专利名称：一种抑制白细胞介素-4，刺激g干扰素的免疫调节剂及制备方法
技术领域：
本发明属于免疫学、化学和免疫药理学的交叉研究领域，更具体涉及一种抑制白细胞介素-4刺激γ干扰素的免疫调节剂，在临床上增强细胞免疫的抗胞内菌，抗病毒和寄生虫的感染的药物或作为抗移植排斥反应药物。同时涉及该免疫调节剂的制备方法。
背景技术：
N-五氟苄基-1-脱氧野尻霉素(5F-DNM)是一种结构清楚的小分子免疫调节剂，与当今使用的抗排斥反应药物和免疫调节剂在结构上无任何相似性。目前现有的免疫调节剂或是化学合成的，或是微生物制剂，生物制剂或中草药等成分提取物，成分复杂，机制不清楚。按照WHO的标准，选择一种化合物作为免疫调节剂的基本条件是①化学成分明确；②易于降解；③无致癌或制突变性；④免疫调节作用适中；⑤无毒副作用。已知现有的免疫抑制剂环孢素A(cyclosporinA，CYA)(一种真菌提取物)相比，环孢素A有较大的毒副作用。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种抑制白细胞介素-4刺激γ干扰素的免疫调节剂，此调节剂分子量小(MW342.25)，具有对细胞无毒，能有效地降低免疫分子白细胞介素-4的分泌，刺激γ干扰素的分泌，对CD8T淋巴细胞有一定增强作用和对CD4T淋巴细胞有一定抑制作用。
本发明的另一目的涉及该免疫调节剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案本发明的小分子免疫调节剂的合成方法是将5mg～18mg的脱氧野尻霉素(DNM，1-deoxynojirimycin)与25～35mg的五氟苄基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF4～9mL试剂中。此混合物于20-30℃下搅拌20分钟至50分钟，然后加于10～30mg，碳酸铯(CsCO3)。将混合物于25～35℃搅伴16至25小时，用TLC/紫外线监测。混合物静置反应40分钟至90分钟，待出现白色沉淀，过滤去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固体。进一步用C-18柱子纯化，溶剂为异丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶剂，即得到纯化的产品。采用该化合物的结构式是
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果其结构清楚，分子量小，对细胞无毒。效果是可抑制白细胞介素-4的分泌，增强γ干扰素的产生，因而能用作临床上增强细胞免疫的抗胞内菌，抗病毒和寄生虫的感染和抗移植物的排斥的药物。
图1新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)对小鼠脾脏细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)的抑制，并且随着药物浓度的增大，抑制能力增强，呈剂量依赖关系。分离小鼠脾脏细胞，调整至5×106/ml。以每孔加5×105细胞至96孔板中，然后加不同浓度的5F-DNM药物至每空孔中，于37℃下，5％CO2温育72h。收集上清，2000g离心5min，检测上清，用IL-4试剂盒检测(晶酶公司)。
图2新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)刺激小鼠脾脏细胞分泌γ干扰素，并且随着药物浓度的增大，刺激能力增强，呈剂量依赖关系。分离小鼠脾脏细胞，调整至5×106/ml。以每孔加5×105细胞至96孔板中，然后加不同浓度的5F-DNM药物至每空孔中，于37℃下，5％CO2温育72h。收集上清，2000g离心5min，检测上清，用γ干扰素试剂盒检测(晶酶公司)。
图3流式细胞仪分析药物5F-DNM与环孢素A，以及阴性对照分别对正常人淋巴细胞CD4T和CD8T的作用比较。新鲜分离的人外周血单个核细胞100μl(1×106/ml)经用药不同处理，与5μlFITC-CD4抗体与5μlPE-CD8抗体在室温暗处反应20分钟，上样检测，收集2000个细胞分析。流式细胞仪为ALTRA EPICS(COULTER)。
其中图3A对照组正常人淋巴细胞图3B 10μM 5F-DNM作用后的人淋巴细胞图3C 10μM环孢素A作用后的淋巴细胞具体实施方式
根据化合物结构式，其具体步骤如下将10mg的脱氧野尻霉素DNM(1-deoxynojirimycin)与32mg的五氟苄基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF(5mL)试剂中。此混合物于30℃下搅拌30分钟，然后加于21mg碳酸铯(CsC03)。将混合物于30℃搅伴18小时，用TLC/紫外线监测。混合物静置反应60分钟，待出现白色沉淀，过滤去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固体。进一步用C-18柱子(溶剂为异丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1)纯化，25℃蒸干溶剂，即得到纯化的产品。合成免疫调节剂的化合物，称为5-氟地恩们，或化学名称N-五氟苄基-1-脱氧野尻霉素(5F-DNM)。
取小鼠脾脏浸泡于无血清的RPMI-1640培养基中，并用钢丝网碾磨。再用200目的尼龙网过滤。滤液2000g离心10min，然后弃上清。沉淀溶于5ml pH7.2 Tris-NH4Cl，并于37℃反应6～10min以裂解细胞，然后离心2000g，10min，将细胞沉淀溶解于含有10μg/ml，10％新生小牛血清的RPMI-1640培养基中。数细胞数，调整细胞浓度至5×106/ml。以每孔加5×105细胞至96孔板中，然后加不同浓度的5F-DNM药物至每空孔中，于37℃下，5％CO2温育72h。收集上清，2000g离心5min，上清待检测。
将上述得到的上清用IL-4和IFN-γ试剂盒检测(晶酶公司)。按照试剂盒步骤，96孔板用孔板用anti-IL-4或anti-IFN-γ包被，不同浓度的样品和IL-4或IFN-γ标准品(500、250、125、62.5、31.25、15.63pg/ml)加入至每孔中，20-25℃温育120min，用磷酸缓冲液洗板5次，加入100μl biotin-标记的anti-IL-4或anti-IFN-γ至每孔中，于20-25℃温育60min。再洗板5次，加入100μl HRP-streptoavidin至每孔中，于20-25℃温育30min。再洗板5次，加入HRP酶的底物，并测颜色变化OD450nm。用已知浓度的IL-4或IFN-γ作标准曲线，根据标准曲线确定样品的浓度。见表1，2和图1、2。
表1.新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)对白细胞介素-4(IL-4)的抑制作用，并且随着药物浓度的增大，抑制能力增强，呈剂量依赖关系
**代表药物与未加药对照组相比有显著差异，p＜0.05，各值代表至少三次独立实验的平均值表2.新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)增强小鼠脾脏细胞IFN-γ的分泌，并且随着药物浓度的增大，分泌能力增强，呈剂量依赖关系
**代表药物与未加药对照组相比有显著差异，p＜0.05，各值代表至少三次独立实验的平均值5F-DNM的细胞毒性的检测采用细胞毒性检测试剂盒(Promega)。按照试剂盒的步骤定量检测浆膜破损的细胞释放至培养基上清中细胞质酶LDH(lactate dehydrogenase)。结果证明5F-DNM对细胞无毒性作用。见表3。
表3.药物5F-DNM对细胞没有细胞毒作用Drugs(μM) ％Cytotoxicity无药 0255.66±0504.60±3.29100 3.69±5.03采用流式细胞仪检测发现10μM 5F-DNM对CD8T具有一定增强作用，对CD8T细胞从正常23％百分率增至31.3％，而10μM环孢素A对CD8T细胞无作用(正常CD8T为23％，10μM环孢素A作用后为25％)；10μM 5F-DNM对CD4T具有一定抑制作用，从正常CD4T 52％百分率降为19％，比环孢素A对CD4T抑制作用弱，10μM环孢素A对CD4T细胞，从正常CD4T 52％百分率降为为3.95％，与已知的对CD4T细胞选择性的抑制剂环孢素A(cyclosporin A，CYA)相比，免疫调节作用适中。见图3A、3B、3C。
权利要求
1.化合物的结构式为
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征是抑制白细胞介素-4，刺激γ干扰素的分泌，对CD8T淋巴细胞有一定增强作用，而对CD4T淋巴细胞有一定抑制作用，是一种选择性免疫调节剂，且对细胞无毒。
3.权利要求1所述的化合物，该化合物的制备方法包括下列步骤A、将5mg-18mg的脱氧野尻霉素与25-35mg五氟苄基溴混合于DMF 4-9mL试剂中；B、将上述混合物于20-30℃下搅拌20-50分钟，加入20-30mg碳酸铯；C、将步骤B的混合物于25-35℃下搅拌16-25小时，用TLC/紫外线监测；D、将混合物静置反应40-90分钟，待出现白色沉淀，过滤去除沉淀，真空抽干母液，得白色固体；E、采用C-18柱子纯化，溶剂为异丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶剂，得到纯化产品。
全文摘要
本发明公开了一种抑制白细胞介素－4，刺激γ干扰素的免疫调节剂及其制备方法。将脱氧野尻霉素与五氟苄基溴为原料合成免疫调节剂的化合物，该化合物具有抑制白细胞介素－4的产生，刺激γ干扰素的分泌的功能，对CD8T淋巴细胞有一定增强作用，而对CD4T淋巴细胞有一定抑制作用，是一种选择性免疫调节剂，且证明对细胞无细胞毒作用。可用作为增强细胞免疫和降低体液免疫的药物，在临床上可作为增强细胞免疫的抗胞内菌，抗病毒和寄生虫的感染和抗移植物的排斥的药物。化合物结构式如图。
文档编号C07D211/40GK1528747SQ20031011125
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月21日 优先权日2003年10月21日
发明者章晓联, 周翔, 谢鹏, 叶佳涛, 刘敏 申请人:武汉大学