胚强表达的植物种子特异表达启动子OsSee2的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及胚强表达 的植物种子特异表达启动子0sSee2。
【背景技术】
[0002] 水稻是目前人类最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为 主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而利用 各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。通过分子生物学以及基因 工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。近年来，植物基因工程 的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代生物学和育种学中一项重要的方法和技术。
[0003] 水稻的种子作为主要食用部位，其与人类的生产生活关系非常密切，因此成为植 物基因工程中进行改良的重要目标材料。转化的外源基因在植物受体组织中能否正确、高 效并按照人们的意愿特异地表达是人们非常关注的问题。理想的转基因植物往往需要外源 基因在特定部位和特定时间内高水平表达，产生人们期望的表型性状。启动子在决定基因 表达方面起关键作用。启动子是决定转录起始点和转录频率的关键元件。对启动子结构和 功能的研究，不仅对研究基因表达调控的机理具有重要的理论意义，而且对利用基因工程 方法改良作物具有重要的实践意义。启动子中除了含有基本启动子外还存在一些特异的顺 式调节元件，这些顺式调节元件在基因的特异表达中发挥重要作用。种子特异启动子在上 游存在某些特异元件调控种子特异基因表达。
[0004] 利用种子特异性启动子调控基因表达，可提高基因在这些部位的表达量，将生物 能耗降到最低，利用表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物种子的营养或改善 其品质。Tomlinson等利用napin启动子介导酵母鹿糖酶基因在油料种子中特异表达，大 大增加了鹿糖酶含量，油类物质的积累明显增加（Tomlinson等，2004) !Hornung等利用USP 启动子驱动聚环脂肪酸异构酶基因在烟草中表达，结果转基因烟草种子中亚油酸缀合物含 量大幅度提高（Hornung等，2005) !Holmberg等使用ACP基因启动子驱动下游的固醇转甲 基酶基因在转基因烟草种子中特异地表达，结果使种子中固醇含量增加了 44%，相应的其 它醇类物质也大幅增加（Holmberg等，2002)。
[0005] 但是，目前针对水稻胚进行的启动子方面的研究并不是很多，而且也没有关于胚 强启动子方面的报道。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本申请的发明人认为，针对胚这样的特定部位寻找特异性启动子 是非常有必要的。因此，本发明希望提供一种胚特异性启动子，其能够高效准确地改变水稻 的性状，调控其生长发育以及产量并改良稻米品质。这对植物基因工程的发展和人们生活 水平的提高具有十分重要的意义。
[0007] 具体而言，本发明希望提供一种驱动外源基因在水稻种子中特异性表达的启动 子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的"植物"是 指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0008] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种胚强表达的植物种子特异表达启动 子0sSee2,其特征在于，所述植物种子特异表达启动子0sSee2包含：
[0009] (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者
[0010] (b)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0011] (c)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0012] (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者
[0013] (e)与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功 能的核苷酸序列；或者
[0014] (f)在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的 核苷酸序列；
[0015] (g) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；或者
[0016] (h)与SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且具有启动子功 能的核苷酸序列；或者
[0017] ⑴在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0018] (j)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0019] (k)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具 有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0020] (1)在严格条件下与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的 核苷酸序列。
[0021] 另一方面，本发明提供一组用于扩增上述的植物种子特异表达启动子0sSee2的 全长或其任意片段的引物对。
[0022] 另一方面，本发明提供一种含有上述植物种子特异表达启动子0sSee2的重组表 达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体PCAMBIA1391的多克隆位点插 入权利要求1所述的植物种子特异表达启动子0sSee2得到的重组质粒，在所述重组表达载 体中，所述植物种子特异表达启动子0sSee2连接于载体中待表达的基因序列的上游。
[0023] 进一步地，所述待表达基因为对水稻种子部位有特定功能的基因。
[0024] 另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含上述的植物种子 特异表达启动子0sSee2。
[0025] 另一方面，本发明提供一种上述的植物种子特异表达启动子0sSee2在培育转基 因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将上述的植物种子特异表达启动子0sSee2 连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化 到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0026] 优选地，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、玉米、小 麦、大麦、高梁或燕麦。
[0027] 另一方面，本发明提供一种上述的植物种子特异表达启动子0sSee2在培育高产 水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括将上述的植物种子特异表达启动子0sSee2连接 于目标基因上游，所述目标基因为促进水稻种子细胞分裂的基因，并且将连接产物通过载 体转入到植物细胞、组织或器官中。
[0028] 优选地，所述应用还包括利用所述植物细胞、组织或器官培育转基因水稻植株。
[0029] 序列表中SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列为从日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)扩增并提取出的水稻种子强表达启动子，本文中称为0sSee2或启动子 0sSee2。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基 因上游包括转录起始位点在内的2044bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻种子特异性表 达的功能，该启动子可以在水稻苗期即发挥其作用，因此本发明的发明人分离克隆、并鉴定 了该DNA序列的功能。
[0030] 优选的，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为 pCAMBIA1391-〇sSee2,该重组表达载体为将SEQ ID No:l所示的序列即0sSee2或启动子 0sSee2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sSee2。或 者待表达基因可以为任何水稻种子特异表达基因。
[0031] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，SEQ ID No :2中的序列为去除了 SEQ ID No :1中开头的22bp以及结尾的22bp后的序列，为获自日本晴水稻中的DNA序列。SEQ ID No :1中开头的22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；SEQ ID No :1中结 尾的22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相 应序列互补）。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以 指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的 基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0032] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻0sSee2基因上游包括 转录起始位点在内的2044bp的DNA序列，并将其命名为启动子0sSee2。将该序列经酶切后 连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用 该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到 转基因水稻植株。
[0033] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，可驱 动靶标基因在水稻种子中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物特定组织中的表达 量，增加转基因的效果。
[0034] 技术效果
[0035] 本发明所克隆的水稻启动子0sSee2能够调控基因在植株种子中，尤其是在胚中 强表达，在实际应用中具有显著价值。由于种子是水稻的食用部分，而胚又是种子中的遗传 部分也是食用部分中最有营养价值的部分，本发明的启动子可以与对种子，尤其是胚，具有 改良作用的基因配合使用，提供水稻的产品，增加水稻胚的营养价值，比如，蛋白质含量等， 这对于水稻种子发育分子机制的研究以及水稻品种的推广应用具有重要的理论和现实意 义。
【附图说明】
[0036] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0037] 图1为将0sSee2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-〇sSee2示意图，其中示出了利用0sSee2 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0038] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0039] 图3为成熟植株（90天）0sSee2::Gus转基因植株组织染色图。其中根（a)、茎 (b)、叶（c)、鞘（d)未被染色，而从成熟种子的纵截面（e)和横截面⑴来看，代表报告基 因 Gus活性的蓝色仅出现于成熟种子的胚和胚乳细胞中，其中胚细胞中的强度明显高于胚 乳细胞。这表明0sSee2启动子仅在水稻种子中表达，且在胚中表达强度高于胚乳，是一种 胚强表达的种子