长链非编码rna afap1-as1的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1在制备干 扰载体、抑瘤试剂上的应用方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序 列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中 IncRNA序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA 不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动 不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿 与热点。
[0003] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱t耳（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，揭示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。
[0004] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研 究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽 癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用IncRNA芯片，构建了鼻咽 癌活检组织及正常对照样品中IncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的 IncRNAs，经扩大样本实时焚光定量PCR验证，证实IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达水平与鼻咽癌的淋巴 结转移及临床分期密切相关，针对该IncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的辅助诊断。随 后，我们进一步增加样本，在112例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位 杂交（in situ hybridization)的方法检测了 AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表 达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表达低的患者，因此针对该IncRNA 的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。
[0005] 我们通过设计并合成革巴向AFAP1-AS1的短发夹RNA (short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和 裸鼠转移瘤体内模型中均证实靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭 与转移能力。将AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳 米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸 酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1在制备干扰载体、抑瘤试剂上的 应用。本发明所述的用于在肿瘤细胞中抑制AFAP1-AS1表达的制剂由靶向AFAP1-AS1的 RNA干扰载体与多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒两个部分组成。利用AFAP1-AS1序列得到的 干扰载体可以抑制AFAP1-AS1的表达，并可制备抑制鼻咽癌细胞侵袭转移的制剂。
[0007] 长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，根据该长链非编码RNA基因制备了用于 干扰其表达，并抑制鼻咽癌细胞侵袭转移的制剂；该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如 SEQ NO: 1 所示。
[0008] 上述应用中所述的制剂是针对该长链非编码RNA基因设计的用于RNA干扰的短发 夹RNA表达载体。还可以将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒上制成纳 米球。
[0009] 所述的制备用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体所需的3条干扰靶点序列如下：
[0010] ShRNA-I ：GCAATTCACTGAGTGGTTACG
[0011] shRNA-2 ：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT
[0012] shRNA-3 ：GCAAGACATCCGATGGTATAC〇
[0013] 针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反 向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体 序列如下：
[0014] shRNA-Ι ：
[0015] 5' -GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA_3，
[0016] 3' -GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5，
[0017] shRNA-2 ：
[0018] 5' -GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA_3，
[0019] 3' -GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5，
[0020] shRNA-3 ：
[0021] 5' -GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA_3，
[0022] 3' -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5'。
[0023] 所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：
[0024] I) shRNA 的设计
[0025] 首先根据长链非编码RNA基因 AFAP1-AS1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：
[0026] shRNA-1 ：GCAATTCACTGAGTGGTTACG
[0027] shRNA-2 ：GCTTACTCTCTTGGTGATTCT
[0028] shRNA-3 ：GCAAGACATCCGATGGTATAC
[0029] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其 序列如下：
[0030] Scramble ：GACACGCGACTTGTACCAC
[0031] 2)针对这3条革巴点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体， 设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带 限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列 及它们配对退回后形成的DNA双链如下：
[0032] shRNA-Ι ：
[0033] 5' -GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA_3，
[0034] 3' -GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5，
[0035] shRNA-2 ：
[0036] 5' -GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA_3，
[0037] 3' -GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5，
[0038] shRNA-3 ：
[0039] 5' -GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA_3，
[0040] 3' -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5，
[0041] Scramble
[0042] 5'-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3'
[0043] 3'-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5'
[0044] 3) shRNA 载体构建
[0045] 化学合成上述3个shRNA和对照的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用 oligo annealing buffer溶解成20 μ M，互补单链各取10 μ 1混合；然后将oligo混合物在 PCR仪中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段；
[0046] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. Ikb的载体片段，将退火后的 粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4连接酶，16°C连 接过夜；转化E. coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I 酶切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插 入了目的片段的阳性克隆，将得到的包含AFAP1-AS1干扰序列的pcSUPER质粒转化感受态 大肠杆菌，以扩增质粒。
[0047] 上述多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用0P-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技 术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表 面修饰，制备得到。
[0048] 制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的具体过程：
[0049] 1)将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚 合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集