专利名称：人胆固醇酯合成酶－1b及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学、分子生物学、基因工程和DNA重组技术领域。更具体地，涉及人胆固醇酯合成-1b(ACAT1b)及其编码序列和它们的应用。
背景技术：
人胆固醇酯合成酶即人酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT，Acyl-coenzyme Acholesterol acyltransferase，EC2.3.1.26)，是人细胞内唯一催化长链脂肪酸和游离胆固醇形成胆固醇酯的酶。ACAT在生物体内发挥重要的生理功能，主要参与生物体胆固醇及其酯类吸收、运输和储存等过程，是维持体内胆固醇及其酯类代谢平衡的关键酶之一。国内外大量研究表明，它在巨噬细胞中高活性地合成胆固醇酯，导致细胞内胆固醇酯的过量堆积而形成泡沫细胞，引起动脉粥样硬化(AS)早期病变；它的活性可影响神经细胞膜内的胆固醇量，而直接调节产生Aβ蛋白，与老年痴呆病变(AD)相关；它在肝、肠细胞中的活性变化，可直接影响合成胆固醇酯、胆固醇的吸收、脂蛋白的装配，直至影响胆固醇的血液水平和血液转运，与高胆固醇酯症直接相关；而长期饮食来源胆固醇的吸收缺乏，同样引起严重疾病，如小孩、老年的痴呆症等。因此，它是极重要的胆固醇代谢相关疾病药物靶蛋白，国际上已把ACAT作为发展抗动脉粥样硬化病变药物的主攻靶蛋白。但是，ACAT又是含量极低的一种内质网膜膜蛋白，即使国际上许多实验室或公司长期投入大量人力、物力等进行研究，至今未能纯化其天然型酶蛋白。所以，开展基因水平的工作，对深入研究ACAT的作用机制与结构功能及其与相关疾病的关系，显得极为重要，是目前唯一切实可行的途径。
目前在哺乳动物中发现有编码ACAT1和ACAT2的两种不同ACAT基因。1993年，美国Dartmouth医学院Chang TY实验室，首次克隆了具有活性功能的人ACAT1 cDNA(4011bp)，其开放阅读框编码550个氨基酸序列(Chang TY et al.，1993，J.Biol.Chem.，26820747-20755)。1996年，美国加州大学旧金山分校的R.V.Farese实验室成功进行了小鼠ACAT1基因敲除实验，并分析发现在肝脏和小肠中，仍有较强ACAT酶活性，由此推测存在另一种形式的ACAT。从计算机分析ACAT保守序列出发，1998年，三家实验室分别克隆了非洲绿猴(Anderson RA et al.，1998，J.Biol.Chem.，27326747-26754)、小鼠(Cases S et al.，1998，J.Biol.Chem.，27326755-26764)和人(Oelkers P et al.，1998，J.Biol.Chem.，27326765-26771)的ACAT2 cDNA。人ACAT2 cDNA长约2040bp，其开放阅读框编码522个氨基酸。ACAT1几乎在所有组织中都表达，而ACAT2只在肝脏和小肠中有高表达。
1999年，发明人实验室和Chang TY实验室合作发表了人ACAT1基因组DNA结构组织，并且发现人ACAT1 4.3 knt mRNA序列来自于两条不同的染色体(Li Bo-Liang et al.，J.Biol.Chem.，1999，27411060-11071)，通过一种跨染色体的反式剪接方式(interchromosomal trans-splicing)成熟。在此基础上，发明人对这种反式剪接ACAT1mRNA在翻译水平的调控进行深入的研究。发明人发现，除了与国外同行发表的长约1650bp的ACAT1 ORF编码的50kDa ACAT1蛋白相同外，这种反式剪接的ACAT1 mRNA还存在另一个上游的翻译起始，其翻译产生56kDa ACAT1大蛋白(系统命名为ACAT1b，相应的50kDa ACAT1蛋白被命名为ACAT1s)。反式剪接mRNA可编码产生活性蛋白在哺乳动物中十分罕见，因此多种ACAT1蛋白形式的存在，表明该基因功能的重要性和复杂性。
随着中国人民生活水平的提高和饮食结构的改变，心血管疾病和神经蜕变性疾病越来越成为威胁人们生命健康的重要杀手，大量流行病学和分子水平的研究已证明这些疾病与生物体内胆固醇水平密切相关。由于ACAT在体内胆固醇平衡、动脉粥样硬化发病和神经蜕变性疾病过程中起了关键作用，因此筛选ACAT的特异抑制剂成为一些制药公司竞相研究的热点。由于天然形式的ACAT蛋白还没有纯化成功，因此寻找ACAT特异有效的抑制剂还很困难。国内外越来越多的科学家和医药大公司参与到了该领域的研究。尤其是研究心脑血管疾病的科研专家们，特别希望能够筛选发明针对抗动脉粥样硬化和抗神经蜕变性疾病ACAT的有效药物。
发明人发现的ACAT1b，对于阐明ACAT的重要功能和揭示高胆固醇酯症、动脉粥样硬化和神经蜕变性疾病等的分子机理具有重要意义，此项基础性研究突破，将会很快引发它的应用性研究，并迅速促进胆固醇相关疾病药物的发明。然而，目前，还没有获得人ACAT1b及其编码序列。
因此，本领域迫切需要开发人ACAT1b及其编码序列。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的人胆固醇酯合成酶1b及其编码序列。
本发明的另一目的是提供生产这些人胆固醇酯合成酶及其编码序列的方法以及它们的用途。
本发明的第一方面，提供了一种人胆固醇酯合成酶-1b，所述蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物。
(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有人胆固醇酯合成酶-1b的功能的由(a)衍生的蛋白。
在一优选例中，所述人胆固醇酯合成酶-1b(ACAT1b)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含一选自下组的核苷酸序列(a)编码上述蛋白的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
优选的，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
较佳的，所述多核苷酸的序列包含选自下组的一种(a)SEQ ID NO1中32-1807位的序列；(b)SEQ ID NO1中1-1873位的序列。
更佳的，所述多核苷酸的序列具有选自下组的一种(a)SEQ ID NO1中32-1807位的序列；(b)SEQ ID NO1中1-1873位的序列。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有上述多核苷酸。较佳的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1中32-1807位序列。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述载体。优选的，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。更佳的，所述的宿主细胞是小鼠、大鼠、猴或人的细胞。
本发明的第五方面，提供了一种具有人胆固醇酯合成酶-1b活性的蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达人胆固醇酯合成酶-1b的条件下，培养上述宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人胆固醇酯合成酶-1b活性的蛋白。
本发明的第六方面，提供了一种能与上述人胆固醇酯合成酶-1b特异性结合的抗体。较佳的，所述抗体为单克隆抗体。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有安全有效量的上述人胆固醇酯合成酶-1b、或上述多核苷酸，以及至少一种药学上可接受的载体。
本发明的第八方面，提供了所述人胆固醇酯合成酶-1b在筛选或制备治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物中的应用。所述胆固醇相关疾病为动脉粥样硬化症或阿尔海默氏疾病。所述神经蜕变相关疾病为早老性痴呆。
本发明的第九方面，提供了上述多核苷酸在筛选或制备治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物中的应用。所述胆固醇相关疾病为动脉粥样硬化症或阿尔海默氏疾病。所述神经蜕变相关疾病为早老性痴呆。
本发明的第十方面，提供了一种筛选治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物的方法，所述方法包括步骤(a)在适合生长的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有上述表达载体，所述表达载体含有上述多核苷酸和与该多核苷酸可操作性相连的外源启动子，其中在第一组宿主细胞的培养基或裂解物或制备蛋白中添加候选物质，在第二组宿主细胞的培养基或裂解物或制备蛋白中不添加候选物质；(b)测定第一组和第二组宿主细胞或裂解物或制备蛋白中胆固醇酯合成酶-1b活性，其中第一组宿主细胞或裂解物或制备蛋白的该酶活性高于和低于第二组就表示该候选物质是治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1人ACAT1b cDNA序列即人胆固醇酯合成酶1b的多聚核苷酸编码序列。
图2人胆固醇酯合成酶1b的氨基酸序列。
图3含人ACAT1b编码序列的重组表达载体和蛋白印迹分析A.人ACAT1b编码序列的重组表达载体的构建示意图；B.人胆固醇酯合成酶1b的蛋白印迹分析。
图4人ACAT1b基因表达的人胆固醇酯合成酶的活性分析。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次证明克隆得到的人ACAT1b cDNA存在上游非AUG翻译起始位点，编码产生的一种人胆固醇酯合成酶氨基酸序列，构建含人ACAT1bcDNA的重组表达载体，转染哺乳动物细胞表达，用以分析人ACAT1b的酶活性。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“胆固醇酯合成酶-1b”、“ACAT1b”可互换使用，指具有ACAT1b氨基酸序列(图2)的酶；术语“胆固醇酯合成酶-1b cDNA”和“ACAT1b cDNA”可互换使用，指具有编码ACAT1b氨基酸序列的多聚核苷酸序列(图1，SEQ ID NO1)。
在本发明中，“胆固醇酯合成酶-1b保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及上述cDNA的多核苷酸变异体。这些多核苷酸变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变该cDNA的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少50个核苷酸，更好是至少100个核苷酸，最好是至少200个核苷酸以上至人胆固醇酯合成酶-1b cDNA的全长。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或克隆本发明的cDNA的核苷酸序列。
本发明的人ACAT1b cDNA的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用人细胞来源的cDNA文库或含人染色体细胞的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到本发明基因(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki RK et al.，Science，1985，2301350-1354)被优选用于获得本发明的cDNA。
本发明也涉及包含本发明基因的构建物或载体，以及用所述构建物或载体转化或转导的宿主细胞，以及经重组技术产生ACAT1b的方法。
适用于本发明的外源启动子没有特别限制，几乎所有的外源启动子都可用于本发明。代表性的外源启动子的例子包括(但并不限于)各种重组克隆启动子，如SV40启动子、CMV启动子等，和各种人工合成的启动子等。应注意，外源启动子还包括来自宿主本身的启动子。例如，对于某些遗传病(例如因某启动子的高活性或低活性所导致的疾病)，可以从病人本身分离得到有关启动子，然后将其与本发明的胆固醇酯合成酶-1bcDNA序列相连，形成含外源启动子的构建物，然后将所述构建物用于筛选治疗胆固醇相关疾病的药物或用于基因治疗。
一种构建物的例子就是与胆固醇酯合成酶-1b cDNA相连的外源启动子。至于胆固醇酯合成酶-1b cDNA与外源启动子的位置关系，所述cDNA序列应位于外源启动子的下游。
本发明中，含人胆固醇酯合成酶-1b cDNA的核苷酸序列可优选地插入到载体，例如表达载体中。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、真核(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点、胆固醇酯合成酶-1b cDNA之外，还可含有外源启动子和其它转录、翻译等控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含胆固醇酯合成酶-1b cDNA和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地与待表达的外源启动子相连接，以指导所述cDNA和对应mRNA合成。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含人胆固醇酯合成酶-1b cDNA的适当序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达人胆固醇酯合成酶-1b。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。优选哺乳动物细胞，如小鼠，大鼠、猴和人的细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。所采用的转化方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达ACAT1b。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长和表达的条件下进行培养。上述重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。
本发明还包括对ACAT1b DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于ACAT1b基因产物或片段。
本发明还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
抗ACAT1b的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的ACAT1b。利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ACAT1b发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明ACAT1b、其编码核酸、抑制剂、激动剂、拮抗剂或反义核酸或它们的组合，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.01微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的ACAT1b或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.01微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及定量和定位检测ACAT1b水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的ACAT1b水平，可以用作解释ACAT1b在各种疾病中的重要性和用于诊断ACAT1b缺如或增加所引起的疾病。
一种检测样品中是否存在ACAT1b的方法是利用ACAT1b的特异性抗体进行检测，它包括将样品与ACAT1b特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在ACAT1b。
在本发明的一个实施例中，通过PCR扩增和基因重组的方法得到了人ACAT1b cDNA序列，同时分析发现该cDNA序列5’-区域具有GGC翻译起始密码子、3’-区域具有TAG翻译终止密码子，说明这是一种非典型翻译阅读框的基因cDNA序列，其编码591个氨基酸序列的一种人胆固醇酯合成酶即ACAT1b。
在另一实施例中，本发明将人ACAT1b cDNA的表达载体，转染哺乳动物细胞表达，分析了人ACAT1b cDNA表达的胆固醇酯合成酶蛋白，同时利用Cell-free系统方法测定胆固醇酯合成酶活性，表明转染细胞表达人ACAT1b具有胆固醇酯合成酶活性，但远低于阳性对照活性，显示其对高胆固醇酯症等胆固醇代谢相关疾病的诊治、药物研究，具有极其重要的价值。
本发明的胆固醇酯合成酶-1b cDNA具有广阔的应用前景。ACAT1b无论对基础理论研究还是对胆固醇相关疾病(包括动脉粥样硬化症、阿尔海默氏疾病等)的诊断、治疗及药物筛选都具有重要意义。本发明使人们能在特定时期、特定组织里改变ACAT的表达活性，从而为治疗胆固醇代谢相关疾病(如动脉粥样硬化等)和神经蜕变性疾病提供另一种途径，并可利用本发明cDNA在哺乳动物细胞中表达ACAT1b。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 人ACAT1b cDNA的克隆、鉴定为获得含有人ACAT1b cDNA序列，设计合成引物，序列如下L1D2BF5’ACCGCTCGAGTAGTTAAATAG3’H1T7C15’AGGTCTAGAACAGCTGGCTCCAAAT3’使用L1D2BF和H1T7C1引物，利用PCR扩增ACAT1 cDNA K1序列，将此PCR产物克隆入pcDNA3(购自Invitrogen)的XhoI和XbaI位点，序列测定正确。在此基础上发现此cDNA序列具有编码591个氨基酸的人胆固醇酯合成酶的功能，发明人命名为ACAT1b基因序列。
测得的人ACAT1b cDNA的核苷酸序列如图1和SEQ ID NO1所示。
实施例2 人ACAT1b cDNA阅读框及其编码氨基酸序列分析根据测序得到的ACAT1b cDNA序列和一系列序列突变的研究，进行分析发现该cDNA序列5’-区域具有非AUG(GGC)翻译起始密码子、3’-区域具有TAG翻译终止密码子，说明这是具有非典型翻译阅读框的基因cDNA序列，其编码591个氨基酸序列的人胆固醇酯合成酶即ACAT1b(图2)，比国外同行报道的人ACAT1s多了41个氨基酸残基序列。
实施例3 人ACAT1b cDNA真核表达载体的构建为确定人ACAT1b cDNA的蛋白表达和酶活性分析，以先报道的人ACAT cDNA K1序列的编码区作为阳性(Positive)对照；然后，将获得的阳性对照和样品cDNA分别接入pcDNA3(购自Invitrogene公司)的XhoI和XbaI之间，位于CMV启动子的下游，得到相应的真核表达载体pcDNA3-A1s和pcDNA3-A1b(参见图3A图谱)。为与ACAT1s蛋白分开，在ACAT1b cDNA中的相应密码子引入突变，同样接入pcDNA3的XhoI和XbaI之间，位于CMV启动子的下游，得到相应的真核表达载体pcDNA3-A1bm，使其只表达ACAT1b(参见图3B表达图谱)。
实施例4 细胞培养、DNA转染和人ACAT1b cDNA表达的蛋白质分析利用一株ACAT缺陷型的CHO细胞株AC29，在F12培养基(含10％FBS，100μg/mlstreptomycin，100μg/ml penicillin)中，于湿度95％、5％CO2、37℃下培养。人ACAT1bcDNA编码蛋白的表达分析是通过转染实验确定的，选用的方法是磷酸钙共沉淀法(Calcium-phosphate transfection，Liu J et al.1997)。分别将载体pcDNA3(Negative对照)、pcDNA3-A1s(Positive对照)、pcDNA3-A1b和pcDNA3-A1bm四种质粒DNA，以磷酸钙方法转染ACAT缺陷型CHO细胞株AC29进行表达研究。
具体实验过程如下转染前一天将细胞接种到60mm培养皿(dish)中，每dish细胞数为500,000个/5ml，转染时细胞丰度达30-50％。转染前3小时换新鲜培养基。制备磷酸钙沉淀质粒DNA，包括12μg样品质粒DNA(每个dish)，然后逐滴将DNA/磷酸钙沉淀液加在培液中，37℃转染AC29细胞。10小时后，PBS洗细胞2次，在新鲜培养基中恢复生长。48小时后收集转染的细胞。
收集细胞测定蛋白表达方法如下培养的转染细胞用冷PBS洗两次，加100μl细胞裂解液(10％SDS，50mM Tris-HCl pH6.8，1mM EDTA，25mM DTT)溶解细胞蛋白质。细胞裂解蛋白溶液用18号注射器针头剪切数次，以断裂粘稠的染色体DNA。蛋白含量测定按照Lowry法略作修改进行。SDS-PAGE分析按照Laemmli方法进行，胶浓度为12％。电泳完毕后，在电泳凝胶转移仪上从下至上分别铺4层电转移液浸泡的滤纸-硝酸纤维素膜-电转缓冲液漂洗过的聚丙烯酰胺凝胶-4层电转液浸泡的滤纸，设定电流1mA/cm2转移30分钟。转移完毕的硝酸纤维素膜用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭30分钟后，加入稀释的DM54 ACAT2抗体覆盖膜，4℃摇过夜或室温2小时。TBST缓冲液洗膜3次。然后加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG覆盖膜，室温1小时，TBST缓冲液洗膜3次，TBS缓冲液洗膜2次。按ECL蛋白印迹检测试剂盒(Santa CruzBiotechnology Inc.公司)提供的方法进行荧光显影，结果参见图3B。
实施例5 细胞培养、DNA转染和人ACAT1b cDNA表达蛋白的酶活性分析细胞培养、DNA转染实验基本同上述实施例4，然后进行Cell-free系统方法测定胆固醇酯合成酶活性。
Cell free系统测定胆固醇酯合成酶活性的分析参照文献报道的方法(Chang CCYet al.，1995，J.Biol.Chem.27029532-29540)，裂解转染细胞，加入胆固醇和3H标记的油酰CoA底物，测定微粒体中ACAT的酶活性。具体做法是，冷PBS洗两次后的转染AC29细胞加入100μl含1mM EDTA的1mM Tris(pH7.8)，冰上放置5分钟后收集细胞裂解物，取15μl 2M KCl，7.5μl 10％ CHAPS、15μl细胞裂解物和反应底物37℃作用10分钟，然后加4ml CHCl3∶MeOH(2∶1)混匀终止反应，再加入10μl油酰胆固醇，混匀，加1ml水，离心，弃水相，吹干，加60μl乙酸乙脂，薄层层析，收集胆固醇脂，同位素计数，并以Western blot校正ACAT1b的表达量(标准ACAT活性，Normalized ACAT Activity)。该方法测得ACAT1b具有胆固醇酯合成酶活性，但远低于阳性对照(参见图4)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>人胆固醇酯合成酶-1b及其编码序列<130>03121b<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1873<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(32)…(1807)<223>
<400>11 tagttaaata gctatattta tatatatcca g31ggc acc ccg aat tcg gga gag ctt ccc gga gtc gac ctt cct gct76Gly Thr Pro Asn Ser Gly Glu Leu Pro Gly Val Asp Leu Pro Ala1 5 10 15ggc tgc tct gtg acc gct tcc cgg ctc tgc cct ctt ggc cga agt121Gly Cys Ser Val Thr Ala Ser Arg Leu Cys Pro Leu Gly Arg Ser20 25 30gcc cgc tgc cgg gcg cgg gcc tca gac aat aca atg gtg ggt gaa166Ala Arg Cys Arg Ala Arg Ala Ser Asp Asn Thr Met Val Gly Glu35 40 45gag aag atg tct cta aga aac cgg ctg tca aag tcc agg gaa aat211Glu Lys Met Ser Leu Arg Asn Arg Leu Ser Lys Ser Arg Glu Asn50 55 60cct gag gaa gat gaa gac cag aga aac cct gca aag gag tcc cta256Pro Glu Glu Asp Glu Asp Gln Arg Asn Pro Ala Lys Glu Ser Leu65 70 75gag aca cct agt aat ggt cga att gac ata aaa cag ttg ata gca301Glu Thr Pro Ser Asn Gly Arg Ile Asp Ile Lys Gln Leu Ile Ala80 85 90aag aag ata aag ttg aca gca gag gca gag gaa ttg aag cca ttt346
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<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>引物H1T7C1<400>4aggtctagaa cagctggctc caaat 2权利要求
1.一种人胆固醇酯合成酶-1b，其特征在于，该蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物。(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有人胆固醇酯合成酶-1b的功能的由(a)衍生的蛋白。
2.如权利要求1所述的人胆固醇酯合成酶-1b，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中32-1807位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1873位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是小鼠、大鼠、猴或人的细胞。
10.一种具有人胆固醇酯合成酶-1b活性的蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达人胆固醇酯合成酶-1b的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人胆固醇酯合成酶-1b活性的蛋白。
11.一种能与权利要求1所述的人胆固醇酯合成酶-1b特异性结合的抗体。
12.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的人胆固醇酯合成酶-1b、或权利要求3所述的多核苷酸，以及至少一种药学上可接受的载体。
13.权利要求1所述人胆固醇酯合成酶-1b在筛选或制备治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物中的应用。
14.权利要求3所述的多核苷酸在筛选或制备治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物中的应用。
15.一种筛选治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物的方法，其特征在于，包括步骤(a)在适合生长的条件下，培养宿主细胞，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸和与该多核苷酸可操作性相连的外源启动子，其中在第一组宿主细胞的培养基或裂解物或制备蛋白中添加候选物质，在第二组宿主细胞的培养基或裂解物或制备蛋白中不添加候选物质；(b)测定第一组和第二组宿主细胞或裂解物或制备蛋白的权利要求1所述的胆固醇酯合成酶-1b活性，其中第一组宿主细胞或裂解物或制备蛋白的该酶活性高于或低于第二组就表示该候选物质是治疗胆固醇相关疾病或神经蜕变相关疾病的药物。
全文摘要
本发明提供了人胆固醇酯合成酶－1b及其编码序列，含所述序列的构建物和载体，以及它们的用途。人ACAT1b cDNA的核苷酸序列长约1.9kb，编码591个氨基酸序列。本发明的人ACAT1b cDNA及其编码的人胆固醇酯合成酶可用于研究筛选治疗或辅助治疗高胆固醇酯症、动脉粥样硬化症、早老性痴呆症等的药物。
文档编号C12N15/85GK1626655SQ200310109368
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者李伯良, 张大元, 杨力, 何崇荛, 杨新颖, 陈佳, 陈江 申请人:中国科学院上海生命科学研究院