沉淀于80°C干燥，研 细得粒径范围10_50nm的硅纳米颗粒；其中H 2O与0P-10及H2O与正硅酸异酯的摩尔比为 2~10、氨水浓度为1. 6~28%、正娃酸异酯在环己烧中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L ;
[0050] 2)将娃纳米颗粒按0. 1~10mg/ml重悬于0. 6M NaCO；^·#液中，超声分散，离心，弃 上清，再将沉淀物按〇. 1~l〇mg/ml重悬于pH 7. 4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终 浓度为4~15nmol/mL，充分混勾，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0. 1~10mg/ml重悬于 双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。
[0051] 将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10~50ug 长链非编码RNA AFAP1-AS1的干扰载体，混合，室温静置使其结合，就得到了抑制鼻咽癌细 胞侵袭转移的制剂。
[0052] 本发明构建了抑制AFAP1-AS1表达的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体 外培养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实抑制AFAP1-AS1的表达可明显抑制鼻咽癌细 胞的侵袭转移能力。将AFAP1-AS1干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成 纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1干扰载体免受核酸酶降 解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
【附图说明】
[0053] 图1为实时荧光定量PCR技术验证IncRNA AFAP1-AS1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮 中的表达情况；
[0054] AFAP1-AS1在鼻咽癌（NPC)中的表达比正常鼻咽上皮（Normal)中显著提高，且与 淋巴结转移（左）及临床分期（右）密切相关，AFAP1-AS1的表达在有淋巴结转移的鼻咽 癌组织（NPC_Nl/2)中比没有淋巴结转移（NPC_N0)的更高（左图），AFAP1-AS1的表达也随 鼻咽癌患者临床分期逐渐增高（右图，I、II、III分别代表临床I、II、III期）。
[0055] 图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0056] 正常鼻咽上皮（NPE)中表达水平较低（仅在2例正常鼻咽上皮组织中检测到有低 表达，其余8例中检测不到表达），而在69. 64%的鼻咽癌（112例鼻咽癌组织中的78例） 中检测到有AFAP1-AS1的表达，其中55例为低表达（NPC_Low)，23例为高表达（NPC_High)， 其余的34例鼻咽癌组织中未检测到AFAP1-AS1的表达（NPC_negative) ;P〈0. 001。
[0057] 图3为鼻咽癌中AFAP1-AS1的表达与鼻咽癌患者预后的关系
[0058] 鼻咽癌中AFAP1-AS1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即AFAP1-AS1高 表达的患者总的生存时间（Over-all survival，左）和无复发生存时间（Relapse-free sruvival，右）要明显低于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者。
[0059] 图4为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体，可显著抑制AFAP1-AS1在鼻 咽癌细胞中的表达
[0060] 在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中导入靶向AFAP1-AS1的干扰载体（sh-1， sh-2, sh-3)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表达情况， AFAP1-AS1的表达均受到明显的抑制。阴性对照（NC)为scramble干扰载体，Mock为未经 任何处理的鼻咽癌细胞。
[0061] 图5为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 侵袭能力降低
[0062] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低。
[0063] 图6为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 迀移能力降低
[0064] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移速度明显减 慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低。
[0065] 图7.动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力
[0066] 在鼻咽癌细胞5-8F中转入shRNA干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，经尾静脉 将鼻咽癌细胞注射到裸鼠体内，观察肺转移情况，发现与对照组（NC)相比，shRNA敲低 AFAP1-AS1表达的5-8F细胞肺转移灶的数目变少（图7A-C，P〈0. 05)，转移灶的体积变小 (图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【具体实施方式】
[0067] 以下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0068] 实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实AFAP1-AS1在鼻咽癌中表达上调
[0069] 1.材料与方法：
[0070] 收集10例正常鼻咽上皮组织和31例鼻咽癌组织，抽提总RNA，2 μ g RNA经逆转录 成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。AFAP-ASl正向引物为5' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3' 如 SEQ N0:8 所示，和反向引物 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3' 如 SEQ N0:9 所示。
[0071] 用于对照的 GAPDH 正向引物为 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'如 SEQ NO: 10 所示， 和反向引物 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如 SEQ N0:11 所示。
[0072] 实时荧光定量PCR反应体系
[0073]
[0074] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0075] I 94〇C 5min
[0076] 2 95〇C IOsec
[0077] 3 58〇C 30sec
[0078] 4 72〇C 20sec
[0079] 5 Plate read
[0080] 6 82〇C 30sec
[0081] 7 Plate read
[0082] 8 Go to step 2for more 39times
[0083] 9 Perform melting curve from 55. (TC to 95. (TC，read every 0· 2°C，hold for Isec
[0084] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用group t-test 检验计 算P值。
[0085] 2.结果
[0086] AFAP1-AS1在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达 Ρ〈0· 001(图 1)
[0087] 实施例2,原位杂交检测发现AFAP1-AS1在鼻咽癌中的表达与患者预后相关
[0088] 1.材料方法
[0089] 1. 1设计并合成杂交探针
[0090] 为了采用原位杂交方法检测AFAP1-AS1的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。
[0091] 用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0092] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' 如 SEQ Ν0:2 所示，
[0093] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3' 如 SEQ Ν0:3 所示，
[0094] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3' 如 SEQ Ν0:4 所示。
[0095] 阳性对照探针（检测看家基因 GAPDH):
[0096] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，如 SEQ NO: 5 所示，
[0097] GAPDH 探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，如 SEQ N0:6 所示，
[0098] GAPDH 探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，如 SEQ NO: 7 所示。
[0099] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。
[0100] 1. 2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0101] 地高辛寡核苷酸加尾试剂（Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒（Anti-Digoxigenin-POD， Fab fragments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA? Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司），DAB染色试剂盒（北京中山公司），20x梓檬 酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子 甲酰胺（Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺 苷酸（polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运 RNA (yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓 罕氏缓冲液（Denhardts's solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋 白（BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer (0· IM Tris-HCl，ρΗ7· 5,0· 15Μ NaCL，0. 5 % Blocking Reagent)，TNT Buffer(0· IM Tris-HCl，ρΗ7· 5,0· 15M NaCL，0.05% Tween 20)，醋酸酐，阻 断试剂（Blocking reagent agent，Roche 公司）。
[0102] I. 3其他主要试剂和材料
[0103] 无水乙醇、90%酒精、70%酒精、50%酒精、松节油、双蒸水、P