一种判断花鲈养殖水体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种判断花鲈养殖水体的方法，具体包括待判断花鲈组织总RNA抽提、cDNA第一条链合成，PCR扩增催乳素受体基因，最后通过观察PCR扩增产物的凝胶电泳照片上是否有催乳素受体基因表达条带来判断所检测的花鲈是淡水养殖还是海水养殖。本发明公开的方法简单、准确，可应用于水产品领域的监管。
【专利说明】一种判断花I卢养殖水体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种判断花鲈养殖水体的方法，其可以确定所检测花鲈是淡水还是海
水养殖的产品。
【背景技术】
[0002]花自卢{lateolabrax japonicus)为近海中下层经济鱼类，也是目前海水主要养殖种类，该鱼病害少、生长快、易捕捞、产量高、效益好、肉质嫩、味道美、营养丰富，有生肌补血和滋补强身等保健作用，深受人们喜爱。经过淡化和驯养，花鲈也开始淡水中大面积养殖。
[0003]包括花鲈在内的广盐性鱼类，其在淡水养殖和海水养殖的鱼类品质存在差异，商品价格也有差异，因此需要建立一种鉴别此鱼类是淡水养殖还是海水养殖产品的技术方法，以防淡水鱼冒充海水鱼的出现，从而保障消费者权益；而目前还没有关于此类技术方法的报道。
[0004]催乳素受体基因(prolactin receptor, PRLR)参与鱼类适应盐度变化的适应调节，海水和淡水养殖鱼类不同组织的PRLR基因的表达水平存在差异，可用来检测花鲈的养
殖盐度差异。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种判断花鲈养殖水体的方法，以确定花鲈是淡水养殖还是海水养殖，为区分养殖花鲈产品提供质量评价依据。
[0006]为了解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案是:
一种判断花鲈养殖水体的方法，包括以下步骤:
(1)提取待判断花鲈组织的总RNA，所述组织为鳃或肾脏组织；
(2)根据M-MLV逆转录酶试剂盒的操作说明，以上述总RNA为反应物合成cDNA第一条
链；
(3)分别以引物SEQID N0.1和SEQ ID N0.2为正向引物和反向引物，以上述cDNA第一条链为模板，在PCR buffer、dNTP、Taq酶以及灭菌的去离子水存在下，进行PCR扩增反应得到扩增产物；
(4)利用凝胶电泳检测上述扩增产物，如果电泳图上有催乳素受体基因表达条带，则待判断花鲈的养殖水体为海水，如果电泳图上没有催乳素受体基因表达条带，则待判断花鲈的养殖水体为淡水；即完成花鲈养殖水体的判断；
其中，SEQ ID N0.1 为 5，- CAACATCACCGTGGTGGCCACCAACGC-3，； SEQ ID N0.2 为5， -TCGCAGCTGCCCCGGCCGGAGT-3，。
[0007]优选的技术方·案，步骤(1)中，所述组织为鳃。
[0008]上述技术方案中，步骤(1)中，提取待判断花鲈组织的总RNA的具体步骤为:将组织放入研钵中，加入液氮，待液氮挥发后把组织研磨成粉末；把组织粉末放入离心管，加入Trizol试剂裂解5~10分钟，然后加入氯仿室温静置15~20分钟，在离心机中以12000转/分钟离心15~20分钟，取上清，加入异丙醇静置10~20分钟；然后以12000转/分钟离心10~15分钟，倒去上清，加75%酒精洗涤沉淀，离心后倒掉上清，剩余物即为待判断花鲈组织的总RNA。[0009]上述技术方案中，步骤(3)中，正向引物、反向引物、cDNA第一条链、PCR buffer、dNTP、Taq酶以及灭菌的去离子水的体积比为1: 1: 1: 2.5: 2: 0.1: 17.4。
[0010]上述技术方案中，步骤(3)中，所述PCR扩增反应的条件为:951:预变性51^11，941:变性30s，退火温度68°C，退火时间30s，72°C延伸30s，30个循环，最后72°C lOmin。
[0011]上述技术方案中，步骤(4)中利用凝胶电泳检测扩增产物时的琼脂糖凝胶浓度为0.1%。
[0012]本发明中，步骤(2)所合成的cDNA第一条链置于_20°C保存或立即用作下一步的PCR扩增的模板；步骤(3)的正向引物与反向引物以催乳素受体基因为目的基因设计；PCR扩增反应体系的体积没有特别限定，可以为总共25μ 1的PCR反应体系，也可以为总共50 μ 1的PCR反应体系。催乳素受体基因(prolactin receptor, PRLR)参与鱼类适应盐度变化的适应调节，海水和淡水养殖鱼类不同组织的PRLR基因的表达水平存在差异，可用来检测花鲈的养殖盐度差异。
[0013]由于上述技术方案运用，本发明与现有相比有如下优点:
本发明首次公开了一种判断花鲈养殖水体的方法，通过检测花鲈催乳素受体基因在花鲈鳃或肾脏组织的表达有无，可有效鉴别花鲈是淡水养殖或是海水养殖的产品；该方法操作简便，结果准确，可应用在水产品市场的监管领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为实施例中海水养殖花鲈和淡水养殖花鲈各组织催乳素受体(PRLR)基因与β -actin基因的表达电泳图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例与附图对本发明做进一步阐述。
[0016]实施例1
(1)总RNA提取:把海水养殖花鲈的鳃组织50mg分别放入研钵中，加入液氮，待液氮挥发后把组织研磨成粉末。把组织粉末放入1.5ml离心管，加入Trizol试剂(购自Invitrogen公司)裂解5-10分钟，然后加入氯仿室温静置15分钟,然后在尚心机中尚心15分钟(12000转/分钟)，取500ul的上清，加入异丙醇静置lOmin，然后离心10min( 12000转/分钟)，倒去上清，加75%酒精洗涤沉淀，离心后倒掉上清得到海水养殖花鲈的鳃组织的总RNA，加入40 μ 1 DEPC水溶解备用；
(2)cDNA第一条链的合成:利用购自Promega公司的M-MLV逆转录酶试剂盒进行。取1 μ 1体积以上抽提的总RNA，与2 μ 1 Τ(18)引物混匀，70度5分钟，立即冰浴5分钟，加5 μ 1缓冲液，5 μ 1 dNTP, 1 μ 1RNA酶抑制剂，1.5ul M-MLV RT逆转录酶，再用DEPC水补足为25 μ 1发应总体积，置于37°C温浴1小时后再94度5分钟，所合成的cDNA第一条链立即用作下一步的PCR扩增的模板；
(3)进行PCR扩增催乳素受体基因:扩增反应在总共25μ 1的PCR反应体系中进行，包括:1μ 1以上合成的cDNA第一条链，2.5μ 1 PCR buffer (购自Promega公司)，2 μ 1dNTP (购自 Promega 公司)，1 μ 1 正向引物 SEQ ID N0.1，1 μ 1 反向引物 SEQ ID N0.2，
0.1 μ 1 Taq酶(购自Promega公司)，其余的为灭菌的去离子水。扩增发应条件变性5min，94°C变性30s，退火温度68 °C，退火时间30s，72 °C延伸30s，30个循环，最后72°C lOmin。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，用Bio-Rad公司的凝胶成像系统拍照记录；其中，SEQ ID N0.1 为 5’ - CAACATCACCGTGGTGGCCACCAACGC-3，； SEQ ID N0.2 为5， - TCGCAGCTGCCCCGGCCGGAGT-3，；
(4)进行PCR扩增β -actin基因:扩增反应在总共25 μ 1的PCR反应体系中进行，包括:1 μ 1 以上合成的 cDNA 第一条链，2.5 μ 1 PCR buffer (购自 Promega 公司)，2 μ 1 dNTP(购自 Promega 公司)，1μ 1正向引物 SEQ ID N0.3，1 μ 1 反向引物 SEQ ID N0.4,0.1μ 1 Taq酶(购自Promega公司),其余的为灭菌的去离子水。扩增发应条件:95°C预变性5min,94°C变性30s，退火温度54°C，退火时间30s，72°C延伸30s，30个循环，最后72°C lOmin。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，用Bio-Rad公司的凝胶成像系统拍照记录；
其中，所述的 SEQ ID N0.3 的序列为 5，-TGTGCAAAGCCGGATTCG-3’ ； SEQ ID N0.4 的序列为 5’ - CCTCTCTTGCTCTGGGCTTCA-3’。
[0017]实施例2
具体步骤同实施例1，不同之处为所采用的组织为海水养殖花鲈的肾脏。
[0018]实施例3
具体步骤同实施例1，不同之处为所采用的组织为淡水养殖花鲈的鳃。
[0019]实施例4
具体步骤同实施例1，不同之处为所采用的组织为淡水养殖花鲈的肾脏。
[0020]对比例
具体步骤同实施例1，不同之处为所采用的组织分别为:海水养殖花鲈的皮、海水养殖花鲈的脾脏、海水养殖花鲈的肝脏、海水养殖花鲈的心脏、海水养殖花鲈的肌肉、淡水养殖花鲈的皮、淡水养殖花鲈的脾脏、淡水养殖花鲈的肝脏、淡水养殖花鲈的心脏、淡水养殖花鲈的肌肉。
[0021]附图1为上述海水养殖花鲈和淡水养殖花鲈各组织催乳素受体(PRLR)基因和β-actin基因的表达电泳图；从图1中可明显看出β-actin基因各个组织均有较为稳定的表达，表明扩增起始总RNA的浓度是相近的，催乳素受体(PRLR)基因只有在海水养殖花鲈的鳃和肾脏组织中有表达，而在淡水养殖花鲈的包括鳃和肾脏在内的各组织都没有表达，因此，检测花鲈鳃或肾脏组织是否有催乳素受体(PRLR)基因表达条带，就可有效鉴别花鲈是经过海水养殖还是淡水养殖。
[0022]实施例5
除了步骤(3)，其余步骤同实施例1，步骤(3)为:扩增反应在总共25 μ 1的PCR反应体系中进行，包括:1 U 1以上合成的cDNA第一条链,2.5 μ 1 PCR buffer (购自Promega公司)，2μ1 dNTP (购自 Promega 公司)，1μ 1 正向引物 SEQ ID Ν0.1，1 μ 1 反向引物 SEQ IDN0.2,0.1μ 1 Taq酶(购自Promega公司)，其余的为灭菌的去离子水。扩增发应条件:95°C预变性5min，94°C变性30s，退火温度68 °C，退火时间30s，72°C延伸30s，35个循环，最后72°C lOmin。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶成像系统拍照记录(Bio-Rad公司)。
[0023]实施例6
除了步骤(3)，其余步骤同实施例1，步骤(3)为:扩增反应在总共50 μ 1的PCR反应体系中进行，包括:1 U 1以上合成的cDNA第一条链,5 μ 1 PCR buffer (购自Promega公司)，4μ1 dNTP (购自 Promega 公司)，2 μ 1 正向引物 SEQ ID N0.1，2 μ 1 反向引物 SEQ IDN0.2,0.25 μ 1 Taq酶(购自Promega公司)，其余的为灭菌的去离子水。扩增发应条件:95°C预变性5min，94°C变性30s，退火温度68 °C，退火时间30s，72°C延伸30s，30个循环，最后72°C lOmin。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶成像系统拍照记录(Bio-Rad公司)。
[0024]实施例7
(1)组织解剖:取待判断养殖花鲈50mg鳃组织；
(2)总RNA提取:把50mg组织放入研钵中，加入液氮，待液氮挥发后把组织研磨成粉末。把组织粉末放入1.5ml离心管，加入Trizol试剂(购自Invitrogen公司)裂解5-10分钟，然后加入氯仿室温静置15分钟，然后在离心机中离心15分钟(12000转/分钟)，取500ul的上清，加入异丙醇静置lOmin，然后离心lOmin (12000转/分钟)，倒去上清，加75%酒精洗涤沉淀，离心后倒掉上清得到待判断养殖花鲈的鳃组织的总RNA，加入40 μ 1 DEPC水溶解备用；
(3)cDNA第一条链的合成:利用购自Promega公司的M-MLV逆转录酶试剂盒进行。取1 μ 1体积以上抽提的总RNA，与2 μ 1 Τ(18)引物混匀，70度5分钟，立即冰浴5分钟，加5 μ 1缓冲液，5 μ 1 dNTP, 1 μ 1RNA酶抑制剂，1.5ul M-MLV RT逆转录酶，再用DEPC水补足为25 μ 1发应总体积，置于37°C温浴1小时后再94度5分钟，所合成的cDNA第一条链立即用作下一步的PCR扩增的模板；
(4)进行PCR扩增催乳素受体基因:扩增反应在总共25μ 1的PCR反应体系中进行，包括:1 μ 1 以上合成的 cDNA 第一条链，2.5 μ 1 PCR buffer (购自 Promega 公司)，2 μ 1 dNTP(购自 Promega 公司)，1μ 1正向引物 SEQ ID N0.1，1μ 1反向引物 SEQ ID N0.2,0.1μ 1 Taq酶(购自Promega公司),其余的为灭菌的去离子水。扩增发应条件:95°C预变性5min,94°C变性30s，退火温度68°C，退火时间30s，72°C延伸30s，30个循环，最后72°C lOmin。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分·离后，用Bio-Rad公司的凝胶成像系统拍照记录；凝胶照片上有催乳素受体基因表达条带的，为海水养殖的花鲈，否则为淡水养殖的花鲈。
【权利要求】
1.一种判断花鲈养殖水体的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)提取待判断花鲈组织的总RNA，所述组织为鳃或肾脏组织；(2)根据M-MLV逆转录酶试剂盒的操作说明，以上述总RNA为反应物合成cDNA第一条链；(3)分别以引物SEQID N0.1和SEQ ID N0.2为正向引物和反向引物，以上述cDNA第一条链为模板，在PCR buffer、dNTP、Taq酶以及灭菌的去离子水存在下，进行PCR扩增反应得到扩增产物；(4)利用凝胶电泳检测上述扩增产物，如果电泳图上有催乳素受体基因表达条带，则待判断花鲈的养殖水体为海水，如果电泳图上没有催乳素受体基因表达条带，则待判断花鲈的养殖水体为淡水；即完成花鲈养殖水体的判断；其中，SEQ ID N0.1 为 5，- CAACATCACCGTGGTGGCCACCAACGC-3，； SEQ ID N0.2 为 5，-TCGCAGCTGCCCCGGCCGGAGT-3，。
2.根据权利要求1所述判断花鲈养殖水体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组织为觸或肾脏。
3.根据权利要求1所述判断花鲈养殖水体的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取待判断花鲈组织的总RNA的具体步骤为:将组织放入研钵中，加入液氮，待液氮挥发后把组织研磨成粉末；把组织粉末放入离心管，加入Trizol试剂裂解5~10分钟，然后加入氯仿室温静置15~20分钟，在离心机中以12000转/分钟离心15~20分钟，取上清，加入异丙醇静置10~20分钟；然后以12000转/分钟离心10~15分钟，倒去上清，加75%酒精洗涤沉淀，离心后倒掉上清，剩余物即为待判断花鲈组织的总RNA。
4.根据权利要求1所述判断花鲈养殖水体的方法，其特征在于，步骤(3)中，正向引物、反向引物、cDNA第一条链、P`CR buffer、dNTP、Taq酶以及灭菌的去离子水的体积比为1: 1: 1: 2.5: 2: 0.1: 17.4。
5.根据权利要求1所述判断花鲈养殖水体的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR扩增反应的条件为:95°C预变性5min，94°C变性30s，退火温度68°C，退火时间30s，72°C延伸30s, 30个循环，最后72。。lOmin。
6.根据权利要求1所述判断花鲈养殖水体的方法，其特征在于，步骤(4)中，利用凝胶电泳检测扩增产物时的琼脂糖凝胶浓度为0.1%。
【文档编号】C12Q1/68GK103667518SQ201410008057
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】唐雪生, 王国清, 鲍宝龙, 张铖, 陈文君, 刘小玉 申请人:苏州市阳澄湖国家现代农业示范区发展有限公司