大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白质表达大肠杆菌属主中辅酶代谢途径改造，以增加其内源性辅酶和用改造过的属主菌全细胞细菌进行生物转化的方法。
【背景技术】
[0002]非对称生物还原法制备手性天然，非天然氨基酸，手性氨和手性醇是一项非常有效的制备高旋光活性的手性分子的方法。早期的方法是用生物提取的酶，辅酶和辅酶再生系统实施该反应。因辅酶价格昂贵，改用膜技术进行反应，将辅酶和大分子的PEG偶联(Separat1ns Using Aqueous Phase Systen, 1989, p345_347),使得辅酶和生物转化的酶一样，可以被半透明膜截留，底物小分子通过膜进入反应体系，生成的产物从膜内的反应体系中出来，达到辅酶被反复利用，同时辅酶与PEG偶联后，自身的稳定性显著性增加，降低了辅酶使用的工业化成本。
[0003]生化提取的酶成本较高，近年来用全细胞细菌直接进行生物转化的方法得到青睐，可减少酶的工业化成本。用全细胞细菌进行转化，酶的来源成本较低，但通常需要添加辅酶，且辅酶不能被回收反复利用。国外已有在高浓度底物和不添加辅酶就可实现高效率转化的文献报道(Eng.Life Sc1.2004, N0.6, p573-576, Organic Process &Development 2006，10，666-669),但文献报道工作无法重复。为减少全细胞细菌在进行生物转化时辅酶的添加量或不添加辅酶，本专利采用的方法是对表达转化酶属主细菌的代谢途径进行改造，去掉细菌内与辅酶降解酶的基因，实现辅酶在属主细菌中富集，实现在转化过程中，可显著性减少辅酶的添加量，或不用添加辅酶，即可实现高效率转化。用改造过的属主菌表达亮氨酸脱氢酶和甲酸酶，用于新戊基酮酸生物转化制备L-新戊基甘氨酸过程中，避免了添加辅酶，并实现高效率转化。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于改善野生型蛋白表达属主菌表达转化酶后，用于非对称还原法制生物转化制备手性分子时，内源性辅酶辅酶不足的缺陷。提供一种大肠杆菌辅酶代谢途径改造方法，提高了转化酶系表达属主菌的内源性辅酶，使得用改造过的细菌进行酶表达后，用于生物转化时，可以显著性减少辅酶在转化体系中的添加量或不添加辅酶。
[0005]本发明的目的是这样实现的:
通过同源重组的方法去除了蛋白质表达属主菌大肠杆菌JM109(DE3)中与辅酶降解有关的基因yjaD yrfE，使得属主菌在繁殖时内源性辅酶浓度得以增加，用这种菌表达转化酶系，用于不对称还原法生物转化时，不用添加辅酶，或极显著减少辅酶的添加量，即可实现高效率转化。这个方法同样适合用于缺失其它蛋白质表达属主菌，如BL21(DE3)，DH5alpha等细菌内的辅酶代谢途径中的yjaD yrfE基因，这都在我们的保护范围。
[0006]在上述改造过的蛋白表达属主菌内，在表达生物转化的酶系后，用非对称还原氨法生物转化制备L-新戊基甘氨酸，在不添加辅酶的情况下，实现高效率生物转化，效率可达90%以上，EE值99%以上。在权利要求1中的菌种还可以用于表达其它酶系，用于非对称还原法生物转化制备其它的手性产物，可极显著性的减少辅酶添加量或不加辅酶，并实现高转化效率，如手性天然氨基酸，手性非天然氨基酸和将分子中的酮基还原成手性氨和手性醇，这包含在我们的专利保护范围内。
[0007]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明，用同源重组的方法对表达蛋白质的大肠杆菌属主菌JM109(DE3)的辅酶代谢途径进行改造，使得与辅酶降解相关的二个酶缺失(yjaD和yrfE基因产物)，获得的辅酶代谢缺陷型大肠杆菌内的辅酶在繁殖时，因降解酶的缺失而得以富集，使得内源性辅酶的浓度显著增加。用这样的属主菌，还可以表达其它非对称还原法生物转化的酶系，用于制备手性天然氨基酸，非天然氨基酸，酮基的非对称还原成手性氨和手性醇等分子，可以在显著性减少辅酶在转化体系中的添加量或不添加辅酶，实现高效率转化，有利于降低生物转化的工业化成本。
【具体实施方式】
[0008]实施例1:
我们用同源重组的方法将JM109 (DE3)中的yjaD和yrfE基因进行缺失。缺失方法，选取yjaD基因的编码区500bp的二边，上下游各Ikb序列，从基因组DNA上，用PCR方法扩增，得到片段，拼接，并亚克隆PCVD442载体上(在大肠杆菌DH5 a pir菌种中进行分子操作)，构建好的质粒转化到大肠杆菌JM109 (DE3)中，用氨苄抗性基因做正筛选，得到的克隆再用蔗糖进行负筛选，得到yjaD基因敲出的JM109(DE3) Δ yjaD,基因敲出的菌种用PCR方法进行验证。用上述同样的方法，在JM109(DE3) AyjaD菌种中，，去掉yrfE基因，得到JM109 (DE3) AyjaD yrfE。用LB培养基培养以上野生型和缺陷型的大肠杆菌，测定内源性辅酶的含量，缺陷型JM109 (DE3) Δ yjaD yrfE菌体中的辅酶含量是野生型JM109 (DE3)的6.5倍。
[0009]实施例2:用表达亮氨酸脱氢酶和甲酸酶JM109(DE3) Δ yjaD yrfE用于制备L-新戊基甘氨酸
将亮氨酸脱氢酶和甲酸酶基因通过二种不同拷贝数和抗性的表达载体，转入JM109 (DE3) AyjaD yrfE进行共表达，用新戊基酮酸作为底物，进行生物转化，在不添加辅酶的条件下，转化效率在90%以上。而作为对照试验，使用野生型菌表达以上二个酶，进行生物转化，效率只有15%，但添加辅酶后仍然可以实现100%的高效率转化。经过转化获得的L-新戊基甘氨酸，用阳离子交换树脂纯化，收率在85%，EE值达到99.6%。
【主权项】
1.一种大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法，其特征在于:通过同源重组的方法对辅酶代谢途径的改造，去掉了蛋白质表达属主菌大肠杆菌JM109(DE3)中和辅酶降解有关的基因yjaD yrfE，使得属主菌在繁殖时内源性辅酶的浓度增加。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法，其特征在于，在上述改造过的蛋白表达属主菌进行生物转化，可以在不用添加辅酶的情况下，用非对称还原氨法生物转化制备L-新戊基甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法，其特征在于，菌种还可以用于表达其它酶系，用于非对称还原法生物转化制备其它的手性产物。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法，其特征在于，其它手性产物为手性天然氨基酸，手性非天然氨基酸和将分子中的酮还原成手性氨和手性醇分子。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法，其特征在于，用同源重组的方法将JM109 (DE3)中的yjaD和yrfE基因进行缺失，得到JM109 (DE3) Δ yjaDyrfE，使得内源性辅酶得以富集。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法，其特征在于，用辅酶代谢途径被改造大肠杆菌属主菌表达酶亮氨酸脱氢酶和甲酸酶系进行生物转化，是将基因通过二种不同拷贝数和抗性的表达载体，共转入JM109(DE3) AyjaD yrfE进行表达，用新戊基酮酸作为底物，进行生物转化，获得的L-新戊基甘氨酸。
【专利摘要】本发明涉及一种大肠杆菌辅酶代谢途径改造和生物转化方法。通过同源重组的方法对辅酶代谢途径的改造，去掉了蛋白质表达属主菌大肠杆菌JM109(DE3)中和辅酶降解有关的基因yjaDyrfE，使得属主菌在繁殖时内源性辅酶的浓度增加。此方法改造的属主菌表达酶系用于非对称生物还原法进行生物转化制备手性分子，可以显著性减少辅酶在转化体系中的添加量或不添加辅酶。
【IPC分类】C12R1-19, C12N15-70, C12P13-04, C12N1-21
【公开号】CN104561070
【申请号】CN201310505596
【发明人】郁庆明
【申请人】郁庆明
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月24日