专利名称：一种应用角质酶进行酯合成的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用角质酶合成酯的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
酯是由酸与醇反应失水而生成的一类化合物，广泛应用于食品、酿酒、饮料、医药、保健品、日用化工等各领域。目前酯类物质的生产基本采用化学法，由无机催化剂(如浓硫酸)在高温下催化酸和醇的酯化反应而得。虽然生产成本较低，但过程中一些难以控制的副反应使得产品品质不高，强酸对设备的腐蚀也会增加维修费用，更重要的是，此法造成的环境污染不符合当今可持续发展的主流。而酶法合成酯类物质具有反应条件温和、能耗低、环 境污染小、并且产品品质好的优势，因此开发酶制剂在酯合成中的应用重要的现实意义和经济价值。角质酶是一种多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角质和各种聚酯的酯键，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反应外，角质酶还能催化酸与醇的酯化、一些脂肪酸盐与醇的转酯化。目前已有报道来源于真菌F. solani的角质酶在短链酯合成中的应用，其中己酸乙酯合成的转化率最高,为97%，但加酶量很高，为240U/mL,且中长链的酯合成转化率很低。本研究室在前期工作中鉴定了来源于Thermobifida fusca的两种角质酶Tfu_0882和Tfu_0883。本发明提供了该角质酶在酯合成中的应用方法。
发明内容
本发明提供了 Thermobifida fusca角质酶在酯合成中的应用方法。为解决上述问题，本发明技术方案为采用来源于Thermobififda fusca的角质酶进行酯合成,底物浓度为O. 1_1M,酸与醇的摩尔比为 1:1-2，加水量 O. 03-0. 08%,加酶量为 10-80U/mL，40-60°C、100-200rpm,反应时间4-15h，不同链长的酯的反应时间依据达到最高转化率时所需的时间而定。转化率以消耗的酸与初始的酸含量的比值来计。上述酶促反应条件与酶的性质有关系，也可根据酶加入量调整相应的工艺参数。所述酶促反应优先在有机溶剂中进行，并且有机溶剂的选用为本领域常规技术手段，更进一步地优先选用异辛烷或正己烷。所述角质酶的生产方法为在一定培养条件下，以生产角质酶的重组大肠杆菌(Chen S，Tong X, Woodard Rff,Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterizationof Bacterial Cutinase,The Journal of Biological Chemistry,2008,283 (28)25854-25862)发酵一定时间，经过12000rpm，离心lOmin，去除菌体，上清即为粗酶液，再经过真空冷冻干燥，获得角质酶的酶粉。所述角质酶活性的测定方法为以对硝基苯丁酸酯(PNPB)为底物，采用分光光度法在20° C下测定。反应体系为111^，包括96(^1^缓冲液(201111 Tris - HCl, IOmM NaCl,50mM sodium taurodeoxycholate, ρΗ8· 0), 20 μ L 酶液，20 μ L ρΝΡΒ (ImM,乙臆中保存)，在405nm处，记录对硝基酚的生成速率。酶活定义20° C下，每分钟催化对硝基苯丁酸酯生成I μM对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。所述有机试剂和底物酸、醇均需用4Α型分子筛除水，防止对反应体系中水含量的影响。所述酸的检测方法为气相检测仪器为GC-2010，GAS CHROMATOGRAPH SHIMADZU,色谱柱为RTX-WAX(30mX 0. 32mm)，检测器为FID，载气为N2,流速3mL/min，柱温条件为50°C(3min) -10°C min_1-220°C (lmin)。
具体实施例方式实施例1本实施例以Thermobifida fusca来源的角质酶Tfu_0883进行催化反应。有机试剂和底物酸、醇采用4A型分子筛除水之后用于酯合成。反应条件0.1M酸、0. 2M醇，加水量0. 03%, 500C，150rpm,酶30U/ml，反应溶剂异辛烷，具体结果见表1、表2。表I
权利要求
1.一种应用角质酶进行酯合成的方法，其特征在于，在酸与醇的反应体系中加入Thermobifida fusca 角质酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述角质酶为来源于Thermobifidafusca, NCBI 编号分别为 AAZ54920 和 AAZ54921。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸的碳链长度为C1-C18。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述醇的碳链长度为C1-C10。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸与醇的摩尔比为O.5-1。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系为反应溶剂为有机溶剂，加水量O. 03-0. 08%，加酶量为10-80U/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为异辛烷或正己烷。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应体系为异辛烷，加水量O.03-0. 08%,加酶量为10-80U/mL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，酶催化反应条件为40-60°C，100-200rpm。
全文摘要
本发明公开了一种应用角质酶进行酯合成的方法，在酸与醇的反应体系中加入Thermobifida fusca角质酶，角质酶为来源于Thermobifida fusca，NCBI编号分别为AAZ54920和AAZ54921，所述反应体系为反应溶剂为有机溶剂，加水量0.03-0.08%，加酶量为10-80U/mL。本发明的生产工艺，具有流程简单、转化率高、适用范围广等优势。
文档编号C12P7/62GK103014079SQ20121058108
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者吴敬, 宿玲恰, 陈坚 申请人:江南大学