AFAP1-AS1 序列输入 Invitrogen 公司的 Block-It RNAi designer 软件， 寻找该IncRNA的shRNA最佳祀点，挑选最佳的3条相应的祀点序列如下：
[0172] shRNA-Ι :GCAATTCACTGAGTGGTTACG 如 SEQ NO: 12 所示，
[0173] shRNA-2 :GCTTACTCTCTTGGTGATTCT 如 SEQ NO: 13 所示，
[0174] shRNA-3 :GCAAGACATCCGATGGTATAC 如 SEQ NO: 14 所示，
[0175] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其 序列如下：
[0176] Scramble :5' -GACACGCGACTTGTACCAC-3' 如 SEQ NO: 15 所示。
[0177] 针对这3条IncRNA革巴点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER 载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形 成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条 寡核苷酸序列及它们配对退火后形成的DNA双链如下：
[0178] shRNA-Ι ：
[0179] 5, -GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA_3，
[0180] 3, -GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5，
[0181] 如 SEQ NO: 16、17 所示，
[0182] shRNA-2 ：
[0183] 5, -GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA_3，
[0184] 3, -GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5，
[0185] 如 SEQ NO: 18、19 所示，
[0186] shRNA-3 ：
[0187] 5, -GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA_3，
[0188] 3, -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5，
[0189] 如 SEQ NO:20、21 所示，
[0190] Scramble
[0191] 5'-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3'
[0192] 3，-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5，
[0193] 如 SEQ NO: 22、23 所示。
[0194] 两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是 Hind III的粘性末端。
[0195] 1.3shRNA 载体构建
[0196] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μ M，互补单链各取10 μ 1混合。然后将oligo混合物在PCR 仪中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。
[0197] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. Ikb的载体片段，将退火后的 粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接 过夜。转化E. coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶 切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入 了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内AFAP1-AS1的表达。
[0198] 1.4细胞培养与转染
[0199] 鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640 培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0200] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2按2 X IO5个细胞/孔接种于 6孔板中，将6孔板置于37°C，5% 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始 shRNA表达载体的转染；转染过程如下：
[0201] 在无菌EP管中加入3 μ 1的Iipofectamine 2000于100 μ 1无血清培养基中混勾 静置5min ;
[0202] 将构建的shRNA表达载体加入100μ1无血清培养基中；然后与上述包含 Iipofectamine的100 μ 1无血清培养基温和混勾，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成 复合体；
[0203] 用D-Hank' s液洗涤细胞3次；
[0204] 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板 中的1个孔；
[0205] 将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续 培养48小时。
[0206] 1. 5实时定量PCR检测shRNA干扰IncRNA表达的效果：
[0207] 将各种shRNA载体转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2yg RNA经逆转录成 cDNA 后，进行实时荧光定量 PCR。AFAP1-AS1 引物为 5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，和 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3、
[0208] 用于对照的 GAI3DH 引物为 5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 和 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' ，
[0209] 实时荧光定量PCR反应体系
[0210]
[0211] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0212] 1 94 °C 5min
[0213] 2 95°C IOsec
[0214] 3 58°C 30sec
[0215] 4 72°C 20sec
[0216] 5 Plate read
[0217] 6 82°C 30sec
[0218] 7 Plate read
[0219] 8 Go to step 2for more 39times
[0220] 9 Perform melting curve from 55. 0〇Cto 95. 0〇C,read every 0. 2°C,hold for Isec
[0221] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用group t-test 检验计 算P值。
[0222] 2.结果
[0223] 这三个shRNA载体转染鼻咽癌细胞5-8F、HKl和HNE2后，均可显著下调鼻咽癌细 胞中AFAP1-AS1的表达水平（图4)。
[0224] 实施例4,制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表 达
[0225] 1.材料方法
[0226] I. 1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒
[0227] 多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OPlO/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行 娃纳米颗粒（silica nanoparticle, SiNP)的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和通过离 子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得 到：
[0228] 1)将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯（TEOS)，继续搅 拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80°C干 燥，研细得硅纳米颗粒（SiNP)。其中H 2O与0P-10及H2O与TEOS的摩尔比为2~10、氨水 浓度为1. 6~28%、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L。
[0229] 2)将SiNP按0· 1~lOmg/ml重悬于0· 6M NaCO3溶液中，超声分散，离心，弃上清， 再将沉淀物按0. 1~l〇mg/ml重悬于PBS (pH 7. 4)中，超声分散，加多聚赖氨酸（终浓度为 4~15nmol/mL)，充分混勾，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨 酸修饰的娃纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4~15nmol/mL。
[0230] 3)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5~30:1与实施例3中所述的靶向 AFAP1-AS1的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。
[0231] 1.2细胞培养与转染
[0232] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F、HK2和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于6 孔板中，将6孔板置于37 °C，5 % 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70 %密度即可开始 AFAP1-AS1真核表达载体的转染；转染过程如下：
[0233] 在无菌EP管中加入100 μ 1制备好的携带AFAP1-AS1真核表达质粒的多聚赖氨酸 修饰的硅纳米颗粒悬液，与100 μ 1无血清培养基温和混匀；用D-Hank' s液洗涤细胞3次； 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的1个 孔；将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过 夜。用携带Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒作为实验对照。
[0234] 1. 3细胞穿膜实验
[0235] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8 μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国BD公司，4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液 (0· 1 % g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水 化。
[0236] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和I X IO5个转染了 AFAPl-ASlshRNA干扰载体或对照载体（s