新血管形成，对实体瘤的生长起到关键作用。有证据表明IFN-β可通过抑制促血管生成因子如bFGF和VEGF的表达来抑制血管生成。最后，干扰素可通过影响在组织再建中起重要作用的酶如胶原酶和弹性(蛋白质)酶的表达而抑制肿瘤侵袭。
干扰素似乎也在两种不同机制上发挥抗病毒活性。例如，I型干扰素蛋白质(α和β)可直接抑制人类乙型肝炎病毒(“HBV”)和丙型肝炎病毒(“HCV”)的复制，但也可刺激攻击受这些病毒感染的细胞的免疫反应。
具体地，不论其潜在治疗价值，干扰素蛋白质在抗肝炎病毒和实体瘤方面仅取得了有限的临床成绩。IFN-α已获批治疗HBV和HCV；但是两种情况中的反应率仅约20％。尽管已批准将干扰素蛋白质用于治疗一些癌症如淋巴瘤、白血病、黑色素瘤和肾细胞癌，在多数临床试验中单独使用干扰素或与常规化疗药物联合使用来治疗实体瘤并未取得成功。
施用干扰素的方法在该重要治疗药物的临床应用中是一重要因素。通过静脉内、肌肉内或皮下注射系统性施用干扰素已广泛用于治疗如多毛细胞白血病、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和相关的卡波西肉瘤等疾病，并取得了一定成功。但是已知纯化形式的蛋白质尤其易于降解。特别地，就干扰素β而言，溶液中干扰素降解的主要机制是聚集和脱酰胺(作用)。在溶液或其它产物中干扰素的不稳定性限制了其用途。另外，非肠道途径(肌肉内、皮下或静脉内)施用干扰素蛋白质后干扰素蛋白质的清除率非常迅速。因而，非肠道途径施用蛋白质不能使足量干扰素定位于活性部位(实体瘤，或，在肝炎的情况下为肝脏)。可经非肠道途径给予病人的干扰素的数量由于高剂量干扰素下观察到的副反应而受到限制。显然需要更有效的治疗。
发明概述此申请是为了解决与递送治疗用分泌蛋白质如干扰素蛋白质有关的问题。本发明涉及干扰素治疗的方法，其中编码分泌蛋白质的基因而不是蛋白质本身得到递送。
因此，本发明的一个目的是在使用基因工程化的细胞基础上提供基因治疗的方法，本发明还涉及该方法的用途，以便将分泌蛋白质如干扰素递送到哺乳动物受体。通过提供形成细胞表达系统的方法、因此而产生的表达系统和含有其的药物组合物，本发明达到这些和其它目的。细胞表达系统表达编码一种或多种分泌蛋白质的基因，可作为载体在哺乳动物受体中原位递送基因产物。在一优选实施方案中，哺乳动物受体是人类。
在本发明的一个实施方案中，细胞表达系统是指为治疗一种疾病在哺乳动物受体细胞中体内表达干扰素蛋白质。该表达系统包括与哺乳动物受体种相同的细胞，且其中包含用来表达干扰素蛋白质的表达载体。优选地，哺乳动物受体为人，表达载体包括一种病毒载体。
在另一实施方案中，表达系统包括与哺乳动物受体种相同的多种细胞，且其中包含用来表达分泌蛋白质的表达载体。该表达载体仅位于所述多种细胞中的部分细胞中。优选地，至少0.3％数目的细胞含有该载体。优选分泌蛋白质是干扰素，最优选的干扰素是α、β、γ和共有干扰素，最优选干扰素β。
其它实施方案中，细胞表达系统包括多种癌细胞，至少部分癌细胞含有腺病毒载体，载体具有表达时编码干扰素的分离的多聚核苷酸。该细胞表达系统中，腺病毒载体选自(a)E1基因中具有缺失和/或突变的腺病毒载体；(b)E2a基因中具有缺失和/或突变的腺病毒载体，所述载体表达人类干扰素β；(c)E1和E4基因中均具有缺失和/或突变的腺病毒载体；和(d)所有基因均具有缺失的腺病毒载体；所述载体表达人干扰素β。
本发明还包括向哺乳动物受体部位递送分泌蛋白质的药物组合物。该组合物包括载体和与哺乳动物受体种相同的遗传修饰过的多种细胞群，至少部分细胞包含可表达有效量分泌蛋白质的表达载体。优选的分泌蛋白质是干扰素。该组合物包括体内递送和离体递送的组成成分。
另一实施方案是一种制备离体基因治疗药物制剂来施用给哺乳动物受体的方法。该方法包括步骤(a)形成与哺乳动物受体种相同的细胞群，(b)将表达分泌蛋白质的表达载体导入细胞群中至少一个细胞内，以形成至少一个遗传修饰的细胞，和(c)将至少一个遗传修饰的细胞置入药学可接受的载体内以获得适于施用于哺乳动物受体部位的药物制剂。
本发明另一实施方案是一种基因治疗的方法，包括通过以下步骤遗传修饰哺乳动物受体的至少一个细胞(a)向至少一个细胞导入表达分泌蛋白质的表达载体，以建立至少一个遗传修饰的细胞；(b)使该遗传修饰细胞与哺乳动物受体的位点接触。而且，该方法可包括在导入表达载体之前将哺乳动物受体的至少一个细胞移出的步骤。在另一实施方案中，导入载体的步骤包括将载体仅仅导入细胞群的一部分细胞中。
本发明包括一种离体基因治疗方法，该方法包括的步骤有从受试者移出细胞群；向细胞群中的至少一个细胞施用重组腺病毒，这样就存在有过量不含有腺病毒的细胞。腺病毒的E1基因中可带有缺失，并含有编码分泌蛋白质的一种分离的多聚核苷酸。重新将该细胞群导入受试者体内。
体内基因治疗方法中，包括步骤将含有编码人干扰素-β蛋白质的分离的多聚核苷酸的腺病毒载体直接施用入受试者的细胞中，无需先将上述细胞从受试者中取出。该体内和离体方法允许局部的、眼内的、非肠道的、鼻内的、气管内的、支气管内的、肌内的、皮下的、静脉的和腹膜内施用方式。
本发明有几大优点。干扰素基因治疗可在低系统水平时达到很高的局部干扰素浓度。结果可产生更高的治疗效果而副作用较低。而且基因治疗递送的干扰素可呈现相当恒定的水平，而不像是在干扰素蛋白质治疗中所表现的那样，在蛋白质注入后出现很高水平的干扰素的“爆发”或达蛋白质浓度的峰值(这可导致毒性作用)，随后是很低水平的干扰素浓度，以至于可能不能发挥作用。
患者便利也是一关键因素。虽然经常注射干扰素蛋白质是必需的，一次或数次非经常性地施用表达干扰素基因的载体可提供长期稳定的蛋白质产生。基因治疗可使干扰素以一种可控制的方式递送到不同的靶器官或肿瘤。可建立自分泌系统，其中同一细胞表达、分泌和吸收干扰素。这样可达到非常高的局部剂量。因为毒性作用，通过非肠道途径施用蛋白质不能达到如此高的剂量。
因为干扰素蛋白质可分泌至细胞外，所以不必将干扰素基因转导入肿瘤中的或者肝炎病毒感染的肝脏中的所有细胞中。未摄入该基因的细胞将受邻近细胞的影响(所谓“旁观者效应”)，这些邻近细胞含有此基因并分泌干扰素蛋白质。并不是肿瘤组织或器官中所有细胞都需要含有表达载体，因此这是一个重要的发现并可能对治疗方案有极大影响。
最后，已发现非肠道途径施用干扰素可导致干扰素抗体的产生。可能是潜在的中和抗体反应在向不同的局部区域导入干扰素基因后减弱的结果。除了局部的表达，表达的干扰素可由内源性的人类细胞产生，因此，与细菌、酵母、中华仓鼠卵巢细胞产生继而纯化、非肠道途径注射的干扰素相比，人源干扰素的结构和糖基化更加自然，且可能免疫原性更低。
如果参考详细的优选实施方案说明和伴随的附图的话，此发明的这些方面及其它方面的特点和多种优点和用途将会更加明晰。
附图简述

图1、(A)将未感染的MDA-MB-468(-○-)或是感染有0.01％(-△-)、0.03％(-□-)、0.1％(--)或0.3％
H5.110h IFNβ的细胞皮下注射到裸鼠肋腹，并且对肿瘤细胞植入后的时间将平均肿瘤大小标绘成图。(B)卡普兰-米尔图显示109天观察期内小鼠的存活百分率。未感染细胞(-○-)；分别为0.01％(-△-)、0.03％(-□-)、0.1％(--)和0.3％(-
的H5.10h IFNβ感染的细胞。
图2、(A)(1)KM12L4A细胞；(2)Huh7细胞和(3)ME180细胞的离体干扰素β基因疗法。将平均的肿瘤大小对肿瘤细胞的植入时间绘制成图。将未感染细胞(-■-)或1％(-●-)或10％(-▲-)H5.100h IFN β感染过的细胞植入小鼠。在那些处死了一些小鼠的组别中，肿瘤的大小用与处死这些鼠时其最后值的平均值来表示。连线的中断反映每一组中所有动物的死亡或处死。(B)70天观察期内的小鼠的存活百分率。1、2、3表分别表示移植了KM12L4A细胞、Huh7细胞、ME180细胞的小鼠产生的数据。符号表示移植未感染细胞的小鼠(-■-)、移植1％H5.110hIFN β感染细胞的小鼠(-●-)和移植10％ H5.110h IFN β感染细胞的小鼠(-▲-)。
图3、对建立的MDA-MB-468肿瘤的直接体内治疗。分别向肿瘤注射剂量为3×109pfu
、1×109pfu
、3×108pfu(-○-)、1×108pfu(-△-)和3×107pfu(--)的H5.110h IFN β或注射PBS
，或注射剂量分别为3×109pfu(-◇-)、1×109pfu(-▲-)、3×108pfu(-×-)和1×108pfu
的H5.110LacZ。注射治疗过程后14天测量肿瘤大小。
优选实施方案详述本发明部分地建立在离体基因治疗方法的基础上，该方法所用的细胞(1)可容易地从患者身上取出，(2)通过导入遗传物质可以在体外对其进行修饰；(3)可以很方便地将细胞植入受体中；(4)是非形成血栓性的；(5)可大量地植入受体内。公开的体内基因治疗所用的细胞(1)存在于受体中，和(2)可原位修饰以表达分离的遗传物质。遗传修饰的细胞包括用以控制遗传物质表达的数量的调控元件。
遗传修饰细胞能够存活，并持续原位生成表达物质一段足够长的时间，以使表达物质可达有效(即治疗)结果，而不干扰细胞植入处组织的正常功能。
优选地，表达产物是分泌蛋白质(下面有定义)。更优选地，该分泌蛋白质是干扰素。实际上，尽管干扰素是最佳的治疗药物，适用于任何分泌蛋白质基因治疗的一般原则已经被发现。我们发现，基于分泌蛋白质如干扰素由表达它们的细胞释放的事实，“分泌蛋白质”基因不必转导肿瘤组织块或，比如，感染了肝炎的肝脏中的每一细胞。那些未摄入此基因的细胞将受含有此基因且分泌该蛋白质的邻近细胞的影响(也就是所谓“旁观者效应”)。尽管用经表达编码干扰素的分离的多聚核苷酸来说明基因疗法，任何分泌蛋白质(下面有定义)都有用于此方法和组合物的可能。
本文所用的所有引文在此引入供参考。I.定义“基因治疗”-一种通过遗传信息导入靶器官用以纠正疾病表型的方法。
“离体基因治疗”-一种从受试者中取出细胞并在体外进行培养的方法。在体外将多聚核苷酸如功能基因导入这些细胞中，这些修饰细胞通过培养大量繁殖，然后再重植入受试者。
“体内基因治疗”-一种不从受试者身上取出靶细胞的方法。而是将转移的多聚核苷酸(如经表达编码干扰素的基因)原位导入受体组织的细胞中，也就是在受体内。多种动物模型中已验证过体内基因治疗方法，并且最近的出版物已报道了直接基因原位器官和组织转移的可行性。
“适于基因治疗的疾病”-包括疾病如遗传病(也就是由于一个或多个基因缺陷导致的疾病状态)、获得性病理改变(也就是不是因为天生缺陷而导致的病理状态)、癌症及预防措施(也就是疾病或非期望医疗疾病的预防)。
“获得性病理改变”-是指由异常生理的、生物化学的、细胞的、结构的或分子生物学状态表现出的疾病和体征。
“多聚核苷酸”-核酸单体单位的聚合体，单体单位可是核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或是两者的结合。DNA的四个碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，而RNA的的4个碱基是A、G、C和尿嘧啶(U)。
“分离的”当用于编码干扰素基因的多聚核苷酸序列时，它的意思是RNA或DNA多聚核苷酸、基因组多聚核苷酸的部分、cDNA或合成的多聚核苷酸，根据其来源或操作(i)不是与其天然结合的任何多聚核苷酸结合(例如，在宿主细胞中作为表达载体的一部分而存在)；或者是(ii)连到不是天然状态下与之相连的核酸或其它化学基团上；或是(iii)天然情况下不存在。通过“分离的”还表示多聚核苷酸序列(i)通过例如聚合酶链反应(PCR)进行扩增作用；(ii)化学合成的；(iii)通过克隆重组生成或(iv)应用切割和凝胶分离方法得以纯化。
这样，一个“分离的”干扰素多聚核苷酸包括例如，可转录为反义RNA的非天然存在的核酸或在天然存在的细胞中，不表达或不在明显生物学水平上表达的编码干扰素的基因。举例说明，因人的脑细胞不天然表达干扰素-β1a，就其来说，一合成的或天然的编码干扰素-β1a的基因可认为是“分离的”。其它的“分离的多聚核苷酸”的例子是把干扰素基因片段导入而生成的重组基因，例如，通过同源重组将一可诱导启动子和内源性干扰素编码基因相连。
“基因”-DNA序列(也就是通过3′-5′戊糖磷酸二酯键相互联接的核苷酸线性序列)，其通过mRNA编码某一特定蛋白质的氨基酸序列。
“转录”-由基因生成mRNA的过程。
“翻译”-由mRNA生成蛋白质的过程。
“表达”-是由DNA序列或基因生成蛋白质的过程，包括转录和翻译。
“抑制生长”-此处使用的本术语既用来指抑制靶细胞(也就是肿瘤)的生长，同时还指抑制转化表型(例如，由形态学的变化来测量)。
“氨基酸”-肽、多肽或蛋白质的单体单位。存在有20种L-异构的氨基酸。本术语也包括氨基酸类似物和蛋白质氨基酸的D-异构体及其类似物。
“蛋白质”-不论其大小，基本上由20种氨基酸的任何一种构成的任何多聚体。尽管“多肽”常用来指分子量相对较大的多肽，“肽”用来指较小的多肽。在本领域内这些词语的使用是重叠和多样的。除非注明，“蛋白质”一词在此用来指肽、蛋白质和多肽。
“分泌蛋白质”-由细胞内转运至胞外的蛋白质，其中有大量的生长因子和免疫调节蛋白质，如多种干扰素(α、β、γ)、白介素如IL-1、-2、-4、-8和-12及生长因子如GM-CSF、G-CSF。
“遗传融合”-由编码这些蛋白质的多聚核苷酸序列分子遗传表达的、通过单个肽骨架共线性的、共价连接的两个或多个蛋白质。
“突变”-一种生物体遗传物质量或结构的任何变化，尤其是指在野生型干扰素基因的任何变化(即缺失、替代、添加或改变)或野生型干扰素蛋白质中的任何变化。
“野生型”-存在于体内的天然存在的干扰素基因的多聚核苷酸或干扰素蛋白质的氨基酸序列。
“标准杂交条件”-杂交和冲洗所需的盐浓度和温度基本上为0.5×SSC到大约5×SSC和65℃。这里所用的“标准杂交条件”是一个操作性定义并包括杂交的范围。高度严格的条件可，例如包括用噬斑筛选缓冲液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％ Ficoll400；0.2％牛血清白蛋白质、50mM Tris-HCl(pH7.5)；1M NaCl；0.1％焦磷酸钠；1％ SDS)；10％硫酸葡聚糖和100μg/ml变性的超声处理的鲑精DNA在65℃温度下杂交10-20小时，并于65℃用75mM NaCl/7.5mM柠檬酸钠(0.5×SSC)/1％ SDS冲洗。低度严格条件可，例如，包括用噬斑筛选缓冲液、10％硫酸葡聚糖和110μg/ml变性超声处理的鲑精DNA在55℃下杂交12-20小时，并于55℃用300mM NaCl/30mM柠檬酸盐(2.0×SSC)/1％SDS冲洗。
“表达控制序列”-当这些基因有效地相连时控制和调节基因表达的核酸序列。
“有效地连接”-当表达控制序列控制和调节多聚核苷酸序列的转录和翻译时，将多聚核苷酸序列(DNA、RNA)有效地与表达控制序列相连。“有效地连接”一词包括具有合适位于待表达多聚核苷酸序列前方的起始信号(如ATG)，并保留着正确的阅读框架，使在表达控制序列的控制下表达多聚核苷酸序列，生产由分离的多聚核苷酸序列编码的期望干扰素。
“表达载体”-多聚核苷酸，经常是DNA质粒(但也包括病毒)，当表达载体导入宿主细胞中时其可允许至少一种基因的表达。载体能或者不能在细胞中复制。
“肿瘤”-不希望的细胞增殖。此生长包括恶性的和非恶性的、实体和液体肿瘤、癌、骨髓瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤和其它的癌性的、肿瘤的或者致瘤性的疾病。
“遗传修饰的细胞”(也称为“细胞表达系统”)包括细胞和用于表达干扰素蛋白质的表达载体。为了离体治疗的目的，该遗传修饰细胞适当地施用给哺乳动物受体，其中它们替换或与受体内源性细胞共存。为了体内治疗目的，在受体内产生这些细胞。
本发明也提供了制备和利用上述遗传修饰的细胞的多种方法。本发明尤其提供了对哺乳动物受体细胞进行离体遗传修饰和将该遗传修饰的细胞施用给哺乳动物受体的方法。在离体基因治疗的优选实施方案中，细胞是自体细胞，也就是从哺乳动物受体中取出的细胞。在这里，“取出的”一词意思是一个细胞或细胞群已从其体内的天然存在的位置上取出。从患者身上“取出”细胞的方法和培养已分离出的细胞的方法对本领域普通技术人员而言是已知的。(Stylianou，E等人)国际肾脏病(Kidney Intl)，371563-1570(1992)；Hjelle，J.H.等人，国际腹膜透析(Peritoneal Dialysis Intl)，9341-347(1989)；Heldin，P.，生物化学杂志(Biochem.J.)283165-170(1992)；Di Paolo，N等人，Int.J.Art.Org.12；485-501(1989)；Di Paolo，N等人，临床肾脏病(ClinicalNephrol)34179--1848(1990)；Di Paolo，N等人，肾脏病(Nephron)57323-331(1991))。发明详述中在此处，包括上面和下面提及的所有专利、专利申请和出版物，在此引入供参考。II.分离的干扰素多聚核苷酸
“干扰素”(也作“IFN”)是小分子的、种属特异性的单链多肽，由哺乳动物细胞应答接触多种诱导物如病毒、多肽、促分裂原等后生成。最优选的干扰素是重组形式的。并且生产包括多种干扰素的蛋白质的重组DNA的方法是已知的，本发明不受这些方法的限制。查看如美国专利4,399,216、5,149,636、5,179017(Axel等人)和4,470,461(Kaufman)。已生产出干扰素-α、β、γ和共有干扰素的重组体形式。干扰素的不同形态可由含有编码变体如半胱氨酸缺乏突变体(如，干扰素β)和蛋氨酸缺乏突变体的多聚核苷酸序列的细胞表达。其它的修饰可通过宿主细胞翻译后加工系统产生。某一种干扰素的精确的化学结构将因此取决于多方面因素，也没有特意限制发明的范围。此处所述的结构中包括的所有此类干扰素蛋白质，如置于适宜环境中时将保持它们的生物活性。
可在本发明目前方法中应用的优选的多聚核苷酸来自多种脊柱动物中的野生型干扰素基因序列，优选哺乳动物，并且通过那些本领域中具有一般技术的人都知晓的方法可获得此多聚核苷酸。见如，美国专利5,641,656(1997年6月24日授权编码禽I型干扰素前蛋白质和成熟的禽I型干扰素的DNA)。美国专利5,605,688(1997年2月25日狗和马的I型IFN重组体)；美国专利5,554,513(1996年9月10日；编码人干扰素-β 2A的DNA序列)；美国专利5,231,176(1993年7月27；编码人成纤维细胞β2干扰素的DNA分子)；美国专利5,231,176(1993年7月27日，编码人白细胞干扰素的DNA分子)；美国专利5,071,761(1991年12月10日，编码人成淋巴细胞增多瘤干扰素LyIFN-α-2和LyIFN-α-3亚序列的DNA序列)；美国专利4,970,161(1990年11月13日，编码人干扰素-γ的DNA序列)；美国专利4,738,931(1988年4月19日，含有人干扰素-β基因的DNA)；美国专利4,695,543(1987年9月22日，人α-干扰素Gx-1基因)和美国专利4,456,748(1984年6月26日，编码不同的天然存在的白细胞干扰素亚序列的DNA)。
按照本发明可使用干扰素基因家族的突变成员。运用本领域一般技术人员所知的直接诱变的传统方法使野生型干扰素多聚核苷酸序列发生突变。“突变”一词也包括基因融合之意，因此下面作为参考的干扰素序列可全部认为是“突变”序列美国专利5,273,889(1993年12月28日，包括与编码免疫源性白细胞毒素的序列相连的干扰素γ基因的DNA构建体)；美国专利4,959,314(1990年9月25日，具有编码天然生物活性蛋白质的合成突变体的DNA序列的基因)；美国专利4,929,554(1990年5月29日，编码des-CYS-TYR-CYS重组人免疫干扰素的DNA)；美国专利4,914,033(1990年4月3日，编码包括β干扰素的修饰过的干扰素β的DNA分子)和美国专利4,569,908(1986年2月11日，含有编码多级杂合干扰素多肽的核苷酸序列的DNA)。
而且，这些专利中描述的分离的多聚核苷酸可改变成具有等同功能的多聚核苷酸。如果一多聚核苷酸满足下列至少一个条件，与上述序列相比较而言，该核苷酸是“功能等同物”(a)“功能等同物”是能与任何上述序列在标准杂交条件下杂交的多聚核苷酸和/或为上述任何序列的简并体。更优选地，它编码具有野生型干扰素的治疗效果的突变干扰素；(b)“功能等同物”是指编码表达由任何上述的干扰素序列多聚核苷酸编码的氨基酸序列的多聚核苷酸。
总之，术语“干扰素”包括，但不仅局限于，上述列举的药物及其功能等同物。“功能等同物”用在这里是指干扰素蛋白质，或编码对哺乳动物受体具有与其功能等同物相比相同或更高的有利作用的干扰素蛋白质的多聚核苷酸。本领域一般技术人员知晓，功能等同物可通过重组技术例如通过“功能等同DNA”的表达来产生。因此本发明包括由天然存在的DNA编码的和非天然存在的DNA编码的干扰素，非天然存在的DNA与天然存在的DNA编码相同的蛋白质。由于核苷酸编码序列的简并性，可用其它的多聚核苷酸编码干扰素。这些包括全部或部分的上述序列中由于编码相同氨基酸残基的不同密码子的替换而发生改变的序列，这样产生了沉默突变。这些改变的序列被认作是这些序列的等同物。如，Phe(F)由两个密码子编码，TTC或TTT，Tyr(Y)由TAC或TAT编码，而His(H)由CAC或CAT编码。另一方面，Trp(W)仅由一个密码子TGG编码。因此，人们知晓对给定的编码特定干扰素的DNA序列而言可由多种DNA简并序列来编码。这些简并的DNA序列也在本发明考虑范围之内。
此定义也包括共有干扰素。在这里“共有干扰素”是一非天然存在的多聚核苷酸，其主要包括对所有天然存在的人干扰素亚型序列共同的氨基酸残基，也包括主要在所有亚型无共同氨基酸的一个或多个位置上出现的氨基酸，但不包括在至少一个天然存在的亚型的上述位置上不存在的氨基酸。只要它们具有亚型序列，任何上面提到的干扰素的共有序列也包括在共有干扰素序列中。美国专利4,695,623和4,897,471(Amgen)公开了共有干扰素的例证。通过在这些专利中描述的或其它标准方法可合成编码共有干扰素的DNA序列。共有干扰素多肽优选地如这里描述为将产生的DNA序列转化或转染入宿主细胞后表达的产物。也就是共有干扰素优选地重组生成。通过本领域已知的方法可将这些物质纯化。
上述公开的干扰素和适宜基因替代治疗的疾病仅作举例说明，无意限制本发明的范围。对治疗已知疾病适宜的干扰素的选择属于具有本领域一般技术人员的能力范围内，无需过分的实验。III.将分泌蛋白质的多聚核苷酸序列导入细胞的方法“转化”或“转变”一词是指细胞的任何遗传修饰，并包括“转染”和“转导”。
在此“细胞转染”是指通过添加DNA的掺入使细胞获得新遗传物质。这样，转染是指运用物理或化学的方法将核酸(例如DNA)插入细胞。本领域技术人员所知的几种转染技术包括磷酸钙DNA共沉淀法(分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，卷7，基因转移和表达方法(Gene Transfer and Expression Protocols)，E.J.Murray编，Humana出版社(1991))；DEAE-葡聚糖(同上)；电穿孔法(同上)；阳离子脂质体介导转染(同上)；和钨粒子协助的显微粒子轰击(Johnson，S.A，自然346；776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀法(Brash D.E等人，分子细胞生物(Molec.Cell.Biol.)7；2031-2034(1987))。本领域详细阐述了上述各个方法。
相反，“细胞转导”是指使用DNA或RNA病毒将核酸转入细胞内的方法。病毒内的编码一种或多种干扰素蛋白质的一种或多种分离的多聚核苷酸序列可掺入转导细胞的染色体中。或者，用病毒转导细胞，但该细胞染色体内并未掺入分离的多聚核苷酸，但具有在胞内染色体外表达干扰素的能力。
根据一个实施方案，离体转化细胞(即遗传修饰)。从哺乳动物(最好是人)身上分离细胞，并用含有如与一个或多个表达重组分泌蛋白质(如干扰素)的表达控制基因有效地连接的分离的多聚核苷酸的载体转化。然后将这些细胞施用给哺乳动物受体以体内原位递送蛋白质。优选地哺乳动物受体是人，且待修饰细胞是自体固有的细胞，也就是，细胞自哺乳动物受体上分离。已经报道体外分离和培养细胞的方法。
根据另一实施方案，细胞经过体内转化或者是遗传修饰。哺乳动物受体(优选是人)的细胞在体内用一种载体转化(即转导或转染)，载体中含有如有效地连接至一个或多个表达控制序列以表达重组分泌蛋白质(也就是重组干扰素)的分离的多聚核苷酸，并且原位递送蛋白质。
为提供遗传修饰的细胞，通过离体或体内基因转移方法，如转染或转导，将编码分泌蛋白质(如编码一种或多种治疗性干扰素蛋白质的cDNA)的分离的多聚核苷酸导入细胞内。多种表达载体(也就是协助运送分离的多聚核苷酸进入靶细胞的工具)为本领域一般技术人员共知。
一般地，导入的遗传物质包括分离的多聚核苷酸如干扰素基因(通常是包括编码干扰素的外显子的cDNA的形式)，和控制新基因转录的启动子。启动子特征性地具有特定的启动转录必需的核苷酸序列。任选地，遗传物质可包括可通过RNA剪接方法从成熟转录本去除的内含子序列。待表达基因的3′端应有多聚腺苷酸化信号。导入的遗传物质也应包括合适的分泌“信号”序列以便将治疗用基因产物(即干扰素)自细胞分泌到细胞外培养液中。
任选地，分离的遗传物质还包含为获得期望的基因转录活性所需的附加序列(也就是，增强子)。本文中“增强子”仅是邻近编码序列的(顺式)可改变由启动子支配的基础转录水平的非翻译DNA序列。
为使启动子和编码序列有效地连接以便转录编码序列，优选将分离的遗传物质导入细胞基因组的靠近启动子的下游区。优选的病毒表达载体包括控制插入干扰素基因转录的外源性启动子元件。该外源性启动子包括组成型的和可诱导的启动子。
天然存在的组成型启动子控制调控基本细胞功能的蛋白质的表达。结果，在细胞生长的所有条件下，受组成型启动子控制的基因能够表达。组成型启动子的例子有编码某些组成型或“看家”功能的基因的启动子，它们是次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)(Scharfmann等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)884626-4630(1991)。腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、β-肌动蛋白质启动子(Lai等人，美国国家科学院院报86100006-10010(1989))和其它本领域所知的组成型启动子。
此外，许多病毒启动子在其真核细胞中组成型地行使功能。其包括SV40的早期及晚期启动子(Berroist和Chamben，自然，290304(1981)；莫洛尼白血病病毒和其它逆转录病毒的长末端重复(LTR)片段(Weiss等人，RNA肿瘤病毒(RNA Tumor Viruses)，Cold spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1985))；单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子(Wagner等人，美国国家科学院院报，781441(1981))；巨细胞病毒立即早期(IE1)启动子(Karasuyana等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)16913(1989))；Rous肉瘤病毒(RSV)启动子(Yamamoto等人，细胞(Cell)22787(1980))；腺病毒主要晚期启动子(Yamamoto等人，美国国家科学院院报823567(1985))等等。因此，可用任何上述组成型启动子控制插入基因的转录(也参见B部分)。
如果是将干扰素基因递送至特定组织，需定位表达此基因。例如，文献中提到的许多启动子都只在特定组织内表达。示例有乙型肝炎病毒的肝脏特异性启动子(Sandig等人，基因疗法31002-1009(1996)和白蛋白基因(Pinkent等人，基因及发育(Genes and Development)，1268-276(1987)；其它肝脏特异性启动子也见Guo等人，基因治疗，3802-810(1996)。而且文献中提到的多种启动子只在特定肿瘤中表达。示例包括如PSA启动子(前列腺癌)、癌胚性抗原启动子(结肠癌和肺癌)、β-酪蛋白启动子(乳腺癌)、酪氨酸酶启动子(黑素瘤)、钙调磷酸酶Aα启动子(神经胶质瘤、成神经细胞瘤)、c-sis启动子(骨肉瘤)和α-甲胎蛋白启动子(肝癌)。
可诱导启动子控制下的基因只在诱导物的存在下才表达或者表达程度有所提高(例如在某些金属离子的存在下，金属硫蛋白启动子的转录明显提高)。也参见鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(MMTV LTR)序列中存在的糖皮质激素诱导启动子(Klersig等人，分子细胞生物，41354(1984)。可诱导启动子包括结合其诱导因子后可刺激转录的应答性元件(RE)。例如血清因子、类固醇激素、视黄酸和cAMP的RE。为了获得诱导反应可选择含有特异RE的启动子，在一些情况中，可将RE本身连至不同的启动子从而赋予重组基因以可诱导性。
这样，通过选择适宜的启动子(组成型的或可诱导的；强的或弱的)，可控制干扰素在遗传修饰细胞中的存在和表达水平。如果编码干扰素的基因由可诱导启动子来控制，通过使遗传修饰的细胞原位暴露于允许转录干扰素的条件下，如通过注入控制干扰素转录的可诱导启动子的特定诱导物，启动干扰素原位递送。例如，通过使含有适宜(也就是诱导)金属离子的溶液原位与遗传修饰的细胞接触，可增强金属硫蛋白启动子控制下的干扰素基因编码的干扰素蛋白质由遗传修饰细胞原位表达。
最近，通过外源性施用小分子，开发了可允许精确控制蛋白质表达的复杂系统。这包括FK506/雷帕霉素系统(Rivera等人，自然医学(Nature Medicine)2(9)1028-1032，1996)；四环素系统(Gossen等人，科学2681766-1768，1995)、蜕皮素系统(No等人，美国国家科学院院报933346-3351，1996)和孕酮系统(Wang等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)15239-243，1997)。
因此，原位递送的干扰素的数量由下列因子控制(1)用来控制插入基因转录的启动子的性质(也就是，启动子是组成型的还是诱导的、强的还是弱的，或者是组织特异性的)；(2)插入细胞的外源基因的拷贝数量；(3)施用给(如植入)病人的转导/转染细胞的数目；(4)离体方法中植入物的大小(例如，移植物或有包囊的表达系统)；(5)离体方法中植入物的数量；(6)通过体内施用转导/转染细胞的数量；(7)离体或体内方法中转导/转染细胞或植入物的存留时间和(8)遗传修饰细胞干扰素的生成率。
对影响递送治疗有效剂量的特定干扰素的因素的选择和优化属于本领域普通技术人员的掌握范围内而不需要过多的实验，同时要考虑到上述公开的影响因素和患者的临床表现。
因为通过我们的基因治疗方法表达的蛋白质是分泌蛋白质，不含有基因治疗载体的周围细胞也受到影响(参见实施例)。结果，本方法一般不需要应用可选择的基因。不过，除了至少一种启动子和至少一种编码干扰素的分离的多聚核苷酸外，表达载体可任选地包括一种选择基因，例如新霉素耐药基因，用以协助筛选择已被表达载体转染或转导的细胞。或者是用两种或更多的表达载体转染细胞，至少一种载体包含编码干扰素的基因，其它载体含有选择基因。适当的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列的选择(下面述及)属于本领域普通技术人员掌握范围而无需过多的实验。IV.准备特异性基因治疗载体的方法本领域所知的向载体插入多聚核苷酸序列的方法均可采用。见，例如，Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratony，Cold SpringHarbor，NY(1989)和Ausubel等人，当前分子生物学手册(CurrentProtocols in Molecular Biology)，J.Wiley & Sons NY(1992)。常规的载体包括有效地与编码特定干扰素的多聚核苷酸相连的适宜的转录/翻译控制信号。也可用启动子/增强子来控制干扰素的表达。(见III部分)与用以肿瘤细胞基因治疗的哺乳动物宿主细胞相容的表达载体包括，如质粒；禽、鼠和人的逆转录病毒载体；腺病毒载体；疱疹病毒载体；细小病毒和非复制痘病毒。具体地，复制缺陷性重组病毒可由只生成复制缺陷病毒的包装细胞系产生。见当前分子生物学手册，第9.14-9.14节(Ausubel等人编辑)，Greene Publishing Associcates，1989。
现在已很好地建立了用于基因转移系统的特定病毒载体。参见例如Madzak等人，普通病毒学杂志(J Gen，Virol)，731533-36(1992)(乳多空病毒SV40)；Berkner等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol，15839-61(1992)(腺病毒)；Moss等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol 15835-38(1992)(牛痘病毒)；Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immunol.15897-123(1992)(腺病毒相关病毒)；Margulskee，Curr.Top.Microbiol.Immunol.15867-93(1992)(单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒(HBV))；Millor，Curr.Top.Microbiol Immunol，1581-24(1992)(逆转录病毒)；Brandyopadhyay等人，分子细胞生物，4749-754(1984)(逆转录病毒)；Miller等人，自然，357455-450(1992)(逆转录病毒)；Anderson，科学，256808-813(1992)(逆转录病毒)。
优选的载体是DNA病毒，其中包括腺病毒(优选是基于Ad-2或Ad-5的载体)、疱疹病毒(优选是基于单纯疱疹病毒的载体)、细小病毒(优选基于“缺陷性的”或非自主细小病毒的载体，更优选基于腺病毒相关病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。参见例如，Ali等人，基因治疗(Gene Therapy)1367-384，1994；美国专利4,797,368和5,399,346及下面的讨论。
转移例如干扰素序列的特定载体系统的选择依赖于多种因素。一个重要的因素是靶细胞群的性质。尽管逆转录病毒已得到广泛研究并用于许多基因治疗应用之中，但是因为它们只在复制细胞中整合和表达其基因，它们一般不适于感染不能分裂的细胞，而可能对肿瘤治疗有效。它们对离体方法来说是有效的，基于它们对靶细胞基因组的稳定的整合作用使其更具吸引力。
腺病毒是真核生物DNA病毒，可将其修饰从而高效向多种细胞类型递送治疗性或者报告转基因。普通腺病毒类型2和5(分别为Ad2和Ad5)可导致人类呼吸性疾病，现已发展用于杜兴氏性肌营养不良(DMD)和囊纤维变性(CF)的基因治疗。Ad2和Ad5都属于与人类恶性肿瘤无关的腺病毒的亚类。不论是否处于有丝分裂状态，腺病毒载体能向实际上所有的细胞类型提供非常高水平的转基因递送。在293细胞(腺病毒转化的互补人胚肾细胞系ATCC CRL 1573)可生成高滴度(1011噬斑形成单位/毫升)的重组病毒，并且该病毒可长时冷冻保留而无明显死亡。在多种疾病的动物模型中，此系统在体内递送治疗用转基因以弥补基因失衡的有效性已经得到证实。参见Y.Watanabe，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)，36261-268(1986)；K.Tanzawa等人，FEBS文献(FEBS Letters)，118(1)81-84(1980)；J.L.Golasten等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)，309(11983)288-296(1983)；S.Ishibashi等人，临床研究杂志(J.Clin Invest)，92883-893(1993)；和S.Ishibashi等人，临床研究杂志，931889-1893(1994)。实际上，编码囊性纤维化跨膜调节基因(CFTR)cDNA的重组复制缺陷腺病毒已获批准用于几种人类CF临床试验中。例如，J.Wilson，自然，365691-692(1993年10月21日)。用于基因治疗的重组腺病毒安全性的进一步支持性的论据是肝腺病毒疫苗在人群中的广泛应用。
人类腺病毒包含线性的、大约36kb的双链DNA基因组，分为100个图距单位(m.u.)，每个长度为360bp。此DNA在基因组的每个末端含有病毒DNA复制需要的短反向末端重复(ITR)序列。基于在病毒DNA合成起始前或之后的表达，把基因产物归入早期(E1到E4)和晚期(L1到L5)区域。见，例如，Horwitz，病毒学，第二版，B.N.Fields编辑，Raven Press Ltd.，纽约(1990)。
在其正常的病毒生命周期中，腺病毒基因组经历了高度调控的过程。见Y.Yang等人，美国国家科学院院报，91；4407-4411(1994)。病毒颗粒由细胞内化，进入核内体，并由此处进入胞浆，开始失去其蛋白质外壳。病毒颗粒DNA迁移至胞核，在此处它保持其染色体外的线性结构而不是整合至染色体中。立即早期基因E1a和E1b在核内表达。这些早期的基因产物调控腺病毒转录，并为病毒复制和表达多种宿主基因(使细胞用来生成病毒)所需，并且对延迟早期基因(如E2、E3和E4)及其后的晚期基因(如L1-L5)的级联活化非常重要。
已经用于基因治疗的第一代重组的复制缺陷腺病毒含有全部E1a和部分E1b区的缺失。复制缺陷病毒在含有能提供反式E1蛋白质的功能性腺病毒E1区的293细胞中生长，由此E1-缺失的腺病毒得以复制。产生的病毒能感染许多细胞类型并可表达导入的基因(在其含有启动子的前提下)，但是不能在不含有E1区DNA的细胞中复制。重组腺病毒的优点是其具有广泛的宿主范围，可感染静止或晚期分化细胞如神经元，并且好象基本上没有致瘤性。腺病毒似乎不整合至宿主基因组中。因为它们以染色体外的形式存在，插入突变的危险性明显降低。重组腺病毒产物滴度很高，病毒颗粒中度稳定，表达水平高并且可感染多种细胞。
腺病毒相关病毒(AAV)也可作为载体用于体细胞基因治疗。AAV为小型的单链(SS)DNA病毒，由小基因组(4.7kb)组成，这使之成为基因工程化的理想底物。两个开放阅读框架编码一系列rep和cap多肽。Rep多肽(rep78、rep68、rep62和rep40)参与AAV基因组的复制、复活和整合。cap蛋白质(VP1、VP2和VP3)组成病毒颗粒壳体。rep和cap开放阅读框架5′和3′末端旁侧是145bp反向末端重复序列(ITR)。其前125bp序列可形成Y或T形双链结构。AAV载体最重要的进展是全部rep和cap结构域可用治疗性的或报告转基因切除和替代。见B.J.Carter，细小病毒手册(Hand book of Parvoviruses)，P.Tijsser编辑，CRC出版社，155-168页(1990)。已表明ITR代表用以复制、复活、包装和整合AAV基因组的最小序列。
AAV生命周期是双相的，由潜伏期和裂解期组成。在潜伏感染期，AAV病毒颗粒以包壳化的ssDNA进入细胞内，随后很快地递送至细胞核，在这里AAV DNA稳定地整合至宿主染色体中而无明显的宿主细胞分裂。在没有辅助病毒的情况下，整合AAV基因组仍处于潜伏期，但能够得以活化和挽救。当带有AAV前病毒的细胞遭受疱疹病毒或腺病毒二次感染时，该生命周期的裂解期就开始了，其中疱疹病毒或腺病毒可编码AAV所需的协助其从宿主染色质中脱离的辅助功能(B.J.Carter，同上)。以rep依赖方式，将感染亲本单链(ss)DNA扩展成双链复制形式(RF)DNA。复活的AAV基因组包装于预先形成的蛋白质壳体中(对称性二十面体，直径大约20nm)，并且在细胞裂解后以包装的+或-ssDNA基因组的感染病毒颗粒的形式释放。
AAV在基因治疗中有潜在作用。病毒颗粒非常稳定，并且因为重组AAV可通过沉淀法或CsCl梯度显带法纯化，重组AAV(rAAV)具有“药物样”特性。它们具有热稳定性并可冻干制成粉剂，再水化后恢复完全活性。它们的DNA稳定整合到宿主染色体中，这样表达是长期的。它们有广泛的宿主范围并且AAV不导致任何已知疾病，因此重组载体是无毒性的。
发现在小鼠中AAV的高水平基因表达持续至少1.5年。见Xiao，Li和Samulski(1996)病毒学杂志(Journal of Virology)70，8089-8108。因为无病毒毒性和细胞宿主免疫反应的证据，基因治疗的局限性已得到克服。
Kaplitt、Leone、Samulski、Xiao、Pfaff、O＇Malley和During(1994)自然遗传学(Nature Genetics)8，148-153描述了在直接颅内注射AAV载体后，可观察到大鼠脑内有长期的(长达4个月)酪氨酸羟化酶的表达。这是治疗人类帕金森病的潜在方法。表达是高效的，而且病毒是安全和稳定的。
Fisher(自然医学(1997)3，306-312)报道了在向肌肉注射AAV后，在小鼠体内有稳定的基因表达。还有，病毒是安全的。未发现抗病毒或外来基因产物的细胞或体液免疫反应。
Kessler等人(美国国家科学院院报，(1996)93，14082-14087)报道在小鼠肌内注射AAV后有促红细胞生成素(Epo)的高水平表达。已发现循环血液中有Epo蛋白质存在，也报道了红细胞数的增多，显示其有治疗潜力。这个小组的其它工作已用表达HSVtk基因的AAV作为治疗癌症的方法。在实体瘤中已发现有基因的高水平表达。
最近，重组杆状病毒，主要源自杆状病毒Autographa california多核多角状病毒(AcMNPV)，表现出体外转导哺乳动物细胞的能力。(见Hofmann，C.、Sandig，V.、Jennings，G.、Ruodolph，M.、Schlag，P.、和Strauss，M.(1995)，“通过杆状病毒载体向人肝细胞的有效基因转移”，美国国家科学院院报，92，10099-10103；Bovye，F.M.和Bucher，N.L.R.(1996)“向哺乳动物细胞进行的杆状病毒介导的基因转移”，美国国家科学院院报92，2348-2352)。
重组杆状病毒在基因治疗中具有多种潜在优点。包括很高的DNA的插入能力、在人体内无已有的免疫反应、在哺乳动物体内无法复制、在哺乳动物体内无毒性、由于杆状病毒转录启动子的昆虫特异性使得病毒基因在哺乳动物细胞内无表达，而且，可能没有抗这些病毒蛋白质的细胞毒性T淋巴细胞反应。IV.干扰素效力/鉴别测试通过表达载体向细胞施用干扰素多聚核苷酸。一般地通过分析(i)细胞形态学的转变；(ii)细胞增殖的抑制及(iii)抗病毒活性，来测试给定基因治疗载体对具体细胞条件和代谢的效力。
在分离的细胞中表达特定干扰素基因产物的具体表达载体的选择和优化通过如下步骤完成获得干扰素基因，优选带有一个或多个合适控制区(如启动子)；准备包括插入干扰素基因的载体的载体构建体；用载体构建体转染或转导培养的细胞；和检测在培养的细胞中是否存在干抗素基因产物。
运用许多容易获得的人类肿瘤细胞系中的任何一种可体外测试编码干扰素的多聚核苷酸的转染效果。此类细胞系包括人类膀胱癌细胞系，5637(ATCC HTB9)、人类乳腺癌细胞系，MDA-MB-468(ATCCHTB132)；人类前列腺瘤细胞系，DU145(ATCC HTB81)；人类骨肉瘤细胞系，SAOS2(ATCC HTB85)；人类纤维肉瘤肺转移癌细胞系，Hs913T(ATCC HTB152)；人类子宫颈癌细胞系，HeLa(ATCCECL2)。用编码干扰素的合适的多聚核苷酸可转染这些细胞系的每一种细胞，并且转染对细胞生长和细胞形态学的影响可通过本领域已知方法测定，如台盼蓝排斥试验测定细胞存活率、细胞计数法来测量细胞随时间的扩增情况和氚标记的胸腺嘧啶掺入法测量DNA复制。
通过运用实施例3描述的方法可容易测定分泌蛋白质对周围细胞的影响，周围细胞不含有编码此蛋白质的适宜多聚核苷酸的载体。
一旦导入靶细胞后，可运用常规方法对干扰素序列进行鉴定，如利用含有与插入的突变干扰素序列同源/互补序列的探针进行核酸杂交。可通过逆转录酶聚合酶链反应测定干扰素转录。或者通过常规的抗病毒分析或ELISA分析测定细胞条件培养基中的干扰素蛋白质。在另一方法中，通过向靶细胞导入表达载体后观察“标志”基因功能(如胸腺嘧啶激酶活性，抗生素耐药性等)的有无来鉴别序列。例如，如果将编码干扰素-β1a的多聚核苷酸插入到具有SV40早期启动子独立控制的显性可选择的标志基因(如新霉素磷酸转移酶基因)的载体内，就可通过标志基因功能(遗传霉素耐药性)的存在鉴别该序列。对具有本领域普通技术的人员来说，检测合适载体的其它方法是方便易得的。V.用途A.干扰素和感染性疾病已将干扰素用于治疗细菌、真菌和病毒感染。流感和疱疹性口炎病毒(VSV)对干扰素所致的抑制尤其敏感，在干扰素活性的分析及干扰素抗病毒活性之机制的研究中经常得以使用。其它既为人类病原体并且似乎也对干扰素敏感的病毒包括肝炎病毒B(HBV)、肝炎病毒C(HCV)、肝炎病毒D、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、鼻病毒和脑心肌炎病毒。
肝炎是较有吸引力的病毒性疾病靶点。病毒性肝炎是多种病毒导致的肝病，是重要的全球性的健康问题。已分离并克隆得到五种不同的人类肝炎病毒。这些病毒为肝炎病毒A、B、C、D、E。有些急性和慢性病毒性肝炎似乎和其它未表征的肝炎病毒有关，如新发现的肝炎病毒G。流行程度最高的病毒是A、B和C。除了导致急性与慢性肝损害和炎症外，HBV和HCV感染可导致肝细胞癌。已表明干扰素在一定水平可体内抑制HBV和HCV，也可抑制细胞培养中的肝炎病毒D和肝炎病毒A。
可通过导入干扰素基因治疗病毒性肝炎。递送该基因的优选靶细胞是肝脏中的肝细胞。尽管离体治疗(如，移出肝细胞后导入表达干扰素的多聚核苷酸，再移植给病人)是可能的，尤其优选体内递送基因。通过外科手术将基因注射入肝脏门静脉内或通过导管注入肝动脉。理想地，采取低侵入性措施如静脉内注射。
在合适的表达载体中由转录启动子控制干扰素基因。该转录启动子可以是细胞或病毒(CMV、SV40、RSV等)来源。需要肝脏-特异性基因表达时，优选肝细胞-特异的细胞启动子如白蛋白增强子/启动子、α1-抗胰蛋白质酶启动子或HBV增强子/启动子。文献中述及许多肝脏-特异性的启动子(见上)。
也可以设计一种载体，使其中的干扰素基因仅在肝炎受染细胞内表达。例如，可由HBV转录因子HBx诱导表达干扰素基因，该转录因子仅在受HBV-感染过的肝细胞中存在。另外，可使用“载体”系统。其可以是非病毒递送系统如阳离子脂质体或蛋白质DNA偶联物(通过结合肝细胞上的无唾液酸糖蛋白质受体可将DNA与无唾液酸糖蛋白质的偶联物优先递送到肝脏)。
然而，迄今为止，最有效的基因递送系统是病毒来源的。已采用重组逆转录病毒将基因递送到离体的人肝细胞中。动物模型表明，静脉内体内施用后，重组腺病毒可以非常有效地定位到肝脏。静脉内注射的腺病毒约98％定位到肝脏。
体内施用重组腺病毒相关病毒(rAAV)后似乎也可使肝脏感染。可使用其它类型的病毒如α病毒、慢病毒或其它哺乳动物病毒。最近，已发现一种非哺乳动物病毒，昆虫-特异性杆状病毒能有效地在肝脏中递送并表达基因(Hofman等人，1995；Boyce和Bucher，1996，见上)。
举例来说，可用重组腺病毒体内递送干扰素基因。已构建了多组复制缺陷性腺病毒。第一代此类病毒由于E1区缺失而为缺陷型。该缺陷在表达腺病毒E1区的293细胞系中得到互补。优选使用有更大缺陷的重组腺病毒，其中E1、E2a和/或E4基因缺失。所有这些缺失的功能可在包装细胞系中表达。将干扰素基因置于大量启动子中任一个的下游(例如CMV立即早期启动子、RSV LTR、细胞肌动蛋白启动子、白蛋白增强子/启动子或其他肝脏特异性启动子)。将该基因盒置于重组腺病毒中替代一种缺失基因，如E1基因，而形成腺病毒转移载体。
按标准方法转染入包装细胞后，通过直接连接或同源重组得到含有干扰素基因的重组腺病毒。将含干扰素基因的重组病毒原种进行多次噬斑纯化后再在包装细胞内大量扩增生产。可用CsCl显带法、柱色谱法或其他方法纯化病毒，再在包装细胞上测定效价。E1和E2a中有缺陷的腺病毒(Engelhardt等人，美国国家科学院院报，P16196-6200，1994)以及E1和E4中有缺陷的腺病毒(Gao等人，病毒学杂志(J.Virology)，708934-8943，1996)的产生方法已有详述。产生E1中的缺陷腺病毒的方法可见Graham，F.L.和L.Prevec，“构建腺病毒载体的方法”，分子生物技术(Mol Biotech)，3207-220(1995)。
可在试验中测试病毒的多种剂量。病毒剂量大概从107噬斑形成单位(pfu)起，增加至1012pfu。需要的话，可反复施用病毒(如每一到六个月一次)。反复施用病毒所致的体液免疫反应可限制反复施用的效果。此情况下，可与病毒共同施用免疫抑制剂如环孢菌素或抗CD40配体的抗体。
可在动物模型中检测干扰素基因治疗抗病毒性肝炎的效果(见C部分)。例如，就肝炎病毒B而言，可使用许多模型。包括旱獭、鸭、树鼩鼱、大鼠和小鼠。小鼠HBV模型中包括HBV转基因小鼠，其肝脏稳定复制MBV DNA，致使循环中稳定出现HBV病毒。HCV可用黑猩猩模型。可将带有干扰素基因的腺病毒直接施用给肝脏或通过静脉内注射给予。通过监测病毒DNA复制、循环中的病毒颗粒、肝脏酶(ALT)、肝脏病理学和炎症来确定效力。B.癌症已发现在很多情况下干扰素蛋白质具有抗致瘤活性。综述见Wadler和Schwartz，癌症研究(Cancer Research)503473-3486，1990；Martin-Odegand，DN&P，4116-117，1991；及Spiegel，肿瘤学研讨会(Seminars in Oncology)15(5)41-45，1988。已发现用干扰素α和干扰素β治疗一些癌症有效。可单独进行基因治疗，或与常规外科手术、辐照或化疗联合。下面所列癌症仅仅是可进行基因治疗的癌症的一部分，干扰素基因治疗可能在此处未列出的许多疾病中有效。
恶性神经胶质瘤占成人所有原发性脑肿瘤的60-80％。可把人神经胶质瘤细胞植入免疫缺陷性小鼠(裸鼠)的大脑内形成神经胶质瘤模型。已发现干扰素β蛋白质治疗可提高这种小鼠的存活(率)。一些用干扰素β蛋白质治疗神经胶质瘤的试验中出现的一个问题是非肠道途径(静脉或肌肉内注射)施用干扰素β后产生的高度毒性。将干扰素β基因局部递送到大脑内，比如在外科手术时，可以在脑内长期产生干扰素β而没有系统性施用蛋白质后所出现的副反应。
黑色素瘤是干扰素基因治疗的绝好目标。恶性转移性黑色素瘤的预后很差。该病发生率正迅速升高，常规化疗效果不明显。黑色素瘤好象是免疫原性的肿瘤类型，因为病人的反应依赖于宿主的免疫反应。在该病中干扰素β的抗增殖活性和免疫调节活性均有效。我们观察到干扰素β蛋白质对培养的恶性黑色素瘤细胞有直接的抗增殖效应。
血管瘤是毛细血管内皮增生性疾病，导致肥大细胞、成纤维细胞和巨噬细胞聚集，从而引起组织损伤。虽然通常无害，血管瘤可危及紧要器官而导致死亡。已发现α干扰素蛋白质可引起婴儿类固醇抗性血管瘤的早期抑制(Mantin-Odegard，见上)。
已发现干扰素蛋白质治疗白血病、淋巴瘤和骨髓瘤有效。这些疾病中所表现出的功效与一般发现相反，该发现认为尽管干扰素蛋白质对体外癌症治疗有很好的功效，体内效应却很不相同。不过，在人类临床试验中α干扰素对毛发细胞白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤有效。β干扰素蛋白质抑制培养的肾细胞癌细胞的生长。IFN-α治疗肾细胞癌的应用已获批准。
结肠直肠癌在美国是导致与癌症相关的死亡的主要原因。IFN-α、IFN-β和IFN-γ蛋白质对培养的人结肠癌细胞有显著的抗增殖效应。结肠癌常转移到肝脏，导致可怕后果。可使用腺病毒或其它亲肝脏递送系统将干扰素基因递送到肝脏来治疗转移灶。由于用腺病毒进行肝脏递送的高效性，肝细胞癌成为具有吸引力的目标。已观察到IFN-β蛋白质明显抑制培养的人肝细胞瘤细胞的增殖。
在一些临床试验中发现干扰素能有效治疗不宜手术的非小细胞型肺癌，但在其它临床试验中没发现此作用。发现两种人肺癌细胞系对β干扰素蛋白质引起的生长抑制敏感(β比α更有效)。在一次临床试验中，静脉内施用干扰素后观察到明显的与干扰素相关的毒性。将β干扰素基因局部递送到肺脏(或许通过气溶胶(法)递送重组的腺病毒载体)能产生功效，而没有系统性递送蛋白质后出现的毒性(反应)。体外，已观察到β干扰素蛋白质对小细胞肺癌细胞增殖的抑制(现象)。
α干扰素蛋白质抑制裸鼠中的乳腺癌异种移植物的生长。β干扰素抗乳腺癌有效，这不仅因为其有抗增殖效应，也因为其可诱导体内产生雌激素受体和孕酮受体，使乳腺癌对抗雌激素药物三苯氧胺更敏感。I表示在人乳腺癌小鼠模型中用IFN-β进行基因治疗的实验数据(见实施例3和4)。
卵巢癌症是一可能的疾病靶标。在抑制培养的卵巢癌细胞之增殖方面，β干扰素蛋白质似乎不如α干扰素活性高。这种情况下，由于此类肿瘤易布满腹腔，可通过将基因治疗载体注入腹膜的方法进行治疗。
总之，尽管用干扰素蛋白质获得的临床结果并非都是阳性的，干扰素蛋白质已在许多情况中表现出抗癌特性。联合常规化疗药物对IFN-α和IFN-β蛋白质测试，发现这些药物在许多指征中有协同作用，这些指征包括子宫颈癌细胞、喉癌细胞、白血病细胞、肾细胞癌、结肠腺癌和骨髓瘤。也相信干扰素有抗血管生成活性。局部IFN-β水平与血管生成能力负相关。一些数据表明为抑制血管生成需维持IFN-β蛋白质的水平。这种情况下，优选干扰素基因治疗而不是蛋白质治疗，因为后者中高水平的干扰素蛋白质很快降至低水平或无法检测到的水平。C.动物基因治疗模型具备一般技术的本领域人员知晓可测试离体和体内基因治疗的许多动物模型。最常用的啮齿类癌症模型是人肿瘤异种移植裸鼠(nu/nu)模型。通过培养使人癌症细胞增殖，并使有效地连接到合适的表达控制序列上的编码干扰素的基因转染或感染上述细胞。再将该细胞注射入裸鼠模型。一般地，将肿瘤细胞皮下注射到小鼠背部，形成实体瘤块(见实施例1)。或者，可将肿瘤细胞同位注射到其本应自然出现的器官内(肺癌细胞可注射入肺；结肠癌细胞注射入结肠，等等)。通过测量瘤块直径随时间的变化观察肿癌的生长状况(见实施例2)。
Okada等人(1996)基因治疗(Gene Therapy)3，957-964通过直接的颅内常规注射使人神经胶质瘤细胞进入小鼠大脑，形成小鼠实验性神经胶质瘤。可检测的肿瘤形成后，将表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)的AAV载体直接注射入同一位点。HSVtk酶使无毒的核苷类似物P-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(GCV)转化成毒性代谢物。基因治疗后，腹腹内施用GCV。接受AAV-tk和GCV(而非对照AAV或无GCV)的AAV-tk的小鼠中，肿瘤体积明显减小。该治疗看起来安全且有效。
在动物模型和早期人类临床试验中也用重组的腺病毒(AdV)来治疗实体瘤。许多这种研究采用类似的裸鼠/人类异种移植模型。一些此类模型实验的例子见下。Clayman等人(1995)癌症研究(CancerResearch)55，1-6建立了人头部和颈部鳞状细胞癌的裸鼠模型。他们发现表达野生型p53的腺病毒能阻止此肿瘤的形成。
Hirschowitz等人(1995)人类基因治疗(Human Gene Therapy)6，1055-1063将人结肠癌细胞导入了裸鼠。肿瘤形成后，将表达大肠杆菌(E.coli)胞嘧啶脱氨酶基因(CD)的腺病毒直接注射入肿瘤内，再系统施用5-氟胞嘧啶(5FC)(CD和5FC是酶/前药联合体，与tk和GCV类似)。他们观察到肿瘤体积减少了4到5倍。
Zhang等人(1996)美国国家科学院院报93，4513-4518在裸鼠中形成了人乳腺肿瘤。将表达α干扰素的腺病毒直接注射到肿瘤内。他们发现100％的动物中肿瘤消退。
Ko等人(1996)人类基因治疗7，1683-1691在裸鼠中形成了人前列腺肿瘤，发现肿瘤内直接注射表达野生型p53的腺病毒抑制了肿瘤的生长。所有治疗过的小鼠在停止治疗后至少12周内未出现肿瘤。
Bioschoff等人(1996)科学(Science)274，373-376在裸鼠中形成了人子宫颈癌和成神经胶质细胞瘤肿瘤。他们用缺失E1B基因的腺病毒治疗该小鼠。缺少E1B时，腺病毒选择性杀伤p53缺陷的肿瘤细胞。直接注射入肿瘤时，该腺病毒使60％的动物肿瘤消退。
Ohwada等人(1996)人类基因治疗7，1567-1576将人结肠癌细胞注射入裸鼠肝脏来模拟结肠癌的肝转移灶。他们再将表达CD的腺病毒注射入肿瘤周围的肝脏。系统性给予5FC治疗可抑制这些动物中肿瘤的生长。
也可以在免疫功能健全的小鼠和大鼠中建立癌症模型。可通过把同源的啮齿类肿瘤细胞注射入小鼠来建立此类肿瘤。或者，此类肿瘤可来自内源细胞。这些情况下，内源性肿瘤可由致癌物处理动物来获得或者由于小鼠的遗传背景而自发形成(例如p53缺陷)。下面是一些例子。
Elshami等人(1996)人类基因治疗7，141-148用表达tk基因的腺病毒治疗了免疫功能健全大鼠中的内源性间皮瘤。将该病毒注射入胸腔内，再系统性施用GCV。他们发现肿瘤重量明显下降，存活时间延长。
Eastham等人(1996)人类基因治疗7，515-523把同源的小鼠前列腺肿瘤细胞系皮下移植入免疫功能健全的小鼠。他们将腺病毒-tk直接注射入肿瘤内并用GCV系统地治疗。作者报道肿瘤体积缩小，动物生命延长。
Bramson等人(1996)人类基因治疗7，1995-2002将表达细胞因子IL-12的腺病毒直接注射到内源性小鼠乳腺肿瘤内。他们发现75％的小鼠肿瘤消退，33％在很长一段时期后仍未出现肿瘤。
Riley等人(1996)自然医学(Nature Medicine)2，1336-1341把表达成视网膜细胞瘤基因的腺病毒直接注射入Rb+/-小鼠自发形成的垂体促黑色素瘤中。他们受治疗的动物中肿瘤细胞增殖能力下降、肿瘤生长减慢，动物寿命延长。
逆转录病毒载体是人类基因治疗临床试验中首先使用的载体。与本专利申请有关的一篇报道是Roth等人(1996)自然医学2，985-991。他们产生了表达野生型p53基因的重组逆转录病毒。用插入到支气管镜中的针将该病毒直接肿瘤内注射到九名患有非小细胞肺癌的病人的肿瘤内。九名病人中，三名出现了肿瘤消退、另三名肿瘤生长得到控制。D.其它实施方案通过例如腹膜内注射或通过把细胞或移植物或含有该细胞的小囊植入受体的细胞相容性位点，来施用遗传修饰的细胞。在此，“细胞相容性位点”指可植入遗传修饰过的细胞、细胞移植物或有囊细胞表达系统而不会引起不良生理反应的受体结构、腔隙或液体。代表性的细胞相容性位点包括，例如，腹膜、胸膜、心包腔以及从中获取细胞的实体瘤或切除肿瘤的器官。
将遗传修饰过的细胞单独移植入细胞相容性位点，或与其它遗传修饰过的细胞联合使用。因此，本发明包括通过使用遗传修饰过的细胞混合物来修饰受体系统的方法，这样第一种修饰过的细胞表达第一种干扰素，第二种修饰过的细胞表达第二种干扰素或其它分泌蛋白质。可添加其它类型的遗传修饰过的细胞(如肝细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、(神经)胶质细胞、内皮细胞或角质形成细胞)，再加上遗传改变的细胞，使导入的一套复合基因表达。另外，可于同样或不同载体上将不止一种重组基因导入每个遗传修饰过的细胞，这样可由单个细胞表达多种干扰素。
本发明还包括一种细胞移植物。该移植物包括如上所述的遗传修饰过的细胞群，该细胞群被连结到适于植入哺乳动物受体的支持物上。该支持物可用自然或合成材料制成。在另一实施方案中，移植物包括一块腹膜。根据本实施方案，支持物是将遗传修饰过的细胞群保持在一起的天然存在的基质。或者，移植物包括连结到天然存在的基质替代物上的上述细胞群(如，Gelfoam(Upjohn，Kalamazoo，Mich)，Dacron，Cortex)根据本发明另一方面，提供有囊细胞表达系统。该包囊系统包括适于植入哺乳动物受体的小囊和含于其内的上述遗传修饰过的间皮细胞。该小囊可由合成或天然存在的材料制成。此类小囊的配制(方法)为本领域一般技术人员已知。与直接植入哺乳动物受体(即植入使遗传修饰过的细胞与细胞相容性位点直接接触)的细胞不同的是，有囊细胞在移植后仍是独立的(即与位点不直接接触)。这样，包囊系统不仅限于包括遗传修饰的非永生化细胞的小囊，也可含有遗传修饰的永生化细胞。VI.配制在一优选实施方案中，遗传修饰的细胞制品含有一定数目的细胞，该细胞数足以将有效治疗剂量的干扰素原位递送到受体内。已知条件下特定干扰素有效治疗剂量的确定属于本领域一般技术人员知识范围，无需过多的实验。这样，确定有效浓度时，一般技术人员要考虑病人病情、病情严重性，以及所施用的特定干扰素的临床研究结果。
若基因或遗传修饰过的细胞事先不存在于药学可接受的载体内，在施用给受体之前将其置于这样的载体内。此类药学可接受的载体包括，例如，等渗盐水和其它适于病人和治疗的缓冲液。
术语“药学可接受的载体”指自然或合成的一种或多种成分，编码干扰素的单个寡聚核苷酸与之联合以便于使用。合适的载体包括无菌盐水，尽管药学可接受的其他水性和非水性等渗无菌溶液和无菌悬液为本领域一般人员已知。在此，术语“载体”包括任何质粒和病毒表达载体。“有效数量”指能改善或延迟疾病的、变性的或受损的状态之进展的数量。有效数量可在个体基础上确定，也可部分根据待治疗的症状和所要求的结果来确定。有效数量可由本领域一般技术人员利用这些因素来确定，不需常规外的实验。
在优选方法中，可通过针管直接注射或通过置入到癌症或肿瘤或营养肿瘤的血管中的导管或其它传输管，将伴随载体(即“载体”)内含有的有效数量的干扰素多聚核苷酸序列直接施用给靶细胞或肿瘤组织。剂量主要由这些因素确定，如所治疗的疾病、所选的干扰素、受试者年龄、体重、健康状况，可因人而异。若使用病毒基因治疗载体，对受试人的有效数量为约0.1至约10ml盐溶液，其中有约1×107至约1×1012噬斑形成单位(pfu)/ml含干扰素的病毒表达载体。
如上所述，可将IFN基因直接注射入实体瘤。或者，可通过注入到营养肿瘤的血管内来递送到肿瘤。也可以采用非肠道途径施用载体。编码干扰素的多聚核苷酸可通过局部、眼内、非肠道途径、鼻内、气管内、支气管内、肌肉内、皮下或任何其它方式施用。非肠胃施用途径包括静脉内、肌肉内、腹膜内和皮下。更高级的一种方法是非肠道途径施用可定位于不同肿瘤类型的病毒或化学偶联物，这是由于其自然亲和力或由于其表面分子可与仅在一定肿瘤类型上发现的受体结合。
如上所述，本发明提供了在哺乳动物受体中形成用于表达一种基因产物(如干扰素)的细胞表达系统的方法，还涉及该方法产生的表达系统及包含之的药物组合物。下列实施例意在示范在动物模型系统中细胞基因治疗的可行性。实施例1示范性动物模型在动物模型中对可表达干扰素的多聚核苷酸进行体内检测是很容易的。通过把人肿瘤细胞系注射到裸鼠体内可形成肿瘤。裸鼠(nu/nu株)有免疫缺陷，对外来肿瘤细胞无排斥现象。注射肿瘤细胞后1-2周形成肿瘤，但确切时间取决于注射的细胞数和该细胞系的致瘤性。在注射入小鼠前通过常规转染方法将表达干扰素的多聚核苷酸导入培养的肿瘤细胞。或者，在小鼠内形成肿瘤后将合适的多聚核苷酸通过转染或病毒转导体内导入到肿瘤内。
作为一个实施例，使用的细胞是膀胱癌细胞系HTB9(Huang等人，见上)或成视网膜细胞瘤细胞系WERI-Rb27(二者见Takahashi等人，美国国家科学院院报，美国885257-5261，1991)。为在培养过程中递送编码干扰素的分离的多聚核苷酸，转染肿瘤细胞(用常规方法如磷酸钙沉淀法、电穿孔法或脂转染胺试剂转染法)或直接感染肿瘤细胞(用逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒或腺病毒相关病毒)。在有效的病毒感染情况中，100％细胞已成功掺入了合适的多聚核苷酸，无需对细胞进行筛选。另外，已发现(实施例3)仅有小部分细胞需要表达干扰素基因，这样常常不需要药物筛选。
若要在不如此处所言的病毒感染那样有效的转染情况中进行筛选的话，用同时编码耐药基因(如编码G418抗性的neo基因)和多聚核苷酸如干扰素基因的表达载体转染细胞。转染对照是仅编码耐药基因的载体。
在含药物的培养基中筛选约2-3周后，收集细胞克隆，将之皮下注射入nu/nu(裸鼠)雌鼠胁腹，细胞数约为106，体积约为100μl。直接注射病毒感染的细胞，无需筛选步骤。再饲养该鼠至少两个月，每周用测径器监测肿瘤大小。
或者，将未转染或未感染的肿瘤细胞皮下注射到小鼠胁腹。肿瘤形成后，把含编码干扰素的多聚核苷酸的DNA或病毒直接注射到肿瘤内。许多病毒适用此方法，但重组的腺病毒是最有效的，重组的逆转录病毒具有稳定整合入肿瘤细胞基因组的优点。可通过将DNA与阳离子脂质体混合后注射的方法把DNA导入细胞。不含有干扰素基因的DNA或病毒被注射到其它小鼠的肿瘤内以作为对照。用测径器监测肿瘤增大或缩小。实施例2示范性肺癌模型作为另一个实施例，通过脂质体尤其是小颗粒脂质体气溶胶，把编码干扰素的多聚核苷酸导入到需要此类治疗的细胞内，可用脂质体包裹的编码干扰素的分离的多聚核苷酸对人类小细胞肺癌进行体内治疗。通过气溶胶施用后，编码干扰素的多聚核苷酸均匀积聚到鼻咽、气管支气管树表面和肺区域内。例如，Knight和Gilbert欧洲临床微生物和感染性疾病杂志(Eur.J.Clin.Micro.and Infect.Dis.)，7721-731(1988)有关脂质体气溶胶的论述。为用此方法治疗肺癌，用任何其它的便利方法纯化编码干扰素的多聚核苷酸。混合编码干扰素的多聚核苷酸和脂质体，使之高效掺入到脂质体内。由于气溶胶递送方式温和，易被正常志愿者和病人接受，把含有编码干扰素的多聚核苷酸的脂质体施用给任何阶段的肺癌病人进行治疗。通过鼻吸入或通过连到喷雾器上的气管内的管道来递送脂质体，剂量要足以抑制肿瘤生长。气溶胶化的治疗每天都要进行，持续两周，需要的话需重复进行。
通过将肿瘤注射到无胸腺(nu/nu)裸鼠的右主支气管(每只小鼠约1.5×106个细胞)可进行同位小细胞肺癌的体内研究。三天后，开始用脂质体包裹的干扰素基因和无干扰素基因序列的对照对小鼠进行支气管内接种治疗(每日进行连续三天)。用测径器测量法观察两种治疗组中肿瘤的形成和大小，并估计小鼠存活率。实施例3用干扰素-β 1a基因进行离体基因治疗此实施例中，我采用人乳腺癌细胞系MBA-MD-468(取自美国典型培养物保藏中心)。细胞未感染或感染了表达人类干扰素-β 1a基因的腺病毒。该情况中，腺病毒E1基因缺失，E2a基因有对温度敏感的突变。得到此特殊腺病毒的方法见Engelhardt等人，(1994)，基因治疗51217-1229(也可详见下文)。简言之，先将干扰素-β 1a基因克隆到腺病毒载体pAdCMVlink1上，这样基因转录由CMV IE1启动子驱动，产生腺病毒转移质粒。该基因插入到此载体上，替代缺失的E1基因。通过转移质粒和腺病毒基因组在293细胞中重组产生含有此干扰素基因的重组腺病毒。把病毒进行噬斑纯化，并用常规方法进行噬斑分析以确定效价。材料和方法细胞培养。人类癌细胞MDA-MB-468、Huh7、KM12LA4、ME180、Hela、U87和293作为粘附培养物在含10％牛血清、2mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素、非必需氨基酸和维生素的DMEM培养基中培养。
纯化的腺病毒的产生方法。通过把编码人类IFN-β1a的cDNA插入区连到质粒pAdCMVlink1上，构建由巨细胞病毒早期启动子驱动的编码人IFN β基因的腺病毒转移载体pAdCMV-huIFN β(见上Engelhardt等人，1994)。把质粒pAdCMV-huIFN β和自温敏性腺病毒H5ts125中纯化的基因组DNA共转移到293细胞内。用来自单个噬斑的重组腺病毒在39℃下感染293细胞，用ELISA分析法检测上清中IFN-β基因的表达情况。鉴定带有IFN-β cDNA(H5.110 hlIFN β)的腺病毒，再扩增之。类似地，得到编码发色标志β-半乳糖苷酶(H5.110lacZ)的E2A温敏性腺病毒对照。在293细胞中产生病毒制品，经过两轮噬斑分离后在CsCl梯度上纯化之。发现其中无野生型腺病毒。
在3ml含2％牛血清的培养基中以感染复数(MOI)为100的H5.110hlIFN β感染亚汇合细胞。15至18个小时后，收集上清用ELISA方法定量IFN-β的浓度。
ELISA分析法。用抗人IFN β抗体BO2(Summit制药公司，日本)4℃包被96孔板过夜。所用抗体浓度为10μg/ml，包被缓冲液含50mM碳酸氢钠/碳酸钠、0.2mM MgCl2和0.2mM CaCl2(pH9.6)。室温下用含1％酪蛋白质的PBS封闭板1小时后，加入用1％酪蛋白质和0.05％吐温-20稀释的IFN-β蛋白质标准品的IFN-β样品(AvonexTM，Biogen)。再在室温下相继与抗-IFN-β兔血清(1∶2000稀释)温育1小时、与辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔抗体(Jackson免疫研究，1∶5000稀释)温育1小时和底物液(4.2mM TMB和0.1M乙酸-柠檬酸钠，pH4.9)。用2N H2SO4终止反应后，450nm测定光吸收值。
小鼠实验。4至6周龄雌性Balb/c nu/nu小鼠购自Taconic farms(Boston，Massachusetts)。所有小鼠在无病原的Biogen动物设备中饲养至少两周后再进行每种实验。对离体实验来说，用胰蛋白质酶/EDTA溶液收集感染和未感染的细胞，用PBS洗2次。在注射入小鼠前按下述比例混合这些细胞。把100μl PBS里的2×106个细胞皮下植入到右胁腹。用测径器测量肿瘤长度和宽度，用平均肿瘤直径(mm)表示肿瘤大小。
体内直接注射实验中(实施例4)，先把100μl PBS中2×106个肿瘤细胞皮下移植到裸鼠内。肿瘤直径达5-6mm时，在单次注射中把100μl含多种剂量的重组腺病毒的PBS直接注射到肿瘤中央。用测径器测量长度和宽度。通过计算长度和宽度的平均值来衡量肿瘤大小。通过杀死其中肿瘤开始有流血迹象或到达总体重的10％的小鼠定义动物死亡(数)。用Oncor公司提供的原位凋亡检测试剂盒(Catalog # S7110-KIT)检测凋亡。结果我首先评价了腺病毒载体的转导效率和转基因表达情况。在提高感染复数(MOI)的情况下用H5.110lacZ感染人乳腺癌细胞MDA-MB-468。X-gal染色后，我发现MOI为100的这些细胞中的基因转导效率达到约100％(数据未列出)。这样，培养的乳腺癌细胞得以按每个细胞100个噬斑形成单位(pfu)的比例感染，因为我们对这些癌细胞的实验发现这是使群体中的每个细胞均表达该基因的最低病毒细胞比例。
第一次实验中，感染后18小时把2×106个细胞皮下注射到每只裸鼠的背部。五只小鼠用未感染过的细胞注射，五只小鼠用感染有腺病毒-IFN β的细胞注射。注射对照未感染细胞的所有小鼠中肿瘤大小明显增加。用可表达IFN-β的腺病毒(H5.110hIFN β表1)处理的细胞注射的任何小鼠均未发现肿瘤。
为排除肿瘤细胞体外接触IFN-β蛋白质后丧失体内致瘤能力的可能性，我用IFN-β蛋白质处理MDA-MB-468细胞，蛋白质浓度为病毒感染后18小时检测到的浓度。充分冲洗后，把同样数目的处理过的细胞、未处理过的细胞或含10％处理细胞的混合物注射到裸鼠内。观察所有三组小鼠中肿瘤的生长(数据未列出)，发现离体IFN-β基因递送，而非体外蛋白质处理，对肿瘤形成的抑制非常重要。
为确定是否表达IFN-β基因的癌细胞可引起未转导细胞的破坏，进行下列实验。同样的癌细胞或者不感染，或用表达IFN-β基因的腺病毒(H5.110hIFN β)感染，或者用表达lacZ基因的同型腺病毒(H5.110lacZ)感染，lacZ基因编码预期没有任何抗癌效应的β-半乳糖苷酶报告蛋白质，这样可作为腺病毒本身所致任何效应的对照。所有腺病毒感染按pfu细胞为100的比例进行。我分别用H5.110hIFN-β或H5.110lacZ在感染复数为100的情况下感染了MDA-MB-468肿瘤细胞。感染后18小时，收集感染过的细胞，就在注射入小鼠前使其部分与未感染细胞混合。把同样数目的感染细胞、未感染细胞、或含10％感染细胞和90％未接触病毒的细胞的混合物，皮下移植入Balb/c裸鼠。12天后观察肿瘤生长。所有移植了未感染细胞的小鼠出现了肿瘤，接受100％ H5.110hIFN β或H5.110lacZ感染过的细胞的小鼠未发现肿瘤，提示每种病毒感染都能消除致瘤性(表1)。但是接受10％H5.110lacZ感染过的细胞的所有小鼠出现了肿瘤，而接受10％H5.110hIFN β感染过的细胞的所有小鼠没出现肿瘤。因此，H5.110lacZ感染，虽然足以抑制已感染细胞的肿瘤形成，却不能阻止同时注射的原初或未感染细胞的致瘤性。相反，H5.110IFNβ转导10％细胞便足以抑制已转导入病毒的细胞的致瘤性，以及未转导入病毒的细胞的致瘤性。H5.110lacZ在100％转导的细胞群中抑制肿瘤形成可能是由某些一般毒性效应所致，或由该代腺病毒的某些抗瘤效应所致，但应注意转导过的细胞可以体外复制(数据未列)。
为确定抑制致瘤性所需的含干扰素的病毒数目，分别把H5.110hIFNβ和H5.110lacZ感染过的肿瘤细胞与未感染细胞按多种比例混合，每种情况中使未感染细胞过剩。不同比例的混合物包括10％、3％、1％、0.3％经腺病毒感染的细胞，其余是未感染细胞。混合后立刻将细胞注射入裸鼠。结果见表1。细胞注射后不同时间在两个方向上测量肿瘤直径。表1中每个数据点表示四只小鼠横向和纵向直径测量值的平均+/-标准差。测量是在注射肿瘤细胞后12、19、26和33天进行。
表1 平均肿瘤直径(用毫米表示)
接受低为1％的H5.110hIFN β转导细胞的小鼠中肿瘤生长完全阻抑(表1)。注射细胞后第一周，可在注射10％、3％和1％ H5.110hIFNβ的小鼠中检测到非常小的肿瘤(可触知但没大到可测量)。但是，到第9天所有这些小肿瘤完全消退。这表明一些细胞存活了较短时间，并在该期间表达了IFN-β基因，导致整个肿瘤死亡。用该细胞系在裸鼠中做过的几次实验中，1％细胞用H5.110hIFN β转导时从未发现肿瘤形成，存活率为100％(数据未列出)。尽管接受0.3％ H5.110hIFN β转导细胞的小鼠出现了肿瘤，但这些肿瘤的大小比对照小鼠中的肿瘤小得多，且此0.3％组中5只小鼠中有2只小鼠到第33天肿瘤完全消退(表1)。
相反，接受10％至0.3％ H5.110lacZ处理过的细胞的小鼠中形成的肿瘤与未感染组同样大小，且对照组中均未出现肿瘤消退(表1)。
明显地，仅仅在很小一部分细胞内表达人干扰素β(hIFN-β)看起来可阻止裸鼠内肿瘤形成。我还研究了能影响而非一定阻止肿瘤形成并提高小鼠存活率所需的H5.110hIFN β感染细胞的最低比例。把同等数目含0.3％、0.1％、0.03％、0.01％和0％ H5.110hIFNβ感染细胞的MDA-MB-468细胞移植入裸鼠，观察肿瘤生长。接受0.3％或0.1％感染细胞的小鼠比仅接受未感染细胞的小鼠中形成肿瘤小得多(图1A)。在0.3％和0.1％转导组形成的肿瘤中，分别有60％(5只中有3只)和20％(5只中有1只)的肿瘤完全消退。0.3％和0.1％转导组中观察到存活率明显延长。尽管75天内0％、0.01％或0.03％感染的细胞移植令所有动物死亡，在第109天实验结束时0.1％和0.3％组中分别有20％(5只中有1只)和60％(5只中有3只)的动物仍活着，未发现肿瘤(图1B)。
为获得功效，可能仅一小部分肿瘤细胞需要被转染或感染(大于约0.3％，优选大于约1.0％)。这不同于此类抗癌基因治疗方法如野生型肿瘤抑制因子的递送(如p53)，其中肿瘤内的每个细胞都需获得肿瘤抑制基因。
因此，干扰素基因在体外感染后表现出强烈的体内抗增殖效应。对照表明这是因干扰素而非腺病毒所致。其它人类异种移植肿瘤中的离体IFN-β基因治疗我还在离体的人异种移植模型中的其它肿瘤细胞类型中检测了H5.110hIFN β转导效果。用H5.110hIFN β转导人结肠癌细胞KM12L4A、人肝癌细胞Huh7或人子宫颈癌细胞ME180。测试含10％、1％或0％转导细胞的同等数目细胞在裸鼠中形成肿瘤的能力。注射三种类型未感染细胞可使所有小鼠形成快速生长的肿瘤。相反，离体递送10％ H5.110hIFN β感染过的细胞使所有受检动物不出现肿瘤或延迟出现较慢生长的肿瘤(图2A)。与MDA-MB-468细胞获得的结果，即1％ H5.110hIFN β转导完全抑制肿瘤形成不同的是，这三种类型细胞1％转导可使肿瘤形成，只是在每个时间点其大小比未感染的对照组小。接受10％和1％转导细胞的小鼠比接受未感染细胞者存活期长(图2B)。因此，将腺病毒介导的IFN-β基因离体递送到多种不同肿瘤细胞中可有效抑制致瘤性，延长动物存活时间。实施例4用干扰素β1a基因进行体内基因治疗除离体方法外，可直接进行体内基因治疗。在体内基因治疗中，将基因直接施用给病人。本实施例中，将带有人IFN-β基因的腺病毒(H5.110hIFNβ)直接注射入实体瘤内。简言之，把2×106个MBA-MD-468人乳腺癌细胞皮下注射到50只裸鼠背部。皮下注射MDA-MB-468细胞后24天裸鼠皮下形成约5-6mm直径的肿瘤。此时，单次肿瘤内注射PBS或1×107到3×109pfu/小鼠范围内多种病毒剂量的H5.110hIFNβ和H5.110lacZ载体。
图3数据表明14天内，3×109、1×109或3×108pfu总量的H5.110hIFNβ单剂量治疗使肿瘤消退。3×109pfu组中5只小鼠有4只、1×109pfu处理组中5只动物有3只肿瘤完全消退。在注射了1×109pfu H5.110hIFNβ的肿瘤内可检测到局部浓度高达约1500IU/ml的IFN-β，而血清IFN-β浓度仅为37IU/ml。包括1×108、3×107和1×107pfu的低H5.110hIFNβ剂量效果甚微或无效(图3和数据未列)，表明该抗肿瘤反应是剂量依赖性的。注射同样剂量的PBS或H5.110lacZ不会使肿瘤消退(图3)。观察肿瘤更长一段时间时，发现注射了3×109pfu的某些个别肿瘤出现了消退，提示此剂量下病毒对照可以轻微抑制肿瘤生长。与PBS或H5.110lacZ治疗的小鼠相比，在3×109、1×109或3×108pfu剂量下用H5.110hIFNβ治疗明显提高了存活率(数据未列)。我们还检测了多次注射，每隔三天给已建立的MDA-MB468和HeLa肿瘤注射五次1×108pfu的H5.110hIFNβ，结果两种肿瘤类型出现了生长缓慢和消退(现象)(未发表)。我还用人神经胶质瘤细胞系U87进行了类似的体内实验。这些细胞对IFN-β非常敏感，因为1×109pfu H5.110hIFNβ处理的4只小鼠全部出现了肿瘤完全消退(现象)，1×108pfu处理的4只小鼠中有2只肿瘤完全消退(数据未列)。这些结果表明体内直接并局部由腺病毒递送IFN-β基因可发挥明显的抗肿瘤效果。
用1×109pfu病毒注射后4天，收集MDA-MB-468肿瘤作组织学检查。其时，H5.110hIFNβ注射过的肿瘤出现消退迹象。用苏木素-伊红染色对MDA-MB-468肿瘤进行组织学分析。发现H5.110hIFNβ注射过的肿瘤中凋亡细胞比H5.110lacZ注射过的肿瘤中要多。我通过对末端标记的片段化的基因组DNA进行直接的荧光检测确认了凋亡(现象)。在H5.110hIFNβ或H5.110lacZ注射过的肿瘤内发现很少有单核细胞浸润，表明在H5.110hIFNβ引起的此模型肿瘤消退过程中细胞免疫反应并未发挥主要作用。
上述离体和体内实验仅仅测量了干扰素直接的抗增殖效应。由于这些是有免疫缺陷的小鼠，不能表现出干扰素具备的任何可能刺激肿瘤破坏的免疫刺激活性。还有，由于干扰素无法自人至鼠地跨越种类，用以抑制小鼠中人类癌细胞的人IFN-β不能抑制血管生成，因为人IFNβ不能作用于小鼠血管内皮细胞。因此，用含有人IFN-β的腺病毒治疗病人时可能出现更强的抗癌活性。这可在免疫健全的非人类灵长目动物中建立模型。或者，可在患有鼠源肿瘤的免疫健全小鼠中使用含有鼠IFN-β基因的腺病毒。许多此类同源小鼠肿瘤模型方便易得。
此处提供的数据表明，IFN-β基因治疗能明显阻止肿瘤从头形成，也能使已形成的肿瘤消退。离体转导实验证实，把可分泌的蛋白质导入到低至0.3％-1.0％转导过的细胞可阻止MDA-MB-468肿瘤形成。已测试了许多其它肿瘤细胞系，尽管IFN-β效果不一，但用1-10％IFN-β转导的细胞能阻止所有肿瘤细胞系。由于仅需相对小部分IFN-β分泌细胞便可影响肿瘤形成，在此鼓舞下，我又通过肿瘤内注射腺病毒的方法试验了预先形成的肿瘤。同样通过单次注射病毒进行IFN-β基因递送能产生很好的效果，可使肿瘤部分消退或在某些情况下完全消退。
这些研究中，肿瘤明显消退似乎主要是IFN-β的直接抗增殖或细胞毒活性所致。支持此结论的事实是本研究中的IFN-β基因是人源的，人IFN-β不能和宿主小鼠细胞发生明显的交叉作用。还有，所用的免疫缺陷性裸鼠缺乏T淋巴细胞，该细胞是I型IFN诱导免疫刺激中的主要效应细胞(Tough，D.F等人(1996)，科学2721947-1950和Rogge，L等人(1997)实验医学杂志(J.Exp.Med.)，185825-831)。另外，IFN-β基因递送后肿瘤迅速消退过程中，没有观察到更多的单核细胞浸润。这些结果支持此观点，即仅仅是IFN-β介导的抗增殖活性便足以使肿瘤消退。我们的数据看起来与以前观察到的相一致在体外恶性肿瘤对IFN-诱导的抗增殖活性敏感性与体内治疗效果之间的临床相关性(Einhorn和Grander(1996)干扰素细胞因子研究杂志(J.InterferonCytokine Res.)16275-281)。
总之，已发现腺病毒介导的IFN-β基因治疗可在小鼠模型中发挥有效的抗肿瘤效应。把IFN-β基因离体递送到极小部分细胞内便足以抑制肿瘤形成，单次剂量直接将IFN-β基因递送到肿瘤内可使已形成的肿瘤消退。不受任何作用原理的限制，该明显的抗肿瘤效应可能来自IFN-β的自分泌和旁分泌作用。该抗肿瘤效应可成为基因治疗癌症试验中的关键因素，其中基因递送程度可能受到限制，且需要明显的旁观者效应。因此，在人类肿瘤的治疗方面局部IFN-β基因治疗提供了很有前景的方法。等同物应理解上述仅为特定优选实施方案的详细说明。因此很明显，本领域技术人员可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下做出多种修改和等同物。
权利要求
1.一种在哺乳动物受体细胞内体内表达干扰素蛋白质的细胞表达系统，该表达系统包括与哺乳动物受体种相同的细胞；和其中含有的用以表达干扰素蛋白质的表达载体，其中在人类基因治疗中所述表达载体有助于细胞内表达该干扰素蛋白质，其中该受体具有通过把干扰素蛋白质递送到受体位点后能治疗的疾病。
2.权利要求1中的表达系统，其中该哺乳动物受体是人。
3.权利要求1中的细胞表达系统，其中所述的表达载体包括一种病毒载体。
4.一种用于为治疗一种疾病在哺乳动物受体细胞内体内表达分泌蛋白质的细胞表达系统，该表达系统包括与哺乳动物受体种相同的细胞群；和其中含有的表达该分泌蛋白质的表达载体，其中仅一部分该细胞群的细胞中含有该表达载体，该载体用于表达用在人类基因治疗中的分泌蛋白质，其中该疾病可通过将分泌蛋白质递送到受体位点治疗。
5.权利要求4中的细胞表达系统，其中所述的部分是指至少1％所述的细胞群数目。
6.权利要求5中的细胞表达系统，其中所述部分是至少0.3％所述的细胞群数目。
7.权利要求4中的细胞表达系统，其中所述的分泌蛋白质是干扰素。
8.一种包括癌细胞群的细胞表达系统，至少一部分所述的癌细胞群含有病毒载体，该载体中已掺入了经表达编码干扰素蛋白质的分离的多聚核苷酸。
9.权利要求8中的细胞表达系统，其中所述的至少一部分是指至少0.3％所述细胞数目。
10.权利要求8中的细胞表达系统，其中所述的病毒载体是选自如下腺病毒载体组的腺病毒载体，该腺病毒组包括(a)E1基因中存在缺失的腺病毒载体；(b)E1基因中有缺失且E2a基因中有缺失或突变的腺病毒载体，该载体表达人干扰素-β；(c)E1和E4基因中均有缺失的腺病毒载体，和(d)所有基因中均有缺失的腺病毒载体，该载体表达人干扰素-β。
11.一种将分泌蛋白质递送到哺乳动物受体部位的组合物，包括与哺乳动物受体同种的遗传修饰过的细胞群，至少一部分该细胞含有一种用于在所述细胞内表达有效数量的分泌蛋白质的表达载体，其用在人类基因治疗中。
12.权利要求11中的组合物，其中所述的至少一部分是指至少0.3％数目。
13.权利要求11中的组合物，其中该分泌蛋白质是干扰素。
14.权利要求11中的组合物，其中该表达载体包括病毒载体。
15.一种制备用以施用给哺乳动物受体的离体基因治疗药物制品的方法，该方法包括步骤(a)形成与哺乳动物受体同种的细胞群，(b)将表达分泌蛋白质的表达载体导入所述细胞群中的至少一个细胞内，形成至少一个遗传修饰的细胞，其中表达载体用于在所述细胞中表达用来进行人类基因治疗的分泌蛋白质；和(c)将至少一个遗传修饰过的细胞置入药学可接受的载体中，得到适于施用到哺乳动物受体位点的药物制品，其中该分泌蛋白质用于治疗一种疾病，此疾病可通过把分泌蛋白质递送到细胞相容性的位点得到治疗。
16.权利要求15中的方法，其中把表达载体导入至少一个细胞的步骤包括将表达载体导入到至少0.3％所述细胞群数目的细胞中。
17.权利要求15中的方法，其中分泌蛋白质是干扰素。
18.权利要求15中的方法，其中表达载体包括病毒载体。
19.权利要求18中的方法，其中该病毒载体是腺病毒载体。
20.一种基因治疗的方法，包括通过以下步骤对哺乳动物受体的至少一个细胞进行遗传修饰(a)将表达分泌蛋白质的表达载体导入到至少一个细胞内形成至少一个遗传修饰的细胞，其中该细胞与哺乳动物受体同种，并且其中该表达载体可用于在细胞内表达用来人类基因治疗的分泌蛋白质；和(b)将遗传修饰的细胞接触哺乳动物受体的某一部位，其中该哺乳动物受体具有可通过把该分泌蛋白质递送到该部位或通过施用该分泌蛋白质来治疗的疾病。
21.权利要求20中的方法，还包括在导入表达载体步骤之前从哺乳动物受体中取出所述至少一个细胞之步骤。
22.权利要求21中的方法，其中取出之步骤包括取出细胞群，导入载体的步骤包括将载体导入到仅仅一部分所述细胞群的细胞中。
23.权利要求20中的方法，其中分泌蛋白质是干扰素。
24.权利要求20中的方法，其中导入所述表达载体的步骤包括将所述载体直接注射到所述至少一个细胞内。
25.权利要求20中的方法，其中导入步骤包括导入所述表达载体，该载体包括控制所述干扰素转录的可诱导性启动子。
26.权利要求20中的方法，其中该表达载体包括一种病毒载体。
27.权利要求20中的方法，其中哺乳动物受体是人。
28.一种离体基因治疗的方法，包括步骤从受试者中取出细胞群；将重组腺病毒施用给所述细胞群中至少一个细胞，这样就存在不含腺病毒的过量细胞，其中该腺病毒E1基因中有突变或缺失，该腺病毒还包括编码分泌蛋白质的分离的多聚核苷酸；和将该细胞群重新导入受试者内。
29.权利要求28中的方法，其中至少10％所述细胞群数的细胞含有重组腺病毒。
30.权利要求28中的方法，其中至少3％所述细胞群数的细胞含有重组腺病毒。
31.权利要求28中的方法，其中至少1％所述细胞群数的细胞含有重组腺病毒。
32.权利要求28中的方法，其中至少0.3％所述细胞群数的细胞含有重组腺病毒。
33.权利要求28中的方法，其中分泌蛋白质是干扰素。
34.一种体内基因治疗的方法，包括将含有编码人干扰素-β蛋白质的分离的多聚核苷酸的病毒载体直接施用到受试者细胞内，无需先从受试者中取出该细胞。
35.权利要求34中的方法，其中施用步骤包括通过一定路线施用，这些路线包括表面施用、眼内施用、非肠胃施用、鼻内施用、气管内施用、支气管内施用、肌肉内施用和皮下施用。
36.权利要求35中的方法，其中非肠胃施用包括选自静脉内施用、肌肉内施用、腹膜内施用和皮下施用的途径。
37.权利要求34中的方法，其中该细胞是肿瘤细胞。
全文摘要
提供了采用编码分泌蛋白质如人类干扰素的DNA来对哺乳动物受体细胞进行原位修饰的方法和组合物。该方法包括形成体内或离体分泌蛋白质表达系统,并将该表达系统施用给哺乳动物受体。该表达系统和方法可用于原位定位或系统性地递送干扰素。
文档编号A61P43/00GK1271391SQ98809487
公开日2000年10月25日 申请日期1998年8月25日 优先权日1997年8月29日
发明者J·G·巴苏姆, 秦小强 申请人:拜奥根有限公司