一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段pENP5及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 胚乳特异表达启动子PENP5及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中特异性的驱 动目标基因在植物，尤其是水稻的胚乳中表达。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国最重要的粮食作物，人们日常食用的大米即为水稻的胚乳，胚乳的形 成和发育直接影响着水稻的产量和品质，同时胚乳也是一个优良的重组蛋白表达系统。高 产水稻品种目前存在的一个普遍问题是食味品质较差，远不能适应城乡人民生活水平的提 高对水稻品质的要求。稻米品质差，售价相对也较低，增产不能增收，因而挫伤农民的种粮 积极性。
[0003] 引起这些高产品种食味品质差的主要原因是米粒的直链淀粉含量偏高。水稻种子 胚乳中的淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉两种，不同水稻品种稻米胚乳中的直链淀粉含量 有所不同，籼稻品种一般为20 %~30 %，粳稻品种为15 %~22 %，糯稻为0~2 %。直链淀 粉含量偏高则往往会使饭质变硬、口感差。
[0004] 所谓组织特异性启动子是指除具有一般启动子的结构外，通常还有增强子和沉默 子的一般特性。在组织特异性启动子的调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官 或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。这些启动子的调控往往受到组织细胞生理状 态和化学物理信号等物质的诱导，还受到发育阶段的调控，其表达是多种因子相互作用的 结果。
[0005] 果实和种子是植物的生殖器官，也是营养物质主要的储藏场所。利用果实或种 子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的表达量，将生物能耗 降到最低，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改 善其品质。Sandhu等利用E8启动子（成熟果实中乙烯应答性基因的启动子）驱动呼吸 道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株，用果实特异表达抗原喂饲小鼠，可诱导小鼠产 生特异的粘膜免疫反应、血清学抗体反应及Thl型细胞免疫反应（Sandhu et al.，2000)。 Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水 稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且铁蛋白主要积累在胚乳中，不会在食品加工过程 中丢失（Vasconcelos et al. ,2003)。研究人员在一些单子叶植物的种子储藏蛋白中也 分离了一些胚乳特异表达的顺式作用元件，最著名的GCM元件被认为对维持胚乳特异表 达活性是必须的（Wu et al.，1998)。但也有文献报导，GCM元件仅仅是起到增强启动 子在胚乳中的表达强度的作用，其并不能决定启动子胚乳特异表达的特性（Vickers et al.，2006)。另外，一些种子中特异表达的启动子如PsGNS2启动子（Buchner et al.，2002)、 FAEl (Rossak et al·，2001)启动子等也有相关的报导。
[0006] 筛选和分离一些具有组织专一性、高表达水平的DNA片段以及分析有关的重要特 异性调控元件的功能，在基因工程研究中有着广泛的用途。胚乳是粮食作用营养的最重要 组成部分，因此分离胚乳特异性强表达的DNA片段对植物品质的改良具有重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段、获得含有该DNA片 段的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子叶植物，例如水 稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0008] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段， 所述DNA片段包含：
[0009] 1)序列表中SEQ ID NO : 1所不的DNA序列；或者
[0010] 2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或 者
[0011] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 分子。
[0012] 2)和3)中的序列与SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基 因在植物中表达。
[0013] 优选地，本发明所述DNA序列为SEQ ID No: 1所示的序列。
[0014] 优选地，序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以用作水稻胚乳特异表达启动 子。
[0015] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)，本文中称为pENP5或启动子pENP5。具体而言，本申请的发明人发现日本 晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的2062bp的 DNA序列，具有驱动目标基因在水稻胚乳中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该 DNA序列的功能。但是，需要说明的，后续人们根据本发明公开内容而人工合成的相同序列 也包含在本发明的范围内。
[0016] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻胚乳特异性强表达启动子的表达盒。
[0017] 另一方面，本发明还提供一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其 任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物 的DNA序列包含片段：CACAGAAACACACAGGGGATGT ;所述第二引物的DNA序列包含片段： TTTTGTAGGATTCTACTACTAT 〇
[0018] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载 体PCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中， 所述水稻胚乳特异表达启动子PENP5连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的，所 述待表达的基因为对水稻胚乳有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动基因在胚乳中 特异性表达，从而达到改良作物性状的作用。
[0019] 再一方面，本发明提供上述水稻胚乳特异性强表达启动子在培育转基因植物中的 应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻胚乳特异性强表达启动子连接于载体的待 表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载 体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0020] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0021] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0022] €A^AGAAACA€A^AGGGG^GT tttaaactccaatttttatatatttggcattat TCAAATTGCAAACAAATATGATGACTCTCTTTCTCAAAGAAACATATGCCGTTAGGGTGATCCCAGCGCTTCACTT AGAATGGTTTTTCATAGCATTAAATGATATGCCACGTAGGAAAAAACATGATGTGCCATTTTATTAACTTAGGAAA GAGAAGAAAATTGGGTCTTCTCAAAATGATCATCATCTAACAAAATGTCTCTTTGTTTATTTGTGCAAAGAGTAAA TGTGCATCGTGCAATGTCATGCATGCTGCCAACCAAGATTAATTTCTATTTAGTTGAACCTGTGCAACATTTAAAG TGTGAAGTAATTTTTGTTGGACTTGAAGCGACAAAGCACCTTGGTCGATTAGGCCATCCCCAACCCATGGTGTCCA TGGGTGGTGTCTAGAGCAGTGAGAGATCAATAAATGCATATATGGACACTACCTCCCCATTGCATCGTTTATATAC CAGTTTTCATAGGCAAAAAAAAATTAGTAGCTCTTTGCATGTAACATTAACAGAGGAGGGTCAGCTGTGGCAAGCA AGCAAGCAGACGCGGGAGGGGAGGCGCGCAGCAGGCATGGTGACGGGGTAGGGCGCAGCGGATCGAGATGCGAGGA TTTTTTTTTGGGGGGGTGGGGTGGGGGGAGAGAAACGAGTCATCCAACCCAACGCGGATTTAGCTAGTTTCCAGTG CCTTGGAACAGCCGCCGAAACGGTGTCGCGCATGCGACCTGGTTTCTATGTTTTTGCTTCTTTCTCTTCTTTTATT CCGTTGCCACATCAACTTTTTGTCTAGTTGGCAGCCTAATTAATTCTATGGAAACCAGGTGACATGGAGGGTTGGG GACATGGTGGAAAAAACCGGAACGGGCCGACAGTTCAACCGGAAAAAACCAGAACCCGTTCAGTTCAAAAGAAAGA CCGGACATGCATATGACCCGCTTTGAACCGGCAGAACCGGTCGGTTTTTCTATGAACCGGTCATTAAACCGTCCCC GGTTAGACCGAACAAGCCACAATAATCTTGAAATGGGCCTTGATGTGGCCCAATTGGTCTGCCTAGAGCGTTTTGG TTGGCAAAAATCAATCTCCTATTCTCGGCACGTGTGATATACAATGGTAAGTGAGATATACAATTCTCGGCACGGC TACATTACAAGGTGTCGCATTGTGTCAATGTTTGGTTAATTTGCTAGATTCACATAATACATGCCAGGAAGTTCAG AA