一种毛竹胚乳培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及林木生物技术和细胞工程育种领域，特别涉及到毛竹胚乳培养的方法。
【背景技术】
[0002]三倍体植物通常具有生长旺盛、抗逆性强、无籽等优良性状，三倍体培育是遗传育种的重要途径。相对于传统地借助杂交创制三倍体而言，通过胚乳细胞培养再生三倍体具有周期短、效率高等优点；由于胚乳植物的染色体2/3来自母本，1/3来自父本，作为研究性状遗传规律的材料，也颇具价值；事实上，胚乳植物在形成三倍体植株的同时，可以产生大量不同倍性的混倍体和非整倍体，可为育种提供丰富的不同倍性材料。自上世纪三十年代以来，植物胚乳培养的研究成为植物育种领域的重要技术之一:
[0003]1933年，Lampe and Mills首次报道开展玉米胚乳培养的实验(参考文献I);
[0004]1965 年，Johri and Bho jwani 首次获得 Exocarpos cupressiformis 的胚乳再生植株(参考文献2)；
[0005]此后，植物胚乳培养的研究吸引了国内外众多的科学家参与，并在众多植物上获得成功，主要有:
[0006]1978年，王大元等获得普通的三倍体植株(参考文献3);
[0007]1981年，孙敬三获得大麦胚乳再生植株(参考文献4);同年，桂耀林等培养猕猴桃胚乳获得再生植株(参考文献5);
[0008]1982年，王敬驹等获得小黑麦杂种胚乳的再生植株(参考文献6)；
[0009]1990年，Gmitter等培养Citrus胚乳并获得三倍体植株(参考文献7)；
[0010]1996年，Garg等培养Acacia nilotica的胚乳实现体细胞胚胎发生获得三倍体植株(参考文献8)；
[0011]迄今许多植物种类已经成功实现胚乳培养和植株再生，特别是在麦类、玉米、水稻等农业植物取得较大的成就，但是，同为禾本科的竹类植物，迄今未见有关于其胚乳培养的报道。造成这种现象的原因主要在于:1)与每年开花结实的林木树种或者农作物不同，竹子开花周期长达数十年，开花时间难以预测，胚乳获得十分困难；2)竹子为粗放经营的林木树种，关于其开花生物学的研究比较薄弱，对开花后的受精时间、种胚发育过程也缺乏足够的了解，故而难以获得发育程度适宜的外植体；3)竹类植物以无性繁殖的方式繁衍，每年生笋长竹，人类更多地关注其笋竹产品的生产，对于其科学研究的重视不够。这些问题导致的共同后果就是竹类植物的种质创新途径匮乏，遗传学和育种学的研究显著滞后于其他植物，鉴于此种情况，本方面提供了一种毛竹胚乳培养的方法，从而为竹类植物的种质创新增添新的技术，这对推动竹子遗传育种领域的研究，具有相应的理论意义和生产价值。
[0012]主要参考文献
[0013]1.Lampe L，Mills C0.Growth and development of isolated endosperm andembryo of maize.Abstr Pap Bot Soc Boston，1933，32:235-243
[0014]2.Johri BM， Bhojwani SS.Growth responses of mature endosperm incultures，Nature，1965，208，1345-1347
[0015]3.王大元，张进仁.从胚乳培养再生三倍体柑桔植株[J].中国科学，1978，(4).
[0016]4.孙敬三，朱至清.大麦胚乳植株的诱导及其倍性.植物学报，1981，23:262-265，
[0017]5.桂耀林，母锡金，徐廷玉，.猕猴桃胚乳培养分化出苗[J].植物杂志，1981，(6).
[0018]6.王敬驹，陆文梁，匡柏健.小黑麦杂种胚乳的离体培养研究.植物学报，1982，24:420-425.
[0019]7.Gmitter FG，Ling XB，Deng XX，1990.1nduct1n of triploid Citrus plantsfrom endosperm calli in vitr0.Theor Appl Genet，80，785—790
[0020]8.Garg L?Bhandari NN? Rani V?Bhojwani SS，1996.Somatic embryogenesis andregenerat1n of triploid plants in endosperm cultures of Acacia nilotica.PlantCell Rep，15,855-858
[0021]本发明的特点
[0022]限于竹类植物特殊的开花结实习性等原因，目前，国内外尚未有关于竹类植物胚乳培养的研究报道。作为植物种质创新的有效途径之一，胚乳培养在多倍体培育、性状遗传、新品种选育等方面具有重要的理论和实践价值，特别是对于竹类植物而言，胚乳培养作为其种质创新的重要途径之一，在其遗传学和育种学领域具有重要的意义。通过参考稻麦等近缘物种的同类研究，经过开展大量研究和实验，进行了重要技术创新，发明人掌握了毛竹胚乳培养的关键技术，在国际上首次公开毛竹胚乳培养的方法。
【发明内容】
[0023]—种毛竹Phyllostachys edulis胚乳培养的方法，其特征包括:外植体的制备和消毒，外植体接种及愈伤组织诱导，愈伤组织的分化成苗，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下:
[0024](I)外植体的制备和消毒:对开花毛竹进行人工授粉，于授粉后30-40d取发育饱满的种子，放入存有冰袋的保温箱中冷藏，运至实验室，用4°C预冷的75%乙醇消毒Imin ;然后用4°C预冷的0.2%的次氯酸钠消毒20-25min，期间不断振荡；最后用4°C预冷的无菌水冲洗5-7遍，用无菌纸吸干表面水分，备用；
[0025](2)外植体接种及愈伤组织诱导:取消毒好的外植体，用镊子小心地剥去内外稃片，然后用镊子轻轻挤压种胚使胚乳挤出，将胚乳接种到愈伤组织诱导培养基上，于4°C冰箱中过夜，次日置于26 V暗培养10-20d使胚乳上形成愈伤组织，每20-30d将愈伤组织在相同培养基上继代一次；愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加l-5mg/L的2，4-D、
0.3-1.0mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、15g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖、10g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂粉，灭菌前调整PH = 5.8 ;
[0026](3)愈伤组织的分化:将胚乳愈伤组织接种到分化培养基上，26°C光培养20-30d，光照时间12h/d，光照强度1000-15001ux，部分愈伤组织分化成苗，形成再生植株；分化培养基是以MS培养基为基础，添加0.5-2.0mg/L的ZT,0.5-2.0mg/L的IBA,0.5-2.0mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂；
[0027](4)壮苗、炼苗和移栽:将再生的小植株接种到壮苗培养基上培养30-40d，开瓶炼苗5-10d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1 %的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加 l_4mg/L 的 NAA、0.2-0.5mg/L 的 TDZ、8g/L 的琼脂、30g/L 的蔗糖。
【具体实施方式】
[0028]下面结合毛竹实例对本发明进行详细说明。
[0029](I)对开花毛竹进行人工授粉，于授粉后33d取发育饱满的种实，放入装有冰袋的保温箱中冷藏，运至实验室，用4°C预冷的75%乙醇消毒Imin ;然后用4°C预冷0.2%次氯酸钠消毒20min，期间不断振荡；最后用4°C预冷的无菌水冲洗5遍，用无菌纸吸干表面水分，备用；
[0030](2)取消毒好的外植体，用镊子小心地剥去内外稃片，然后用镊子轻轻挤压种胚使胚乳挤出，将胚乳接种到以MS培养基为基础，添加3mg/L的2，4-D、0.5mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、15g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖、10g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂粉，灭菌前调整PH = 5.8的诱导培养基上，于4°C冰箱中过夜，次日置于26°C暗培养15d使胚乳上形成愈伤组织；
[0031](3)将胚乳愈伤组织接种到以MS培养基为基础，添加0.5mg/L的ZT、1.0mg/L的IBA, 0.5mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂的分化培养基上，26°C光照培养25d，光照时间12h/d，光照强度15001UX，部分愈伤组织分化成苗，形成再生植株；
[0032](4)将再生的小植株接种到以MS培养基为基础，添加2mg/L的NAA、0.2mg/L的TDZ、8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖的壮苗培养基上培养30d，开瓶炼苗7d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1 %的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中(山地黄壤土:蛭石:泥炭土 = I: I: I)，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活。
【主权项】
1.一种毛竹Phyllostachys edulis胚乳培养的方法，其特征包括:外植体的制备和消毒，外植体接种及愈伤组织诱导，愈伤组织的分化成苗，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下: (1)外植体的制备和消毒:对开花毛竹进行人工授粉，于授粉后30-40d取发育饱满的种子，放入存有冰袋的保温箱中冷藏，运至实验室，用4°C预冷的75%乙醇消毒Imin ;然后用4°C预冷的0.2%的次氯酸钠消毒20-25min，期间不断振荡；最后用4°C预冷的无菌水冲洗5-7遍，用无菌纸吸干表面水分，备用； (2)外植体接种及愈伤组织诱导:取消毒好的外植体，用镊子小心地剥去内外稃片，然后用镊子轻轻挤压种胚使胚乳挤出，将胚乳接种到愈伤组织诱导培养基上，于4°C冰箱中过夜，次日置于262暗培养10-20d使胚乳上形成愈伤组织，每20-30d将愈伤组织在相同培养基上继代一次；愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加l-5mg/L的2，4-D、.0.3-1.0mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、15g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖、10g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂粉，灭菌前调整PH = 5.8 (3)愈伤组织的分化:将胚乳愈伤组织接种到分化培养基上，26°C光培养20-30d，光照时间12h/d，光照强度1000-15001ux，部分愈伤组织分化成苗，形成再生植株；分化培养基是以 MS 培养基为基础，添加 0.5-2.0mg/L 的 ZT、0.5-2.0mg/L 的 ΙΒΑ、0.5-2.0mg/L 的 NAA、.30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂: (4)壮苗、炼苗和移栽:将再生的小植株接种到壮苗培养基上培养30-40d，开瓶炼苗.5-10d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1 %的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加 l-4mg/L 的 NAA、0.2-0.5mg/L 的 TDZ、8g/L 的琼脂、30g/L 的蔗糖。
【专利摘要】本发明公开了一种毛竹Phyllostachys？edulis胚乳培养的方法，它是通过对毛竹未成熟胚乳进行适宜消毒后，首先在诱导培养基上形成愈伤组织，然后在增殖培养基上继代，继而在分化培养基上形成再生植株，最后经壮苗培养、炼苗后移栽成活。本发明解决了毛竹胚乳培养的技术难题，为实现毛竹的倍性育种提供了技术支撑，也为其他竹类植物的相关研究提供了有价值的参考。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105075864
【申请号】CN201510566151
【发明人】袁金玲, 顾小平, 岳晋军, 吴晓丽
【申请人】中国林业科学研究院亚热带林业研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月8日