一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用，是在大肠杆菌中引入来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径得到的重组菌，在大肠杆菌经过遗传修饰引入了外源高活性的油脂代谢降解酶系，提高了大肠杆菌对油脂的利用率。应用本发明构建大肠杆菌发酵生产甲羟戊酸，具有转化过程温和，转化率高的优点，有效的降低了生产成本，该方法为生物合成甲羟戊酸和异戊二烯的工业化应用打下了坚实的基础。
【专利说明】一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用。
【背景技术】
[0002]甲羟戊酸途径在自然界中广泛存在，甲羟戊酸和其下游衍生物如异戊二烯和类异戊二烯化合物可以通过在工程菌中表达外源的甲羟戊酸途径的重组酶获得，如Tabata等利用工程大肠发酵生产甲轻戍酸(Tabata et al., 2004BiotechnologyLetters, 26:1487-1491),美国的Genencor公司利用工程大肠杆菌发酵生产异戍二烯(Whited et al., 2010Industrial Biotechnology, 6:152)，Piteta 等利用工程大肠杆菌合成类异戍二烯化合物(Piteta et al., 2007Metabolic Engineering, 9:193-207);尽管上述研究利用不同的宿主和不同的酶进行甲羟戊酸和下游衍生物类异戊二烯化合物的发酵，但是均有一个共同点，就是以糖为原料进行发酵。理论上来讲1.5分子的糖通过甲羟戊酸途径只能生成I分子的甲羟戊酸，因此理论质量转化率只有52%，并且至甲羟戊酸下游途径产物如类异戊二烯化合物的发酵得率更低。由于采用糖为原料通过工程菌发酵生产类异戊二烯化合物的产率较低，限制了其商业化应用。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种高效代谢油脂的大肠杆菌，是在大肠杆菌中引入来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径得到的重组菌。
[0004]所述来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径是真氧产碱杆菌Ralstonia eutrophaH16基因组(NCBI登陆号:NC_008313.1)内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因(NCBI 中 NC_008313.1 基因组 Locus tag 编号:H16_A0460, H16_A0461, H16_A0462, H16_A0463, H16_A0464)o
[0005]优选将上述真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因导入敲除了 FadR基因的大肠杆菌。
[0006]所述大肠杆菌为任意已知大肠杆菌，优选标准菌株BL21 (DE3)或者JM109 (DE3)。
[0007]本发明还提供了一种高效 代谢油脂的大肠杆菌的构建方法，是在大肠杆菌中引入来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途。
[0008]更进一步，所述大肠杆菌为敲除了 FadR基因的大肠杆菌，优选敲除了 FadR基因的BL21 (DE3)或者 JM109 (DE3)。
[0009]具体而言，所述高效代谢油脂的大肠杆菌的构建方法如下:
[0010]I) FadR基因的敲除，根据已有的大肠杆菌标准菌株JM109 (DE3)基因组信息，找到FadR基因上下游各500个碱基的基因序列合并为I千个碱基的序列，并且在5’端和3’端分别加入15bp和质粒pRE112多克隆位点两端相同的同源臂；根据序列信息化学合成线性DNA片段如SEQ ID N0.1所示；将通用自杀质粒pRE112和合成的线性DNA片段重组为新质粒pjzi，将pJZl通过热激转化法转入大肠杆菌X7213，通过细菌转导的方式将PJZl通过大肠杆菌X7213导入JM109 (DE3)进行FadR基因敲除；
[0011] 2)工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真养产碱杆菌Ralstoniaeutropha H16的基因组(NCBI登陆号:NC_008313.1)，根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组信息，设计引物从真养产喊杆菌Ralstonia eutropha H16的基因组扩增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列；将重组基因簇片段和通用表达质粒pBBRlMCS-2的部分序列，重组为新表达载体pBBR_H16HZl，序列如SEQ ID N0.2所示；
[0012]3)将表达载体pBBR-H16HZl转入步骤I)构建的重组大肠杆菌得到大肠杆菌ZMl。
[0013]上述大肠杆菌可高效代谢油脂。
[0014]本发明还提供了一种发酵生产甲羟戊酸的方法，具体步骤如下:
[0015]I)从大肠杆菌标准菌株BL21 (DE3)或者JM109 (DE3)出发，敲除其基因组上的FadR基因；
[0016]2)将真氧产喊杆菌Ralstonia eutropha H16基因组内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因导入大肠杆菌进行表达；
[0017]3)将合成甲羟戊酸的酶基因导入步骤2)得到的大肠杆菌；
[0018]4)利用步骤3)得到的大肠杆菌以植物油或脂肪酸为碳源发酵生产甲羟戊。
[0019]更进一步，本发明构建的大肠杆菌能够高效的转化油脂类底物生成甲羟戊酸，更进一步的用于发酵生产异戊二烯，该转化过程在温和的条件下(30-37 0C )进行，且碳源至甲羟戊酸和下游衍生物异戊二烯的转化率较高，有效的降低了生产成本，该方法为生物合成甲羟戊酸和异戊二烯的工业化应用打下了坚实的基础。
【具体实施方式】
[0020]实施例1:针对大肠杆菌标准菌株JM109 (DE3)基因组的遗传修饰，即FadR基因的敲除和表达来自真养产碱杆菌H16基因组内编号为H16_A1526至H16_A1531基因的基因簇。
[0021]FadR基因的敲除。大肠杆菌标准菌株JM109 (DE3)被用作基本菌株来进一步进行遗传修饰。根据已有的大肠杆菌标准菌株JM109 (DE3)基因组信息，找到FadR基因上下游各500个碱基的基因序列合并为I千个碱基的序列，并且在5’端和3’端分别加入15bp和质粒PRE112多克隆位点两端相同的同源臂；根据序列信息化学合成约I千碱基的线性DNA片段(SEQ ID N0.1)。利用In-Fusion HD试剂盒(Takara，货号639648)将通用自杀质粒PRE112 (Addgene公司)和合成的线性DNA片段重组为新质粒pJZl，将pJZl通过传统的热激转化法转入大肠杆菌X7213(来自德国微生物菌种保藏中心)。而后通过细菌转导的方式将PJZl通过大肠杆菌X7213导入JM109 (DE3)进行FadR基因敲除，该操作步骤和使用自杀质粒进行基因敲除的标准方法一致(Edwards et al.，1998Gene, 207:149)。
[0022]工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇。敲除FadR基因的JM109(DE3)被用作出发菌株来进一步进行遗传修饰。提取真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的基因组(NCBI登陆号:NC_008313.1 )，根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组信息，设计引物(上游引物CAGGAAACAGCTATGTCCAATTTCATCGTCAAGAAGG ;下游引物AAATATTAACGCTTACTCGAACTTCGTAAAATCCGGC)从真养产碱杆菌 Ralstonia eutropha H16 的基因组扩增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段(总长度5551bp)，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列。然后利用In-Fusion HD试剂盒(Takara，货号639648)重组基因簇片段和通用表达质粒pBBRlMCS-2 (荷兰菌种保藏中心，编号NCCB3434)的部分序列(不含IacZ基因的序列)，重组为新表达载体pBBR_H16HZl(SEQ ID N0.2)。
[0023]将表达载体pBBR-H16HZl通过传统的热激转化法转入敲除FadR基因的JM109(DE3)来构建能够高效代谢油脂的工程大肠杆菌ZMl。
[0024]细胞生长实验证明遗传修饰的工程大肠杆菌ZMl具备比出发菌株JM109 (DE3)更强的油脂代谢能力:将ZMl和JM109 (DE3)分别挑取单克隆接入IOml摇管进行菌种细胞生长实验，发酵温度32°C，pH值控制在7.0，培养基组分见表1 (ZMl的培养基不加氯霉素，JM109 (DE3)的培养基不加氯霉素和卡那霉素)，以花生油为唯一碳源进行菌体生长，摇管放入微生物培养箱，220转培养12小时后，ZMl的菌体密度0D_达到0.6，对照菌的菌体密度0D_只有0.1，证明以油脂为唯一碳源时，ZMl的生长显著强于对照菌JM109 (DE3)，拥有更闻的油脂代谢能力。
[0025]实施例2:构建产甲羟戊酸的工程大肠杆菌和产异戊二烯的工程大肠杆菌。
[0026]根据已经公布的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)轻甲基戍二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息(Tabata etal., 2004Biotechnology Letters, 26:1487-1491),和我实验室在前期研究中已公布的质粒构建方法(Yang et al., 2012PL0S ONE, 7: e33509)，构建表达质粒pACY-mva。将表达载体pACY-mva通过传统的热激转化法转入重组有H16_A1526至H16_A1531基因的大肠杆菌ZMl来构建利用油脂底物产甲 羟戊酸的工程大肠杆菌ZM2。
[0027]实施例3:利用构建的工程大肠杆菌以植物油或中长链脂肪酸(碳链长度CS至C18)为碳源发酵生产甲羟戊酸。
[0028]使用工程菌株ZM2以植物油(花生油或橄榄油)为碳源发酵生产甲羟戊酸。使用该菌株发酵甲羟戊酸的条件为:使用该菌株发酵甲羟戊酸的条件为:在500毫升摇瓶体系中使用100毫升装液量，接种量5%，发酵温度32°C，pH值控制在7.0，培养基组分见表1，初始植物油添加量为2克/升，搅拌速度为300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，发酵60小时后，以不同植物油为碳源发酵甲羟戊酸的产量见表2。
[0029]使用工程菌株ZM2以脂肪酸(月桂酸，肉豆蘧酸，棕榈酸)为碳源发酵生产甲羟戊酸。使用该菌株发酵甲羟戊酸的条件为:在500毫升摇瓶体系中使用100毫升装液量，接种量5%，发酵温度32°C，pH值控制在7.0，培养基组分见表1，初始脂肪酸添加量为2克/升，搅拌速度为300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，发酵60小时后，以不同植物油为碳源发酵甲羟戊酸的产量见表2。
[0030]表1工程大肠杆菌ZM2发酵甲羟戊酸培养基组分表
[0031]
【权利要求】
1.一种高效代谢油脂的大肠杆菌，是在大肠杆菌中引入来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径得到的重组菌。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，所述来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径是真氧产喊杆菌Ralstonia eutropha H16基因组内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于，将上述真氧产碱杆菌Ralstoniaeutropha H16基因组内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因导入敲除了 FadR基因的大肠杆菌。
4.如权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)或JM109(DE3)。
5.权利要求1所述大肠杆菌的构建方法，是在大肠杆菌中引入来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径，所述大肠杆菌为敲除了 FadR基因的大肠杆菌。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述高效代谢油脂的大肠杆菌的构建方法如下: I )FadR基因的敲除，根据已有的大肠杆菌标准菌株JM109(DE3)基因组信息，找到FadR基因上下游各500个碱基的基因序列合并为I千个碱基的序列，并且在5’端和3’端分别加入15bp和质粒pRE112多克隆位点两端相同的同源臂；根据序列信息化学合成线性DNA片段如SEQ ID N0.1所示；将通用自杀质粒pRE112和合成的线性DNA片段重组为新质粒pJZl，将pJZl通过热激转化法转入大肠杆菌X7213，通过细菌转导的方式将pJZl通过大肠杆菌X7213导入JM109 (DE3)进行FadR基因敲除；· 2)工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真养产碱杆菌Ralstoniaeutropha H16的基因组,根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组信息，设计引物从真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的基因组扩增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBRlMCS_2相同的同源臂序列；将重组基因簇片段和通用表达质粒PBBR1MCS-2的部分序列，重组为新表达载体pBBR-H16HZl，序列如SEQ ID N0.2所示； 3)将表达载体PBBR-H16HZ1转入步骤I)构建的重组大肠杆菌得到大肠杆菌ZMl。
7.一种发酵生产生物基化学品的方法，其特征在于，将与合成生物基化学品的外源基因导入权利要求1所述的大肠杆菌，利用重组菌利用油脂发酵生产生物基化学品。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述生物基化学品为甲羟戊酸，具体步骤如下: O从大肠杆菌标准菌株BL21 (DE3)或者JM109 (DE3)出发，敲除其基因组上的FadR基因; 2)将真氧产喊杆菌Ralstoniaeutropha H16基因组内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因导入大肠杆菌进行表达； 3)将合成甲羟戊酸的酶基因导入步骤2)得到的大肠杆菌； 4)步骤3)得到的大肠杆菌利用油脂发酵生产甲羟戊酸。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，具体步骤如下: I )FadR基因的敲除，根据已有的大肠杆菌标准菌株JM109(DE3)基因组信息，找到FadR基因上下游各500个碱基的基因序列合并为I千个碱基的序列，并且在5’端和3’端分别加入15bp和质粒pRE112多克隆位点两端相同的同源臂；根据序列信息化学合成线性DNA片段如SEQ ID N0.1所示；将通用自杀质粒pRE112和合成的线性DNA片段重组为新质粒pJZl，将pJZl通过热激转化法转入大肠杆菌X7213，通过细菌转导的方式将pJZl通过大肠杆菌X7213导入JM109 (DE3)进行FadR基因敲除； 2)工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真养产碱杆菌Ralstoniaeutropha H16的基因组,根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组信息，设计引物从真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的基因组扩增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBRlMCS_2相同的同源臂序列；将重组基因簇片段和通用表达质粒PBBR1MCS-2的部分序列，重组为新表达载体pBBR-H16HZl，序列如SEQ ID N0.2所示； 3)将表达载体PBBR-H16HZ1转入步骤I)构建的重组大肠杆菌得到大肠杆菌ZMl，将表达载体pACY-mva导入ZMl得到大肠杆菌ZM2 ； 4)大肠杆菌ZM2利用油脂发酵生产甲羟戊酸。
10.如权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述油脂为:花生油、橄榄油、月桂酸、肉豆蘧酸和棕榈酸中任一一 种。
【文档编号】C12R1/19GK103571787SQ201310475345
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】咸漠, 邹慧斌, 刘辉, 孙超 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所