Marker、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司。
[0026] 引物合成与基因序列的测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。
[0027] LB培养基（g/L) : 10蛋白胨；10氯化钠；5酵母粉，pH 7. 0,溶剂为水。
[0028] 实施例1 :全长腈水合酶基因的克隆
[0029] 采用细菌基因组提取试剂盒（AxyPr印，康宁生命科学有限公司）提取慢生型大豆 根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)USDA 110(美国农业菌种保藏中心，NRRL B-4361)的 基因组，核酸电泳检测如图1所示。
[0030] 根据慢生型大豆根瘤菌USDA 110的基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列（如SEQ ID NO. 1)设计引物NH05-Up和NH05-Down，以慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因组为模板， PCR扩增全长腈水合酶基因，如图2所示。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收， 获得的基因片段由SEQ ID NO. 2所示α亚基（编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5所示）、 SEQ ID NO. 3所示β亚基（编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 6所示）和SEQ ID NO. 4所示 活化元件（编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 7所示）依次连接构成。
[0031] 上游引物NH05-Up (含有Nde I酶切位点）和下游引物NH05-Down (含有Hind III 酶切位点）如下所示：上游引物 NH05_Up :5' -ggaattccatatgcagcccatcccatggc-3' ；
[0032] 下游引物 NH05_Down :5' -cccaagcttctacctaaaatcctccggcttcagc-3'。
[0033] PCR反应体系和PCR反应条件：
[0034] PCR扩增体系：
[0035] PrimerSTAR DNA 聚合酶 25 μ?; NH05-Up (10 pmol/ul) 2.0 μ?； NH05-Down ( 10 pmol/μ?) 2.0 μ?； 模板DNA (基因组） 2.0 μ?; 加双蒸水至 50 μ?。
[0036] PCR扩增条件：
[0037] 1)预变性：95°C 2min ;
[0038] 2)变性：95°C 10s ;退火：58°C 15s ;延伸：72°C 15s ;共循环 30 次；
[0039] 3)延伸：72°C IOmin ;
[0040] 4)4。〇保存2.011。
[0041] 实施例2 :设计具有大肠杆菌SD序列和间隔序列的全长臆水合酶基因
[0042] 为了实现腈水合酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内的可溶性功能表达，在腈水 合酶β亚基因上游添加或替换大肠杆菌的SD序列（如SEQ ID NO. 8所示）和间隔序列 (如SEQ ID NO. 9所示）。根据腈水合酶基因序列（由SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4依次连接组成）设计引物Link-Up和Link-Down，以实施例1中的PCR产物为模 板，通过重叠 PCR法扩增获得含有大肠杆菌SD序列和间隔序列的腈水合酶基因。PCR产物 采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收。
[0043] 大肠杆菌的SD序列（SEQ ID NO. 8所示）如下所示：
[0044] 5' -aaggag-3'
[0045] 间隔序列如下（SEQ ID NO. 9所示）所示：
[0046] 5' -atatacc-3'
[0047] Link-Up (含大肠杆菌的SD序列和间隔序列）和Link-Down (含大肠杆菌的SD序 列和间隔序列）如下所示：
[0048] Link-Up ：5? -cgtcaaggagatataccatgaacggcgtgcacgacatggg-3,
[0049] Link-Down ：5? -tcatggtatatctccttgacgtcatgacggcgctcccggc-3,
[0050] PCR反应体系和PCR反应条件：
[0051] 分段PCR扩增体系：
[0052] PrimcrSTAR DNA 聚介1?: 25 μ?； NH05-Up 或 Link-Up ( 10 pmol/μΙ) 2 0μ1； Link-Down 或 NH05-Down ( 10 pmol/μΙ) 2.0 μ?； 模板DNA (实施例1中PCR产物）2.0 μ?: 加双蒸水至 50 μ?。
[0053] 分段PCR扩增条件：
[0054] 1)预变性：95°C 2min ;
[0055] 2)变性：95°C IOs ;退火：58°C 15s ;延伸：72°C 15s ;共循环 30 次；
[0056] 3)延伸：72°C IOmin ;
[0057] 4)4。〇保存2.011。
[0058] 总PCR扩增体系：
[0059] PrimerSTAR DNA 聚介1? 25 μ?： NHOS-Up (lOpmol/μΙ) 2.0 μΙ； NH05-Down (lO pmol/μΙ ) 2.0 μ?；
[0060] 模板DNA (分段PCR产物）2.0 μ?; 加双蒸水至 50 μ?。
[0061] PCR扩增条件：
[0062] 1)预变性：95°C 2min ;
[0063] 2)变性：95°C IOs ;退火：58°C 15s ;延伸：72°C 15s ;共循环 35 次；
[0064] 3)延伸：72°C IOmin ;
[0065] 4)4。〇保存2.011。
[0066] 实施例3 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH05的构建和鉴定
[0067] 将质粒载体pET28a(+)和含有大肠杆菌SD序列和间隔序列的腈水合酶基因（实 施例2制备）经Nel I和Hid III双酶切，两者等量混合，用T4DNA连接酶16°C连接过 夜，得到重组质粒pET28a (+) -NH05 (示意图如图2所示）。然后，将重组质粒转化入感受 态E. coli BL21 (DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100 μ g/ml卡那霉素 (Kanamycin，Kan)的LB平板上，经37°C静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的 测定，从而验证重组质粒pET28a (+) -NH05及重组菌株的正确性。
[0068] 实施例4 :基因工程菌株E. coli pET28a⑴-NH05的腈水合酶表达与纯化
[0069] 将基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH05甘油保藏菌种接于5mL含100 μ g/ml Kan 的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养10?14h。取2mL培养液转接至IOOmL含50 μ g/ ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养至菌体密度（0D_)达到0.8左右 时，加入IPTG至终浓度为0· ImM，18?37°C下诱导12?18h。
[0070] 在5000?IOOOOXg条件下离心5?IOmin收集细胞，用磷酸缓冲液（50? 200mM，pH5. 0?8. 0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液。在冰浴中，采用超声破碎仪破碎细 胞，在5000?IOOOOXg条件下离心5?30min，分别收细胞破碎上清液和破碎沉淀，采用 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)进行检测，SDS-PAGE电泳图如图3所 示。以E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)空载质粒菌体破碎上清液和基因工程菌E.coli BL21 (DE3) /pET28a (+) -NH05未诱导菌体破碎上清液液为对照。
[0071] 细胞破碎上清液以0. 5?2. OmL/min的流速经过镍（Ni-)柱，再由磷酸缓冲液 (50?200mM，pH5. 0?8. 0,含250mM咪唑）进行洗脱，收集目标蛋白进行真空干燥，得到重 组腈水合酶NH05酶蛋白粉。纯化后的重组腈水合酶NH05的SDS-PAGE电泳图如图4所示。
[0072] 实施例5 :重组腈水合酶NH05的热稳定性
[0073] 将重组腈水合酶NH05溶液（实施例4制备的重组腈水合酶NH05酶蛋白粉用50? 200mM磷酸缓冲液（pH 4. 0?8. 0)配制成，蛋白浓度为0. 1?2mg/ml)分别于30和40°C 条件下保存不同的时间，采用HPLC法测定腈水合酶的残余活力，确定重组腈水合酶NH05的 热稳定性。计算酶稳定性中的活力衰减公式如：N(t) =Nc^xt，其中λ是衰减常数，由腈水 合酶活力对数In (Nt)为纵坐标，时间t为横坐标，线性回归后求得衰减常数λ。酶活力半 衰期（t1/2)计算公式：t 1/2= 1η2/ λ。重组腈水合酶ΝΗ05在30和40°C条件的半衰期分别 为 26h 和 10h。
[0074] 实施例6 :基因工程菌株Ε· coli pET28a(+)-NH05催化3-氰基吡啶生成烟酰胺
[0075] 取IOOrnl实施例4基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH05的诱导培养液，在5000? 10000 X g条件下离心5?30min收集菌体，湿菌体重量为I. 12g。然后用50ml磷酸缓冲液 (50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加 入终浓度0. 4mol/L缓冲液的3-氰基吡啶，25°C下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测 反应体系内的3-氰基吡啶和烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-氰基吡啶残留， 全部转化为烟酰胺，转化率为100%，烟酰胺的得率>99%。
[0076] HPLC检测条件为：高效液相色谱仪（Agilent 110，USA)，紫外（UV)检测器，检测波 长为210nm，色谱柱为Varian PURSHT C18反向色谱柱（4. 6_X 250mm) ; IOmM磷酸缓冲液 / 乙腈（90/10, ν/ν，ρΗ2· 8)为流动相；流速为 0· 5mL/min。
[0077] 实施例7考察反应过程中最适的3-氰基吡啶浓度
[0078] 将实施例6中3-氰基吡啶终浓度分别改为0· 2mol/L，0· 4mol/L，0· 6mol/L， 0. 8mol/L和I. 0m〇l/L，其他操作同实施例6。结果发现，当3-氰基吡啶浓度在0. 2? 0. 8mol/L范围内，体系中已无3-氰基吡啶残留，全部转化为烟酰胺，转化率为100%，烟酰 胺的得率> 99% ;当3-氰基吡啶浓度为l.Omol/L时，体系中底物的转化率仅为85.