特异型启动子（标尺=2. 5mm)。
【具体实施方式】
[0040] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0041] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0042] 含有酶切位点的0sSee2启动子的获得
[0043] 步骤1、引物的设计
[0044] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻0sSee2基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0045] 本实验例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标 基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID N〇:3)5'端带Hindlll，酶切位点 (AAGCTT)，反向引物（SEQ ID No:4) 5'端带Sail，酶切位点（GTCGAC)，引物序列如下：
[0046] 正向引物：AAGCTTCAATGGTTAGGGAAGGGTTATG HindIII
[0047] 反向引物：GTCGACAGCTATACTTCGATGAGCTTTG Sail
[0048] 由深圳华大基因公司合成。
[0049] 步骤2、启动子0sSee2的获得
[0050] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子0sSee2,按常 规PCR体系，采用如下扩增程序：
[0051] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循环 35 次；最 后 72°C延伸 IOmin。
[0052] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2044bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体 (购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue 感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌 落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和Sail进行双酶切验证，如 图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要 获得的启动子0sSee2,其核酸序列如SEQ ID No: 1和2所示。
[0053] 棺物表汰载体的构律和农杆菌的转化
[0054] 从上面"启动子0sSee2的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII 和Sail酶切，回收启动子0sSee2片段。同时利用HindIII和Sal对pCAMBIA1391进行 线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的0sSee2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接 酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子0sSee2与Gus基因融合的植物表达载 体pCAMBIA1391_0sSee2,利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水 稻组保存）。
[0055] 利用启动子0sSee2驱动Gus报告基_在水稻中表汰
[0056] 步骤1 :农杆菌介导的水稻遗传转化
[0057] 成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴TWeen20 的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯 酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子 的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及 胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌 的转化。
[0058] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体 的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得0sSee2: :Gus转基因水稻植株，该遗传转 化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report, 2012. D0I10. 1007/s00299-01201275-3.) 等提出的方法。
[0059] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色
[0060] 将转化0sSee2启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶片、叶鞘和成熟种子 分别进行Gus染色。将各组织分别浸于Gus染色液中，37°C，过夜24小时，75%乙醇脱色， 将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录Gus染色的结果。染色结果如图 3所示，在根、茎、叶片、叶鞘（图中a-d，图a中根部是自身的黑色而非染成的蓝色）中，基 本没有检测到Gus基因的表达，而在转基因水稻成熟的种子中，显现出肉眼可明显观测到 的很强的蓝色（图e中左上角），并且Gus在胚中的表达强度高于胚乳。这表明，本发明的 启动子能够在转基因植株的种子中指导其下游的Gus蛋白表达，是一种胚强表达的种子特 异启动子。
[0061] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
[0062] 虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技 术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包 含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和 范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在 本发明保护范围之内。
【主权项】
1. 一种胚强表达的植物种子特异表达启动子0sSee2,其特征在于，所述植物种子特异 表达启动子0sSee2包含： (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者 (b) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (c) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有启动 子功能的核苷酸序列；或者 (e) 与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功能的 核苷酸序列；或者 (f) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷 酸序列； (g) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；或者 (h) 与SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且具有启动子功能的 核苷酸序列；或者 (i) 在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (j) 在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者 (k) 在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有启 动子功能的核苷酸序列；或者 (l) 在严格条件下与SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷 酸序列。2. -组用于扩增权利要求1所述的植物种子特异表达启动子0sSee2的全长或其任意 片段的引物对。3. -种含有权利要求1所述植物种子特异表达启动子0sSee2的重组表达载体，其特征 在于，所述重组表达载体为在植物表达载体PCAMBIA1391的多克隆位点插入权利要求1所 述的植物种子特异表达启动子0sSee2得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述植物 种子特异表达启动子0sSee2连接于载体中待表达的基因序列的上游。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达基因为对水稻种子 部位有特定功能的基因。5. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的植物种子特异表达 启动子0sSee2。6. -种根据权利要求1中所述的植物种子特异表达启动子0sSee2在培育转基因植物 中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中所述的植物种子特异表达启动 子0sSee2连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达 载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植 物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。8. -种根据权利要求1中所述的植物种子特异表达启动子OsSee2在培育高产水稻 中的应用，其特征在于，所述应用包括将根据权利要求1所述的植物种子特异表达启动子 OsSee2连接于目标基因上游，并且将连接产物通过载体转入到植物细胞、组织或器官中。9. 根据权利要求8中所述的应用，其特征在于，所述应用还包括利用所述植物细胞、组 织或器官培育转基因水稻植株。
【专利摘要】本发明公开一种胚强表达的植物种子特异表达启动子OsSee2及其应用。本发明的启动子以序列表中SEQ？ID？No：1和2中的序列为基础序列，并且在此基础上进行了扩展。本发明包含了上述两个序列的各种变体，尤其是各种变体中具有启动子功能的序列。本发明还提供了含有该胚强表达的植物种子特异表达启动子OsSee2的表达盒和植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。此外，本发明还提供了一组专门用于从日本晴水稻中扩增本发明启动子的引物对。本发明的启动子对于水稻种子相关分子机制的研究具有重要的理论及实际意义。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/11, C12N15/113, A01H5/00
【公开号】CN105018497
【申请号】CN201510493310
【发明人】李 浩, 杨剑波, 李莉, 魏鹏程, 杨亚春, 秦瑞英, 马卉, 许蓉芳
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月12日