专利名称:胆固醇氧化酶发酵制备工艺的制作方法
本发明属生物工程技术领域：
。胆固醇氧化酶在生理条件下能够氧化胆固醇成为胆甾-4-烯-3-酮及过氧化氢。由于它对胆固醇有专一性反应，因此利用此反应及其他辅助反应，可以测定血清中游离胆固醇的含量，反应过程如下胆固醇+O2(胆固醇氧化酶)/() 胆甾-4-烯-3-酮+H2O22H2O2+4-氨基安替比林+酚 (过氧化氢酶)/() 醌亚胺色素+4H2O以上反应原理现在已经普遍应用于临床诊断，是测定人血清中胆固醇含量的快速、灵敏、正确的方法。在上述反应中，于37℃时，每分钟能把1微克分子胆固醇按上述反应转化为胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢的酶量定为1酶活单位。
1948年Turfit指出Proactinomyces erythropelia菌株能分解胆固醇为4-甾醇烯-3酮的代谢物，1973年W.Richmard由Nocardia菌属中分离得到胆固醇氧化酶，其后H。M。Flegg从细菌中筛选获得胆固醇氧化酶，因而从70年代开始，美、德、日本先后从细菌、诺卡氏菌、霉菌中生产胆固醇氧化酶，以替代化学试剂应用于临床，具有准确、快速的优点，但是，在多烯类的产生菌中生产胆固醇氧化酶至今未见报导。
本发明的目的是为得到符合临床分析要求的胆固醇氧化酶。系采用经过生理生化特征和形态培养特征鉴别为球孢链霉菌(Strep-tomyces globisporus)C-412菌种接种于含有3%黄豆饼粉水解液、1%葡萄糖、0.5%酵母膏、2.0%甘油、0.1%K2HPO4、0.1%碳酸钙的发酵培养基中或接种到含有1-4%葡萄糖、0.1-1%可溶性淀粉、0.1-1%酵母粉、0.1-1%Ca2CO3、1-5%黄豆饼粉水解液的培养基中、加入用表面活性剂预处理过的各种诱导剂在通气搅拌的条件下，提高发酵产酶单位，发酵液经过分离、提取、盐析、透析、柱层析等步骤，所得的酶稳定性好，可以保存一年半时间，该酶试剂用于临床分析，检测准确率高，数据稳定。
实例一将Streptomyces globisporus C-412砂土孢子接种于淀粉-硝酸钾的高氏合成一号孢子斜面培养基中，28℃培养7-10天后挖取适量成熟的斜面孢子接种于100毫升的种子培养液的750毫升三角瓶中、摇床220转/分培养28℃48-72小时，然后将所得菌丝以1-5%种量接种至装有4公斤的玻璃发酵罐中250-300转/分，通气1∶0.5v/v/min，28℃培养24-36小时，培养完毕，取10ml的定量发酵液、离心弃上清液再用蒸馏水洗涤离心弃上清液，加入Tris-HCl缓冲液至10ml，按照Richmond方法，测出在发酵液中能产生胆固醇氧化酶，经测定其酶活力为0.1毫升的菌丝浸泡液具有0.6-0.7的OD值。
实例二将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)C-412菌种接入3-5立升种子液培养基中，种子培养基配方为葡萄糖1%、可溶性淀粉2%、豆饼粉水解液2%、酵母粉1%、PH6.5 26℃培养72小时。
将培养好的种子液加入到50立升发酵罐中，罐内培养基成份为4%黄豆饼粉水解液、2%葡萄糖、0.1%K2HPO4、0.5%诱导剂L-10，PH6.5，于26℃通气、搅拌培养36小时，培养完毕，收集菌体。
发酵液30立升经分离后得菌丝体，加含有表面活性剂Tris-HCl缓冲液11立升提取，提取液以硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解后得1.1立升酶液，该酶液通过装有DEAE纤维素的层析柱吸附，酶液全部通过后以低浓度的Tris-HCl缓冲液洗涤层析柱，然后用相同的Tris-HCl缓冲液浓度梯度洗脱，分部收集酶活部分，每立升发酵液得200单位酶活，总收率为28%，提纯6倍。
实例三将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)C-412菌种接入装有30立升种子培养基的发酵罐中，种子培养基配方为2%葡萄糖、1%可溶性淀粉、5%黄豆饼粉水解液、2%酵母粉，PH6.5于26℃通气搅拌培养48-72小时。
将培养好的种子液加入到200立升发酵罐中，罐内培养基成分为2%黄豆饼粉水解液、3%葡萄糖、1%K2HPO4、0.1%蛋白胨、0.6%诱导剂L-10，PH6.5于26℃通气搅拌培养25小时，收集菌丝体，经提取、盐析、透析、柱层析得胆固醇氧化酶，每立升发酵液得300单位酶活，总收率30%。提纯7倍。
④文件名称 页 行 补正前 补正后说明书 1 13 4-甾醇烯-3 胆-4-烯-3酮 -酮说明书 1 18 在多烯类的产生 在多烯类抗生素的菌中 产生菌中权利要求
书 1 17 2、按权利要求 2、按权利要求
11所述诱导剂L 所述的那种利用发-10为…… 酵工程制备胆固醇氧化酶的工艺，其特征是诱导剂L-10……
权利要求
1.一种利用发酵工程制备胆固醇氧化酶的工艺，本发明的特征在于将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)C-412的菌种，经配方为4%葡萄糖、2%黄豆饼粉水解液、0.5%酵母膏、0.5%可溶性淀粉、0.2%碳酸钙的种子培养基100毫升置三角瓶中，于旋转摇床220转/分，28℃培养48-72小时，再经配方为3%黄豆饼粉水解液、1%葡萄糖、0.5%酵母膏、2.0%甘油、0.1%K2HPO4、0.1%碳酸钙的发酵培养基、28℃24-36小时，分离菌丝体或经配方为1-4%葡萄糖、0.1-1%可溶性淀粉、1-5%豆饼粉水解液、0.5%-2%酵母粉，L-10 0.1-10%诱导剂PH6-9的种子培养基在温度25～35℃通气搅拌培养48-72小时，再经组份为1-4%葡萄糖、1-5%豆饼粉水解液、0.1-1%K2HPO4、0.1-0.5%蛋白胨、0.1-0.8%诱导剂L-10PH6-9的发酵培养基在温度25-35℃发酵培养18-30小时分离菌丝体、再经提取、盐析、透析、柱层析精制获得胆固醇氧化酶。
2.按权利要求
1所述的诱导剂L-10为各种酯类、油类、聚氧乙烯醚类和表面活性剂，其中酯类是豆磷酯、卵磷酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯，其中油类为豆油和花生油。
3.按权利要求
2所述的诱导剂L-10中的表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-80。
专利摘要
本发明属于生物工程技术领域：
。将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)C—412，经过培养、发酵得到有酶活的菌体，通过分离、提取、精制制备胆固醇氧化酶。该酶的稳定性好，可以保存一年半时间。该酶试剂可供临床化验，用于检测血清中胆固醇，检测准确率高，数据稳定。
文档编号C12N9/04GK86100555SQ86100555
公开日1987年10月21日 申请日期1986年4月10日
发明者徐月美, 杨光礼 申请人:国家医药管理局上海医药工业研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan