一种改造后的荧光素酶基因、含该基因的重组载体、工程菌及其构建方法和发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种改造后的荧光素酶基因，具体涉及含该基因的重组载体、该载体的构建方法、含有该载体的工程菌以及该工程菌生产荧光素酶的方法。
【背景技术】
[0002]荧光素酶(firefly luciferase, LUC)是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。萤火虫荧光素酶是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂。早在1884年，Dubois发现将萤火虫研磨后荧光很快会消失，添加萤火虫尾部的新鲜提取物后又能重现荧光。此后，他证实提取物中存在荧光素和荧光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的条件下，虫光素酶可催化荧光素氧化并发出便于灵敏检测的荧光。化学反应如下:
[0003]荧光素+ΑΤΡ+02 =氧化荧光素+AMP+PPi+CO 2+光
[0004]在有过量酶和过量底物存在的条件下，发光强度与反应中存在的ATP量成正比。这种发光特性使得萤火虫荧光素酶在各种测定ATP的研究和生产中广泛使用，目前，萤火虫荧光素酶已被用作生物传感器，开发成ATP快速检测试剂盒，用于快速检测血液、奶粉、食品生产线、医疗环境等样本中污染的细菌细胞。目前市场上所售的荧光素酶多从萤火虫尾部提取，易受到地域和季节的限制，且繁殖周期长，养殖成本高，后处理还要经过离心分离，柱层析纯化等多个化学提取步骤，才能得到最终结晶制剂。利用基因工程菌发酵生产荧光素酶具有周期短、不受季节、地域影响、成本低、过程易于规范控制等诸多优点，受到了人们的广泛关注。早在1985年，JefTery等人首次克隆了萤火虫荧光素酶基因，并构建了含虫光素酶基因的重组载体pkwlOl，在E.coli中成功实现表达，获得了具有活性的荧光素酶。1993年，Lu等人构建了一株可高效分泌荧光素酶的大肠杆菌，从而使得基因工程菌规模化生产荧光素酶成为可能。目前，Promega, Sigma以及沈阳中科靓马公司已相继推出来自于大肠杆菌基因工程菌的荧光素酶。但与来自于萤火虫的荧光素酶相比，利用基因工程的方法生产的荧光素酶存在蛋白含量低，热稳定性较差等缺陷，严重制约了荧光素酶的应用。本发明利用基因工程的方法对萤火虫荧光素酶进行改造，构建新的荧光素酶基因工程菌，实验结果表明，本发明所构建的基因工程菌有效克服了目前基因工程方法生产荧光素酶的稳定性差，表达量低的缺陷。
【发明内容】
[0005]为了克服目前萤火虫荧光素酶生产受到地域和季节的限制，以及繁殖周期长、养殖成本高等缺点，本发明的首要目的在于提供一种含萤火虫荧光素酶基因的基因工程菌的构建方法，利用该工程菌能高产量地获得稳定性高的萤火虫荧光素酶。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现
[0007]1.本发明提供一种改造后的荧光素酶基因，该荧光素酶基因fl核苷酸序列由萤火虫荧光素酶核苷酸序列改造而成，其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]2.本发明还提供含有上述I提供的重组表达载体。
[0009]3.上述2提供的重组表达载体，该重载载体是pET22b_fl，在原始载体pET22b的NdeI和XhoI位点间插入改造后的荧光素酶基因fl。
[0010]4.上述2提供的重组表达载体，该重组载体是pET22b-fl-linker-aox，通过linker连接米根霉aox基因片段fl-linker_aox导入原始载体pET22b中获得重组载体，fl-linker-aox 序列如 SEQ ID N0.2 所不。
[0011]5.上述4提供的重组载体pET22b-fl-linker_aox的构建方法，包括如下步骤:
[0012](I)以荧光素酶基因fl为模板，设计引物I和引物2，通过PCR的方法获得一端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物；
[0013](2)以米根霉aox基因为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法，获得一端连有linker的米根霉aox基因的PCR产物；
[0014](3)将步骤⑴、⑵获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得fl-linker-aox,胶回收 PCR 产物，连接 PMD19-T Vector,得到重组载体 T_fl-linker-aox。
[0015]6.上述5所述的构建方法，其中，
[0016]步骤(I)所述引物I 序列为 GGAATTCCATATGATGGAAGACGCC,
[0017]引物2 的序列 TTACAAITTGGACTTGGCGGTGGCG
[0018]步骤(2)所述引物3序列为GGCGGTGGCG ATGCCGTACGACATG，引物4序列CCGCTCGAGTTATGCTGTCGATGGG
[0019]7.本发明还提供一种产荧光素酶的工程菌，该工程菌由上述2-4任一项所述载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得。
[0020]8.本发明还提供一种高稳定生产荧光素酶的方法，该方法包括如下步骤:(I)将重组表达载体pET22b-fl-linker-aox转入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得产荧光素酶工程菌El ；
[0021](2)将工程菌El转接于加有luL/ML的AMP的新鲜液体LB培养基，200rmp/min、37°C进行摇瓶培养，培养时间为12-14小时，获得种子液；
[0022](3)将步骤(2)获得的种子液以体积比3-5%的量接于NBS发酵罐，37°C发酵培养，通过关联通气量及转速控制溶氧在20% -40%，当葡萄糖消耗完后流加新鲜料液，发酵培养产荧光素酶工程菌El获得荧光素酶。
[0023]9.上述8提供的高稳定生产荧光素酶的方法，其中，步骤(3)进行发酵培养的培养基为:大豆蛋白胨10?12g/L，葡萄糖10?20g/L,Na2HPO4 4?6g/L,K2HPO4 I?3g/L，NH4Cl 0.5 ?lg/L，NaCl 0.1 ?0.5g/L，MgSO4.7H20 0.1 ?0.5g/L。
[0024]有益效果:
[0025]1.本发明利用大肠杆菌的偏爱密码子，对萤火虫荧光素酶进行了密码子优化，利于该荧光素酶基因能在后期大肠杆菌工程菌中顺利高效表达。
[0026]2.本发明获得的pET22b-fl-linker-aoX，由于萤火虫荧光素酶基因处于高效启动子PT7及乳糖操纵子IacOperator的控制之下，在IPTG存在时，本发明的萤火虫荧光素酶能被高效诱导转录，并且转录得到的mRNA含有核糖体结合位点RBS。
[0027]3.本发明在重组表达载体pET22b_fl基础上通过linker连接引入来源于丝状真菌米根霉的aox基因，从而在大肠杆菌体内引入了一条有别于标准呼吸链的交替氧化途径，能够有效减少氧胁迫的作用，降低体系ROS水平，解除对细胞的毒害，促进了细胞的表达，从而提尚酶的广量和稳定性。
[0028]总之，利用该工程菌发酵生产荧光素酶的方法，与现有的生产方法相比本方法具有酶的表达量高，稳定性强等优点，是一种高效的生产荧光素酶的方法，适于工业生产应用。
【附图说明】
[0029]图1 f l-linker-aox 构建过程；
[0030]图2 pET22b-f 1-1 inker-aox 构建过程；
[0031]图3 pET22b_f 1-1 inker-aox 重组载体电泳图；
[0032]M 表不 Marker, 1、2、3、4、5、6 表不 pET22b-f 1-1 inker-aox 重组载体
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
[0034]实施例1:
[0035]1、萤火虫荧光素酶基因的获得
[0036]根据北美萤火虫荧光素酶的基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，对其进行密码子优化，以适应大肠杆菌的表达体系，人工直接合成该基因(金斯瑞生物公司)，命名为荧光素酶基因fl。将该基因与PMD-19T(TAKARA)连接，反应条件如下:总体积5uL，PMD19-T载体luL，DNA luL，ddH203uL，16°C，反应30min以上，测序(金斯瑞生物公司)。测序结果表明获得的荧光素酶基因fl核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，重组后的载体含有荧光素酶基因fl，命名为T-fl。
[0037]2、萤火虫荧光素酶基因重组载体pET22b_f 1-1 inker-aox
[0038](I)以荧光素酶基因fl的基因组DNA为模板，设计引物I和引物2，通过PCR的方法获得一端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物fl_linker ；
[0039]PCR 体系为:2 X Taq Plus master mix (Taq 酶预混合溶液)12.5uL，模板 DNA2uL，引物I luL，引物2 luL，ddH20 8.5uL。PCR反应进程为:I)95°C预变性5min ;2)94°C预变性30s ;3)55°C退火30s ;4)72°C延伸1.5min ;步骤2)-4)重复29个循环；5)72°C继续延伸7min，冷却至4°C。胶回收PCR产物。
[0040](2)以aox的基因组DNA为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法(退火时间按1000bp/min设计，其余同上)，获得一端连有linker的米根霉aox基因的PCR产物Iinker-aox ；
[0041]以下为上述1-4所述引物序列，直线部分为linker，波浪线部分为酶切位点:
[0042]引物1:上游引物 GGAATTCCATATGATGGAAGACGCC
[0043]引物2:下游引物 TTACAAITTGGACTTGGCGGTG