CAATGTGTTGCCTTTCACCGGAAAACTTTGTTGGAGCAAATGCCTTCTTCTTTTTTGCTTCTGCTTCTTGAGTC CATGTGGAGGAAGCAGTAGATAGCTGATGATATCAGGATTCCTTCTGTGTCTGTGTAGGTGTAGCAACACCACTATA ATTTTTATTTAGCAACACAATATCAATTTGGTCTATAAAAGTATGAATTAAATCAATCCCCAACCACAATTAGAGTA AGTTGGTGAGTTATTGTAAAGCTCTGCAAAGTTAATTTAAAAGTTATTGCATTAACTTATTTCGTATCACAAACAAG TTTTCACAAGAGTATTAATGGAACAATGAAAACCATTGAACATACTATAATTTTTTTTCTTACTGAAATTATATAAT TCAAAGAGCATAAACCCACACAGTCGTAAAGTTCCACGTGTAGTGCATTATCAAAATAATAGCTTACAAAACATAAC AAACTTAGTTTCAAAAGTTGCAATCCTTATCACATTGACACATAAAGTGAGCGATGAGTCATGTCATTATTTTTTTG CTCACCATCATGTATATATGATGGGCATAAAAGTTACTTTGATGATGATATCAAAGAACATTTTTAGGTGCACCTAA CAGAATATCCAAATAATATGACTCACTTAGATCCTAATATAGCATCAAGCAAAACTAACACTCTAAAGCAACCGAT AGGGAAACATCTATAAATAGACAAGCATAATGAAAACCCTCCTCATCCTTCACACAATTCAAACATTATAGTTGAA GC A TA GTAGTA GAA TCCTA CAAM
[0023] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列 "CACAGAAACACACAGGGGATGT"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ; 序列末尾以斜体并加粗表示的序列"ATAGTAGTAGAATCCTACAAAA"为获得启动子过程中使用 的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp ;该DNA序列 中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子 既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的 是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发 明的保护范围之内。
[0024] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipp〇nbare)pENP5基因上游包括转录起始位点在内的2062bp的DNA序列，并将其命名 为启动子PENP5。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的 重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌 介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织化 学染色检测发现，转基因植株仅在胚乳部位有Gus表达，从而证明该2062bp的序列具有驱 动基因在胚乳部位特异性表达的活性。
[0025] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水 稻的胚乳部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。
[0026] 技术效果
[0027] 本发明所克隆的水稻启动子pENP5能够调控基因在水稻胚乳中特异性集中表达， 在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子 驱动目标基因在植株胚乳中表达，可以提高和改善水稻的生殖特性、种质特性等，从而培育 出理想的转基因植物品种。
【附图说明】
[0028] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0029] 图1为将pENP5启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-pENP5示意图，其中示出了利用pENP5启 动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0030] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0031] 图3为成熟植株（90天）的根（a)、茎（b)、叶（c)、带壳的成熟种子⑷及其纵截 面（ e)和横截面（f)。Gus染色产生的蓝色信号反应启动子的活性。如图显示，在根、茎、叶 和种壳上Gus报告基因均没有表达，胚细胞中也仅有非常微弱的表达，主要的蓝色信号集 中出现于胚乳细胞中，表明PENP5启动子具有胚乳特异表达的特性。
【具体实施方式】
[0032] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0033] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0034] 含有酶切位点的DENP5启动子的获得
[0035] 步骤1、引物的设计
[0036] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻PENP5基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设 计引物的酶切位点。
[0037] 本实验例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标 基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID N〇:2)5'端带Hindlll，酶切位点 (AAGCTT)，反向引物（SEQ ID No:3)5'端带Sail，酶切位点（GTCGAC)，引物序列如下：
[0038] 正向引物：AAGCTTCACAGAAACACACAGGGGATGT HindIII
[0039] 反向引物：GTCGACTTTTGTAGGATTCTACTACTAT Sail
[0040] 由深圳华大基因公司合成。
[0041] 步骤2、启动子pENP5的获得
[0042] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子pENP5,按常 规PCR体系，采用如下扩增程序：
[0043] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循环 35 次；最 后 72°C延伸 IOmin。
[0044] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2062bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体 (购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue 感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌 落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和Sail进行双酶切验证，如 图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要 获得的启动子PENP5,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0045] 棺物表汰载体的构律和农杆菌的转化
[0046] 从上面"启动子pENP5的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和 Sal I酶切，回收启动子pENP5片段。同时利用HindII I和Sal I对pCAMBIA1391进行线性化处 理、回收PCAMBIA1391，将上述的pENP5片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶（购于TaKaRa 公司）进行连接，得到启动子PENP5与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-pENP5， 利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽 省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）。
[0047] 利用启动子DENP5驱动Gus报告基_在水稻中表汰
[0048] 步骤1 :农杆菌介导的水稻遗传转化
[0049] 成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴TWeen20 的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯 酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子 的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及 胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌 的转化。
[0050] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体 的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得PENP5: :Gus转基因水稻植株，该遗传转 化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(0ryza