一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC?No.8312，保藏日期为：2013年10月9日，所述菌株分类命名为：海洋嗜盐单胞菌SH-19(Halomonas?elongata)，所述菌株的16S?rDNA的多核苷酸序列为SEQ?ID?No.1所示的多核苷酸序列。本发明所述菌株SH-19可高效表达褐藻胶裂解酶，可应用于高效生产褐藻胶裂解酶，本发明所述菌株SH-19的发酵培养基配料简单，都是实验室中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使褐藻胶裂解酶的生产成本大大降低，可应用于大规模生产。
【专利说明】一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生物【技术领域】，具体涉及一种生产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 藻类被誉为“能源新秀”，与其他陆生植物相比，藻类可在单位养殖面积下获得更高的生物量，也更容易大面积栽培和机械化采收。因此藻类渐渐成为现代的生物能源材料，在产量、产能以及总成本上都具有显著优势。
[0003]褐藻中含有大量的褐藻胶，褐藻类本身的结构复杂，其细胞壁组成成分褐藻胶难以降解，各种多糖紧紧结合成一个有机整体，复杂的结构造成了藻类利用上的困难。这无形中增加了利用藻类生物能源生产的成本。另外，褐藻胶被裂解以后可以制备不同长度的寡糖，这种寡糖具有多种生物活性，具有潜在的产业价值。因此，致力于寻找经济高效的细胞壁多糖裂解酶成为研究热点之一。
[0004]当前，常规的裂解酶存在水解效率低、产量低等问题。所以，通过现有的技术手段，对自然界及动物肠道内的微生物资源进行挖掘，以期望得到一种在降解褐藻胶方面上能力突出的菌株。为后续的采用系统方法研究自然中降解策略，为发展有效褐藻加工技术提供重要的理论和技术基础。
【发明内容】
[0005]本发明目的之一在于提供一株生产褐藻胶裂解酶的菌株，本发明所述菌株是首次从海胆肠道研磨物中筛选得到，可以在最适条件下高效的合成褐藻胶裂解酶。
[0006]本发明目的之二在于提供一株生产褐藻胶裂解酶的菌株的应用，即将筛选出的Halomonas elongata SH-19菌株用于褐藻胶裂解酶的制备,从而高效的生产褐藻胶裂解酶，以弥补现有的褐藻胶水解效果差的不足。
[0007]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为:
[0008]一株产褐藻胶裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8312，保藏日期为:2013年10月9日，所述菌株分类命名为:海洋嗜盐单胞菌SH-19 (Halomonas elongata)。
[0009]优选的是，所述菌株筛选自海胆肠道。
[0010]一种产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，应用如权利要求1或2所述的菌株生产褐藻胶裂解酶。
[0011]优选的是，所述的方法具体包括以下步骤:在褐藻胶裂解酶生产阶段，生产发酵培养基的碳源为褐藻酸钠，褐藻酸钠在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为I~3%，氮源为硫酸铵或者氯化铵。
[0012]优选的是，所述的方法具体包括以下步骤:
[0013]I)种子液制备阶段:利用如权利要求1或2所述的菌株制各种子液；[0014]2)菌种繁殖阶段:将所述种子液接种于一次发酵培养基后，所述一次发酵培养基在pH为4.5~9.5和温度为26~30°C的条件下进行连续发酵；
[0015]3)褐藻胶裂解酶生产阶段:向所述一次发酵培养基中添加褐藻酸钠和氯化钠，配制成生产发酵培养基，生产发酵培养基中的褐藻酸钠和氯化钠的浓度各为I~3%，所述生产发酵培养基的pH为4.5~9.5，在26~30°C条件下连续发酵8~14天。
[0016]优选的是，所述一次发酵培养基成分为:碳源、氮源和陈海水，其中，碳源为牛肉膏或/酵母浸提物，所述氮源为硫酸铵或氯化铵。
[0017]优选的是，所述一次发酵培养基中牛肉膏和酵母浸提物的质量百分比浓度各为0.1~1.5%，硫酸铵或者氯化铵的质量百分比浓度为0.1-2%。
[0018]优选的是，所述步骤3)中，褐藻酸钠在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为1 %，氯化钠在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为I%。
[0019]优选的是，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为7.5~8.5。
[0020]优选的是，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为7.5。
[0021]本发明的有益效果本发明所述菌株SH-19是首次从海胆肠道研磨物中筛选出来，在比较适宜的生长条件下可高效表达褐藻胶裂解酶，可应用于高效生产褐藻胶裂解酶，本发明还对所述菌株SH-19高效表达褐藻胶裂解酶的生活条件进行了探索，获得了所述菌株表达褐藻胶裂解酶的发酵培养中最优碳源、最优氮源、最优氯化钠浓度等生活条件，本发明所述菌株SH-19的发酵 培养基配料简单，都是实验室中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使褐藻胶裂解酶的生产成本大大降低，可应用于大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明所述菌株与blast结果相近的菌的16srRNA序列构建的系统发育树。
[0023]图2为本发明所述菌株在不同碳源的发酵培养基中时的酶活力和生物量比较图。
[0024]图3为本发明所述菌株在不同氮源的发酵培养基中时的酶活力和生物量比较图。
[0025]图4为本发明所述菌株在不同浓度氯化钠的发酵培养基中时的酶活力和生物量比较图。
[0026]图5为本发明所述菌株在不同pH值的发酵培养基中时的酶活力和生物量比较图。【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0028]本发明筛选的Halomonas elongata SH-19菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8312，保藏日期为:2013年10月9日，所述菌株分类命名为:海洋嗜盐单胞菌SH-19 (Halomonas elongata)，所述菌株的16S rDNA的多核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列。
[0029]Halomonas elongata SH-19 的形态特征:
[0030]菌落为圆形，光滑、规则、有光泽、不透明、棕色菌落。直径在2_3mm。菌体宽度
0.5-0.8 μ m，长度1-2 μ m，革兰氏染色呈阳性。[0031]菌种的基因组学鉴定:
[0032]通过对菌株SH-19的16SrDNA序列测定,将该菌16s rDNA片段与Genbank中序列进行比对从而确定该菌的种属，得到该菌株是一株极端嗜盐菌属细菌。
[0033]下面结合具体实施例对本发明实施过程作详尽描述:
[0034]实施例1菌株的筛选与鉴定
[0035]1、产酶菌株的筛选
[0036] 本发明是用研磨后的海胆肠道来筛选褐藻胶裂解酶的生产菌株，将海胆肠道研磨样品倍比稀释后于褐藻酸钠为唯一碳源筛选培养基中培养，挑取可在筛选培养基中生存的菌株用于褐藻胶裂解酶的发酵生产，菌株经鉴定后冷冻保存于甘油管中。具体步骤如下:
[0037]将研磨后的海胆肠道样品倍比稀释后涂布于褐藻酸钠为唯一碳源的选择培养基中，置于25°C~30°C下培养I~7天.选取可在此条件下生长的菌落，获得的发酵菌株挑选产酶活最高的一株经16s rDNA序列分析鉴定为Halomonas sp.,命名为Halomonaselongata SH—19。
[0038]筛选培养基组成为(w/v):褐藻酸钠I~2 %，硫酸铵0.5~2 %，铁0.1~I %，琼脂 1.5 ~2.5%，添加 1000ml 陈海水，pH=7.6 ~8.5。
[0039]2、Halomonas elongata SH-19 的形态特征
[0040]本发明获得的菌株其菌落为圆形，光滑、规则、有光泽、不透明、白色菌落边缘略带黑色环。直径在2-3mm。菌体宽度0.5-0.8 μ m，长度1-2 μ m，革兰氏染色呈阳性。
[0041]3、菌株的基因组学鉴定
[0042]利用菌落PCR方法,将菌株16s rDNA片段与Genbank中序列进行比对从而确定该菌的种属。
[0043]I)菌落 PCR:
[0044]将筛选到的菌株在筛选培养基中划线纯培养三代后将单菌落挑出进行菌落16srDNA PCR，期望得到该菌的16s rDNA特征片段与Genbank比对确定该菌株的种属特性。
[0045]16s rDNA 引物为:1492R:5，-TACCTTGTTACGACTT-3，
[0046]27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
[0047]扩增体系:
【权利要求】
1.一株产褐藻胶裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8312，保藏日期为:2013年10月9日，所述菌株分类命名为:海洋嗜盐单胞菌SH-19 (Halomonas elongata)。
2.如权利要求1所述产褐藻胶裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株筛选自海胆肠道。
3.一种产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，应用如权利要求1或2所述的菌株生产褐藻胶裂解酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤:在褐藻胶裂解酶生产阶段，生产发酵培养基的碳源为褐藻酸钠，褐藻酸钠在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为I~3 %，氮源为硫酸铵或者氯化铵。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 1)种子液制备阶段:利用如权利要求1或2所述的菌株制各种子液； 2)菌种繁殖阶段:将所述种子液接种于一次发酵培养基后，所述一次发酵培养基在PH为4.5~9.5和温度为26~30°C的条件下进行连续发酵； 3)褐藻胶裂解酶生产阶段:向所述一次发酵培养基中添加褐藻酸钠和氯化钠，配制成生产发酵培养基，生产发酵培养基中的褐藻酸钠和氯化钠的浓度各为I~3%，所述生产发酵培养基的pH为4.5~9.5，在26~30°C条件下连续发酵8~14天。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基成分为:碳源、氮源和陈海水，其中，碳源为牛肉膏和酵母浸提物，所述氮源为硫酸铵或氯化铵。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基中牛肉膏和酵母浸提物的质量百分比浓度各为0.1~1.5%，硫酸铵或者氯化铵的质量百分比浓度为0.1-2%。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，褐藻酸钠在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为1 %，氯化钠在生产发酵培养基中的质量百分比浓度为I %。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为7.5~8.5。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述一次发酵培养基和所述生产发酵培养基pH均为7.5。
【文档编号】C12N1/20GK103911315SQ201410008138
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】李德茂, 陈树林, 张藩, 高峰 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所