一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明提出了一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法。所述引物为SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的序列；所述探针为SEQ?ID?NO:4的序列，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个非淬灭荧光基团；所述试剂盒包括所述引物和探针。本发明的引物和探针及其试剂盒，用于检测单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的优点。
【专利说明】一种单纯疱疹病毒II型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及体外诊断试剂。尤其涉及一种单纯疱疹病毒II型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]单纯疱疫病毒II型(herpes simplex virus II , HSV II )是人类病毒性疾病中常见的病原体之一。单纯疱疹病毒II型(HSV II )检测方法有一系列的问题，比如。单纯疱疹病毒虽然易于进行体外细胞培养，并能产生可见的细胞病变，但病毒分离培养由于技术要求高、分离时间长、易污染、设备昂贵，并且需要熟练的技术人员，因此检测价值较低，不利于大量开展。常规PCR检测HSV I1-DNA，具有简便、快捷等特点。但是由于扩增后的产物需电泳检测，易造成交叉污染出现假阳性的结果。
[0003]突光定量PCR是(realtimefluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是 1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过突光染料或突光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。其反应原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0004]由于HSV II基因组保守区GC含量较高，将荧光定量PCR技术应用于HSV I1-DNA检测的关键技术是引物和荧光探针的设计，普通探针`设计由于GC含量太高导致探针TM值太高，容易非特异结合，导致假阳性结果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种具有稳定的线性结构的探针，还在于提供一种具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的单纯疱疹病毒II型核酸定量检测方法。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种单纯疱疹病毒II型核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID N0:4的序列，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团；所述引物的序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列。
[0007]所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记DABCYL非荧光淬灭基团。
[0008]本发明还提供一种单纯疱疹病毒II型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括所述的任一引物和探针。
[0009]试剂盒还包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂和参考品试剂。[0010]所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为Trizma?HCl、二氧化娃、Triton X_100、EDTA *2Na、异硫氰酸胍；所述洗漆液为 Trizma?HCl、Triton X-100、EDTA.2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为Trizma?HCl、Triton X-100、EDTA.2Na ;所述参考品试剂为HSV II阴性对照、HSV II阳性对照，HSV II强阳性对照和HSV II定量标准品；优选的，优选的，所述裂解液为10mMPH7.0 Trizma^HCl, I重量％0二氧化硅、I体积％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.0 Triz腿?HC]、I 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M 异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为 10mMPH7.0 Trizma和HCl、I 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na ;所述 HSV II PCR反应管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蜡油；HSV II反应缓冲液为 IOpM HSV II 引物，5pM HSV II 探针、20mMPH9.0 Trizma?HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2,0.1mM EDTA.2Na、0.2mM dNtps。
[0011]本发明提供一种应用所述引物和探针或所述试剂盒进行单纯疱疹病毒II型核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，
[0012]样品制备；制备得到纯化的核酸；
[0013]PCR扩增和荧光值读取，采用所述引物和探针或所述试剂盒；
[0014]结果判定。
[0015]所述样品制备为取0.5mL离心管做好标记，分别加入裂解液100 μ L然后加入待测样本50 μ L，混悬，室温静置10分钟进行裂解；1000Og离心25秒，去上清；加入150 μ L洗涤液对进行洗涤，去除剩余蛋白、脂类、糖类等PCR反应抑制物，混悬，1000Og离心25秒，去上清；加入150 μ L重复洗涤液，混悬，1000Og离心25秒，去上清备用，纯化得到的沉淀即为核酸；所述裂解液为 10mMPH7.0 Trizma?HCl、I 重量％。二氧化硅、I 体积％。Triton X-1OOUOmMEDTA *2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为 10mMPH7.0 Trizma?HCl、I 体积％。Triton X-100、ImM EDTA *2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗漆液为10mMPH7.0 Tri7ma?HCl、I体积％oTritonX-1OOUmM EDTA.2Na。PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1_3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒；`
[0016]结果判定。
[0017]所述PCR扩增程序为，38°C 5分钟，95°C 10分钟；进入以下循环:95 °C 15秒，580C 50秒，共40循环；所述荧光值读取为在PCR扩增每个循环的58°C，30秒时。
[0018]所述结果判定为:如果检测样本Ct值< 36，判断为阳性；
[0019]如果检测样本Ct值=40或Ct值=0，判断为阴性；
[0020]如果检测样本Ct值> 36且Ct值古O或40，样本重检；如果重检结果样本Ct值幸O或40，判断为阳性；如果重检检测样本Ct值=40或Ct值=0，判断为阴性。
[0021]样本提纯试剂用于提取单纯疱疹病毒II型样本中的核酸，所提取的核酸可以直接用于荧光定量PCR。
[0022]制备的核酸分别用反应缓冲液30 μ L融解，取25 μ L依次加入反应管中，混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。扩增曲线通过连接于PCR扩增仪的终端电脑获取，用于分析是否感染单纯疱疹病毒II型。[0023]参考品用于检测核酸提取过程和PCR扩增过程是否正常进行。
[0024]HSV II颈环引物作为一种组分加入到HSV II反应缓冲液。
[0025]本发明的试剂盒具体可以包括:
[0026]样本提纯试剂
[0027]裂解液1.1mL/支，2支；
[0028]洗涤液1.6mL/支，2支；
[0029]重复洗涤液，1.6mL/支，2支；
[0030]PCR扩增试剂:
[0031]HSV II PCR 反应管，2 μ L/支，20 支；
[0032]HSV II反应缓冲液，350 μ L/支，2支；
[0033]参考品试剂:
[0034]HS V II 阴性对照，165 μ L/ 支，I 支；
[0035]HSV II临界阳性对照，165 μ L/支，I支；
[0036]HSV II强阳性对照，165 μ L/支，I支。
[0037]HSV II定量标准品，165 μ L/支，共5支。
[0038]具体的:
[0039]HSV II阴性对照:生理盐水；
[0040]HSV II临界阳性对照:生理盐水、5.0 X 103copies/mL的HSV II质粒；
[0041]HSV II强阳性对照:生理盐水、5.0X 107copies/mL的HSV II质粒。
[0042]HSV II定量标准品见表1
[0043]
【权利要求】
1.一种单纯疱疹病毒II型核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针为SEQID N0:4的序列,其两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭突光基团；所述引物的序列为 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2 的序列。
2.权利要求1的单纯疱疹病毒II型核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记DABCYL非荧光淬灭基团。
3.—种单纯疱疹病毒II型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2的任一所述引物和探针。
4.权利要求3的单纯疱疹病毒II型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂和参考品试剂。
5.权利要求4的单纯疱疹病毒II型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为TrizmWHCl、二氧化硅、TritonX-100、EDTA.2Na、异硫氰酸胍；所述洗涤液为 Trizma?HCl、Triton X-100、EDTA.2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗漆液为Trizma?HCl、Triton X-100、EDTA.2Na ;所述参考品试剂为HSV II阴性对照、HSV II阳性对照，HSV II强阳性对照和HSV II定量标准品；优选的，优选的，所述裂解液为10mMPH7.0 Trizma?-HCU I重量％。二氧化硅、I体积％。Triton X-100、IOmM EDTA.2Na、2M 异硫氰酸胍；所述洗漆液为 10mMPH7.0 Trizma?HCl、I 体积％。TritonX-1OOUmM EDTA.2Na、2M异硫氰酸胍;所述重复洗涤液为10mMPH7.0 Trizma蝴Cl、I体积％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na ;所述 HSV II PCR 反应管含有 2U Taq 酶、0.01U UNG 酶、0.1mM EDTA *2Na、25微升石蜡油；HSV II反应缓冲液为IOpM HSV II引物，5pM HSV II探针、20mMPH9.0 Trizma?HCl、50mM KC1、1.5mM MgC12、0.1mM EDTA.2Na、0.2mM dNtps。
6.一种应用权利要求1-2任一引物和探针或权利要求3-5任一所述的试剂盒进行单纯疱疹病毒II型核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤， 样品制备；制备得到纯化的核酸； PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1-2任一引物和探针或权利要求3-5任一所述的试剂盒； 结果判定。
7.权利要求6的单纯疱疹病毒II型核酸定量检测方法，其特征在于，所述样品制备为取0.5mL离心管做好标记，分别加入裂解液100 μ L然后加入待测样本50 μ L,混悬，室温静置10分钟进行裂解；10000g离心25秒，去上清；加入150 μ L洗涤液对进行洗涤，去除剩余蛋白、脂类、糖类等PCR反应抑制物，混悬，1000Og离心25秒，去上清；加入150 μ L重复洗涤液，混悬，1000Og离心25秒，去上清备用，纯化得到的沉淀即为核酸；所述裂解液为10mMPH7.0 Trizma?HCl、I 重量％。二氧化硅、I 体积％。Triton X-1OOUOmM EDTA*2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为 10mMPH7.0 Trizma?HCl、I 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.0 Trizma?HCls I体积％。Triton X-1OOUmMEDTA.2Na。PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1_3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒； 结果判定。
8.权利要求7的单纯疱疹病毒II型核酸定量检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为，38°C 5分钟，95°C 10分钟；进入以下循环:95°C 15秒，58°C 50秒，共40循环；所述荧光值读取为在PCR扩增每个循环的58°C，30秒时。
9.权利要求6-8任一所述单纯疱疹病毒II型核酸定量检测方法，其特征在于，所述结果判定为: 如果检测样本Ct值< 36，判断为阳性； 如果检测样本Ct值=40或Ct值=0，判断为阴性； 如果检测样本Ct值> 36且Ct值古O或40，样本重检；如果重检结果样本Ct值古O或.40，判断为阳性；如果重检检测样本Ct值=40或Ct值=0，判断为阴性。
【文档编号】C12R1/93GK103805714SQ201410007761
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】魏超, 林家旺, 魏劭 申请人:厦门安普利生物工程有限公司