C-F带有EcoR I酶切位点（下划线序列），引物BNC-R带有BamH I酶 切位点（下划线序列）。
[0042] PCR扩增条件：95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、57°C退火1分钟、72°C延伸3 分钟，30个循环；72°C 10分钟，4°C保存。
[0043] 2)、回收步骤1)的PCR扩增产物并插入载体Simple pMD-18T (购自于宝生物工程 (大连）有限公司），得到载体pMDBNC。
[0044] 3)、以步骤2)的重组载体pMDBNC为模板，用BfC-F和BfC-R组成的引物对进行 PCR扩增（将ilvBNC串联基因片段中的ilvN进行定点突变，将定点突变后的基因命名为 ilvBN#C基因），得到PCR扩增产物（模板与突变后的环状质粒的混合物）。
[0045] 4)、将步骤3)的PCR扩增产物用DPN I酶处理1小时（去除模板），并转化感受态 细胞JM109,得到重组载体pMDBNt (结构示意图见图1)。
[0046] 根据测序结果，重组载体pMDBNt为将序列表的序列1自5'末端第1至3700位 核苷酸所示的ilvBN #C基因插入载体pMD-18T中得到的重组载体，ilvBN#C基因与野生型 ilvBNC基因的差异仅在于第2381位的核苷酸由G突变为了 A。
[0047] BN*C-F: 5 ' -CGAACTGATCCAATCCG § ACAGATTGCACTCAAC-3 ' ；
[0048] BN*C-R:5，-CGGATTGGATCAGTTCGCGGATTCCGAATGGT-3 '
[0049] 2、重组载体pZ8-lBNKC的构建
[0050] 1)、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pMDBN*C载体，回收约3750bp的基 因片段；
[0051] 2)、用限制性内切酶 BamH I 和 EcoR I 双酶切载体 pZ8_l (Expression of the Corynebacterium glutamicum panD Gene Encoding L-Aspartate-a-DecarboxyIase Leads to Pantothenate Overproduction in Escherichia coli， APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, VoL 65, No. 4 ;1530 - 1539,1999.见图 2 ;公众可从福建师 范大学和福建省麦丹生物集团有限公司获得），回收约7000bp的载体骨架；
[0052] 3)、将步骤1)的基因片段和步骤2)的载体骨架片段连接，得到重组质粒 pZ8-lBN*C。
[0053] 经过测序，重组质粒pZ8-lBN#C为将序列表的序列1自5'末端第1至3700位核 苷酸所示的ilvBN #C基因（编码乙酰羟酸合成酶突变体和乙酰羟酸同分异构酶）插入载体 PZ8-1的BamH I和EcoR I双酶切位点间得到的载体，其结果示意图如图3所示。
[0054] 其中序列1自5'末端第21-2382位核苷酸为乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分 子ilvBN%序列1自5'末端第2614-3630位核苷酸乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子 ilvC〇
[0055] 二、ilvE基因和ilvD基因的扩增及融合
[0056] UilvD基因的扩增及纯化
[0057] 1)、根据已公布在NCBI的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组信息及基因功能注释， 设计引物ilvD-F、ilvD-R，以黄色短杆菌20160基因组为模板，PCR扩增ilvD基因，及其自 身携带启动及终止序列，得到完整基因片段扩增产物一一ilvD基因片段。
[0058] ilvD-F:5' -TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT GTACTTGGAGCGCCAAAAGGCACT-3' ；
[0059] i I vD-R: 5 ' -AGATCT GAGTCGAGGCAGAGTTCGCTGGTT-3 '。
[0060] 其中上游引物ilvD-F带有20bp的用于重叠延伸的融合碱基序列，酶切位点（下 划线序列），下游引物ilvD-R带有Bgl II酶切位点（下划线序列）
[0061] PCR扩增条件：95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、59°C退火1分钟、72°C延伸3 分，30个循环；72°C 10分钟，4°C保存。
[0062] 2)、采用PCR产物凝胶回收试剂盒（购自于上海生工）将步骤1的PCR扩增产物 进行回收和纯化，得到纯化的ilvD基因片段，经过测序，其核苷酸序列为序列表中序列2。
[0063] 2、ilvE基因的扩增及纯化
[0064] 1)、根据已公布在NCBI的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组信息及基因功能注释， 设计引物ilvE-F、ilvE-R，以黄色短杆菌20160基因组为模板，PCR扩增ilvE基因，及其自 身携带的SD序列，得到扩增产物一一ilvE基因片段。
[0065] ilvE-F:5'_
[0066] AGATCT GAAAGGAGATATACCGTGTATCTGTCAGGTAGCAGGTGT-3' ；
[0067] ilvE-R:5' -
[0068] AACTACAGACCTAGAACCTA TTAGCCAACCAGTGGGTAAAGCCAT-3'。
[0069] 其中上游引物ilvE-F带有Bgl II酶切位点，酶切位点（下划线序列），下游引物 iIvE-R带有20bp的用于重叠延伸融合的碱基序列（下划线序列）
[0070] PCR扩增条件：95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、55°C退火1分钟、72°C延伸1 分30秒，30个循环；72°C 10分钟，4°C保存。
[0071] 2)、采用PCR产物凝胶回收试剂盒（购自于上海生工）将步骤1的PCR扩增产物 进行回收和纯化，得到纯化的ilvE基因片段，经过测序，其核苷酸序列为序列表中序列3。
[0072] 3、ilvE基因和ilvD基因的融合
[0073] 1)、以上述获得的纯化的ilvE基因片段和ilvD基因片段互为模板和引物，进行 PCR，进行十个PCR循环，PCR扩增条件：95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、55°C退火1分 钟、72 °C延伸2分30秒，10个循环，72 °C保存。
[0074] 2)、上述反应进行了 10个循环之后，再加入引物ilvE-F和引物ilvD-R继续进行 PCR反应二十五循环，PCR扩增条件：95°C预变性5分钟；94°C变性40秒、55°C退火1分钟、 72 °C延伸4分30秒，25个循环，72 °C延伸IOmin，4°C保存。
[0075] 3)、采用PCR产物凝胶回收试剂盒（购自于上海生工）将步骤2的PCR扩增产物 进行割胶回收和纯化，割取大小约为4400bp的目的条带，得到纯化的ilvED片段，经测序， 其核苷酸序列为序列表中序列4。
[0076] 4)、将上述纯化的ilvED片段插入载体Simple pMD_18T(购自于宝生物工程（大 连）有限公司），得到载体PMDilvED (结构示意图见图4)。
[0077] 三、外源表达载体pZ8_lBN*CED的构建
[0078] 将上述二制备的重组载体pMDiIvED进行Bgl II酶切，并采用去磷酸化酶（购自于 宝生物工程（大连）有限公司）进行末端去磷化，并采用电泳割胶纯化回收约为4400bp融 合的ilvED基因的酶切片段。
[0079] 另外，将pZS-ΙΒΝ?载体进行BamH I酶切，并采用去磷酸化酶（购自于宝生物工 程（大连）有限公司）进行末端去磷化，并采用电泳割胶纯化回收约为IlOOObp的线性载 体基因片段。
[0080] 将上述纯化回收的ilvED和线性的ΡΖ8-1ΒΝ?基因片段采用T4连接酶（购自于 宝生物工程（大连）有限公司），16°C连接反应过夜，并转化感受态的JM109细胞，采用质粒 提取试剂盒（购自于上海生工）进行重组质粒抽提和验证（BamH I酶切，得到4400bp片段 为阳性），确认重组质粒pZ8-lBN#CED构建成功，外源表达载体pZ8-lBN #CED结构示意图见 图5。
[0081] 经过测序，重组载体pZ8-lBN#CED为将序列表的序列4所示的ilvED插入上述一 制备的载体ΡΖ8-1ΒΝ?的BamH I酶切位点间得到的载体。
[0082] 其中序列4自5'末端第16-1155位核苷酸为支链氨基酸转氨酶编码DNA分子 ilvE，序列4自5'末端第1464-3302位核苷酸为二羟酸脱水酶编码DNA分子ilvD。
[0083] 四、高产L-缬氨酸工程菌MDV-07的构建
[0084] 将外源表达载体PZ8-1BN#CED电击转化黄色短杆菌CICC 20160(购自于中国工业 微生物菌种保藏管理中心，目录编号20160)，采用含卡那霉素抗性（终浓度30-50 μ g/mL) 平板进行筛选