固定化角质酶、制备方法及其在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及酶的固定化领域，具体涉及一种固定化角质酶、制备方法及其在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用，所述固定化角质酶以多孔金纳米材料为载体，角质酶通过物理吸附作用固定于多孔金纳米材料上，所述多孔金纳米材料的角质酶吸附量为30mg/g以上，所述多孔金纳米材料的孔径为40～50nm，制备方法为，将多孔金纳米材料加入角质酶溶液中，在45～55℃下振荡吸附，再经过洗涤、冷冻和真空干燥后，得到固定化角质酶，本发明可用于降解水体中的邻苯二甲酸酯类，本发明的固定化角质酶生物相容性好，吸附量大，吸附稳定性好。
【专利说明】固定化角质酶、制备方法及其在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶的固定化领域，具体涉及一种固定化角质酶、制备方法及其在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用。
【背景技术】
[0002]角质酶(cutinase, EC3.1.1.74)是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶，是α/β水解酶家族中分子量较小的成员，属于丝氨酸酯酶。角质酶既可以催化水解不溶性多聚体植物角质的酯键，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯等。角质酶可以实现棉纤维的生物精炼和合成纤维的生物改性，是推动纺织工业清洁生产、绿色加工的关键酶制剂；纽约理工大学教授Richard Grosse研发出利用角质酶将生物能源加工生产成的塑料制品分解得到生物柴油的相关技术方法；角质酶还能够降解邻苯二甲酸酯类持久性有机污染物，在水污染治理方面有广阔的应用前景。但由于水中游离的角质酶不可回收，也难以长期保存，且在高温或者其他极端环境下角质酶的稳定性不易保持，因而限制了角质酶的实际应用。
[0003]固定化技术在保持游离酶的专一性、高效性等催化特性的同时，更是提高角质酶的重复利用性、稳定性以及操控性的有效手段，常用的固定化载体包括活性炭、微滤膜等多种材料，但是现有的固定化材料存在固定效率低、分离困难、加工工艺复杂以及操作性能差等缺陷。固定化技术常用的方法主要有物理吸附法和化学交联法，物理吸附法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留，相对于化学交联法能够较好的保留酶的催化活性。但利用一般载体采用物理吸附法固定化酶类物质，存在吸附量相对较小，吸附稳定性一般，生物相容性一般的问题，影响了固定化酶类物质的应用。
[0004]多孔金纳米材料(nanoporous gold, NPG)是一种新型的多孔金属材料,与传统的多孔材料相比，具有制备简单、易回收、表面可修饰、比表面积大、吸附性能好、质量轻和结构易灵活控制等优点，在生物催化和分离领域，尤其是在作为酶固定化载体的研究和应用上显示了极大的潜力。
[0005]文献〈〈Immobilization of laccase on nanoporous gold: comparative studieson the immobilization strategies and the particle size effects))
[0006](J.Phys.Chem.C2009, 113，2521-2525)中，多孔金纳米材料采用物理吸附法固定化漆酶与采用化学交联法固定化漆酶相比，在固定化漆酶量以及比酶活相似的结果下，由于物理吸附法固定的漆酶具有制备简单，漆酶整体结构保持不变的特点，优先选用物理吸附法固定漆酶。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种生物相容性好，吸附量大，吸附稳定性好的固定化角质酶及其制备方法，还提供了一种固定化角质酶在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用。
[0008]为解决上述问题，本发明采用以下技术方案:
[0009]本发明的固定化角质酶，以多孔金纳米材料为载体,角质酶通过物理吸附作用固定于多孔金纳米材料上，所述多孔金纳米材料的角质酶吸附量为30mg/g以上，所述多孔金纳米材料的孔径为40~50nm，所述多孔金纳米材料的制备方法为:
[0010](I)将金银合金置于丙醇中超声清洗，再用超纯水超声洗涤，于700~800°C条件下退火，退火时间优选为8~IOh ;
[0011](2)将上述预处理后的金银合金制成合金切片；
[0012](3)将上述合金切片置于质量分数为65~70%的硝酸溶液中腐蚀，腐蚀温度优选为25~30°C，时间为800~lOOOmin，然后于200~250°C下退火，制得多孔金纳米材料。
[0013]所述固定化角质酶的酶活性回收率为72~95%。
[0014]所述金银合金为Au42Ag58。
[0015]所述合金切片的尺寸为5~IOmmX 5~IOmmX 20 μ m。
[0016]本发明还提供一种固定化角质酶的制备方法，步骤是，将多孔金纳米材料加入角质酶溶液中，在45~55°C下振荡吸附4h以上，再经过洗涤、冷冻和真空干燥后，得到固定化角质酶。
[0017]所述角质酶溶液是由角质酶与磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液配制而成，所述多孔金纳米材料与所述角质酶的质量`配比为1:0.4~0.6，所述角质酶溶液中角质酶的浓度为 0.2 ~1.0mg/mL, pH 值为 7.0 ~9.0。
[0018]所述振荡吸附的转速为120~150rpm，所述振荡吸附的时间为4~8h。
[0019]本发明还提供一种固定化角质酶在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用，包括以下步骤:将固定化角质酶加入到含邻苯二甲酸酯类的水中，固定化角质酶的加入量为50~100mg/L,振荡反应。
[0020]所述振荡反应的温度为30~50°C，转速为100~150rpm。
[0021]所述邻苯二甲酸酯类为邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(CAS号为117-81-7)、邻苯二甲酸二甲酯(CAS号为131-11-3)、苯二甲酸二丁酯(CAS号为84_74_2)或邻苯二甲酸丁节酯(CAS号为85-68-7)中的一种或多种。
[0022]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0023](I)本发明在脱合金法制备多孔金纳米材料过程中采用退火处理，使得本发明的多孔金纳米材料生物相容性好，吸附量大，吸附稳定性好，其孔径分布在40~50nm，为酶分子直径大小的2~6倍，可对角质酶起到最佳的稳定化作用，且用于环境污染物降解不会造成二次污染。
[0024](2)本发明采用退火处理降低了多孔金纳米材料的硬度，改善了切削加工性，消除了残余应力，稳定尺寸，减少变形与裂纹倾向，细化晶粒，调整组织，消除组织缺陷。
[0025](3)作为本发明的固定化角质酶的载体的多孔金纳米材料，其表面积大且吸附容量高，易于分离操作。
[0026](4)本发明采用物理吸附制备固定化角质酶，使得角质酶的活性回收率高，活性损失小，可重复使用，固定化后温度的适应范围和PH值的适应范围均有所扩大，储存稳定性以及热稳定性也有较大的提闻。
[0027]本发明的固定化角质酶在水污染治理领域的应用中，对邻苯二甲酸酯类的去除率可达87.2%ο
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为实施例1制得的固定化角质酶的扫描电镜图。
[0029]图2为本发明固定化角质酶和对照样(游离角质酶)在不同温度条件下相对活性变化曲线。
[0030]图3为本发明固定化角质酶和对照样(游离角质酶)在不同pH条件下相对活性变化曲线。
[0031]图4为本发明固定化角质酶和对照样(游离角质酶)的储存稳定性变化曲线。
【具体实施方式】
[0032]实施例1
[0033]固定化角质酶，以多孔金纳米材料为载体，角质酶通过物理吸附作用固定于多孔金纳米材料上，得到固定化角质酶。步骤为，将IOmg多孔金纳米材料加入角质酶溶液中，角质酶溶液由角质酶与T ris-HCl缓冲液(浓度为20mM，pH值为8.0)配制而成，所述角质酶溶液中角质酶的浓度为0.8mg/mL,所述角质酶溶液中角质酶的质量为4mg,在50°C下120rpm振荡吸附6h，然后用pH值为8.0的Tris - HCl缓冲液洗涤数次，取出片状多孔金纳米材料，经-40°C冷冻真空干燥，得到固定化角质酶。所述多孔金纳米材料的角质酶吸附量为39.2mg/g,所述多孔金纳米材料的孔径为40~50nm。所述固定化角质酶的酶活性回收率可达95%。所述固定化角质酶的酶活性回收率的计算方法为:R (%)= (AiAf) X 100;其中Ai表示固定化角质酶的活性，Af表示同等质量的游离角质酶的活性。
[0034]所述多孔金纳米材料的制备方法为:
[0035](I)将Au42Ag58合金置于丙醇中超声清洗，再用超纯水超声洗涤，并于700°C条件下退火IOh ；
[0036](2)将上述预处理后的Au42Ag58合金制成尺寸为IOmmX IOmmX 20 μ m的合金切片；
[0037](3)将上述Au42Ag58合金切片置于质量分数为65%硝酸水溶液中于30°C下腐蚀SOOmin，然后200°C下进行热处理Ih，制得多孔金纳米材料。
[0038]将制得的固定化角质酶进行场发射扫描电镜成像，得到如图1所示的扫描电镜图，由图可见中间相互连通的海绵状多孔结构，使用BJH模型估测多孔金纳米材料的孔径分布为40~50nm。
[0039]实施例2
[0040]固定化角质酶，以多孔金纳米材料为载体，角质酶通过物理吸附作用固定于多孔金纳米材料上，得到固定化角质酶。步骤为，将IOmg多孔金纳米材料加入角质酶溶液中，角质酶溶液由角质酶与磷酸缓冲液配制而成，所述角质酶溶液中角质酶的浓度为0.2mg/mL,所述角质酶溶液中角质酶的质量为6mg,角质酶溶液的pH值为9.0,在45°C下150rpm振荡吸附4h，然后用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤数次，取出片状多孔金纳米材料，经-40°C冷冻真空干燥，得到固定化角质酶。所述多孔金纳米材料的角质酶吸附量为36.5mg/g，所述多孔金纳米材料的孔径为40~50nm，所述固定化角质酶的酶活性回收率为92.6%，所述多孔金纳米材料的制备方法为:
[0041](I)将Au42Ag58合金置于丙醇中超声清洗，再用超纯水超声洗涤，并于800°C条件下退火8h ；
[0042](2)将上述预处理后的Au42Ag58合金制成尺寸为5mmX5mmX20 μ m的合金切片；
[0043](3)将上述Au42Ag58合金切片置于质量分数为70%硝酸水溶液中于25°C下腐蚀lOOOmin，然后250°C下进行热处理lh，制得多孔金纳米材料。
[0044]实施例3
[0045]不同振荡吸附时间条件下制备固定化角质酶
[0046]取IOmg实施例1制备的多孔金纳米材料作为载体，加入IOmL装有4mg角质酶的Tris-HCl缓冲液中(浓度为20mM，pH值为8.0)，于50°C下以150rpm的速度振荡吸附30~360min,固定化完成后，用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤数次，取出片状多孔金纳米材料，经_40°C冷冻真空干燥，得到固定化角质酶。
[0047]用1wry法分别测定固定前缓冲溶液中角质酶量以及固定后缓冲液中剩余的角质酶量，计算不同时间内单位载体吸附的角质酶，结果见表1 ;由表1中数据分析可知适宜的振荡吸附时间范围在4h以上，考虑到尽可能减少因为存放而引起的角质酶酶活损失，因此，优选振荡吸附时间为4~6h，最佳的振荡吸附时间为4h。
[0048]表1不同振荡吸附时间下制得的固定化角质酶的角质酶吸附量
[0049]
【权利要求】
1.一种固定化角质酶，其特征是，以多孔金纳米材料为载体，角质酶通过物理吸附作用固定于多孔金纳米材料上，所述多孔金纳米材料的角质酶吸附量为30mg/g以上，所述多孔金纳米材料的孔径为40~50nm，所述多孔金纳米材料的制备方法为: (1)将金银合金置于丙醇中超声清洗，再用超纯水超声洗涤，于700~800°C条件下退火； (2)将上述预处理后的金银合金制成合金切片； (3)将上述合金切片置于质量分数为65~70%的硝酸溶液中腐蚀，然后于200~250°C下退火，制得多孔金纳米材料。
2.如权利要求1所述的固定化角质酶，其特征是，所述固定化角质酶的酶活性回收率为72~95%。
3.如权利要求1或2所述的固定化角质酶，其特征是，所述金银合金为Au42Ag5815
4.如权利要求1或2所述的固定化角质酶，其特征是，所述合金切片的尺寸为5~IOmmX 5 ~IOmmX 20 μ m。
5.一种如权利要求1、2、3或4所述的固定化角质酶的制备方法，其特征是，将多孔金纳米材料加入角质酶溶液中，在45~55°C下振荡吸附，再经过洗涤、冷冻和真空干燥后，得到固定化角质酶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述角质酶溶液是由角质酶与磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液配制而成，所述多孔金纳米材料与所述角质酶的质量配比为1:0.4~0.6,所述角质酶溶液中角质酶的浓度为0.2~1.0mg/mL, pH值为7.0~9.0。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述振荡吸附的转速为120~150rpm，所述振荡吸附的时间为4~8h。
8.—种如权利要求1至4任意一项所述的固定化角质酶或权利要求5至7任意一项所述的制备方法制备的固定化角质酶在去除水体中邻苯二甲酸酯类的应用，其特征是，包括以下步骤:将固定化角质酶加入到含邻苯二甲酸酯类的水中，固定化角质酶的加入量为50~100mg/L,振荡反应。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是，所述振荡反应的温度为30~50°C，转速为100 ~150rpmo
10.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述邻苯二甲酸酯类为邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸二甲酯、苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸丁苄酯中的一种或多种。
【文档编号】C12N11/14GK103756991SQ201410008177
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】贺迅, 张辰, 曾光明, 黄丹莲, 刘亮, 赖萃, 赵美花, 黄超, 李宁杰, 危臻, 许飘, 程敏 申请人:湖南大学