sativa L.)[J]. Plant Cell Report, 2012. D0I10. 1007/s00299-01201275-3.) 等提出的方法。
[0051] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色
[0052] 将转化pENP5启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、种子分别进行Gus染 色：将各组织分别浸于Gus染色液中，37°C，过夜24小时，75 %乙醇脱色，将组织中的叶绿素 脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录Gus染色的结果。结果如图3所示，在根、茎、叶片 以及种壳中，基本没有检测到Gus基因的表达，胚细胞中也仅有非常微弱的表达。而胚乳则 被染色成肉眼可明显观测到的很强的蓝色（需要说明的是，虽然考虑到专利申请中对图片 的要求将图3转变为灰度图像，但是从图3的颜色深浅度中依然能够分辨出各个部位染色 结果的差异）。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的胚乳中特异性地指导其下游的 Gus蛋白表达，这种表达具有胚乳组织表达特异性。
[0053] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
[0054] 虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技 术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包 含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和 范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在 本发明保护范围之内。
【主权项】
1. 一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包含： 1) 序列表中SEQ ID NO :1所不的DNA序列；或者 2) 在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者 3) 与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子， 其中： SEQ ID NO :1中所示DNA序列为： CACAGAAACACACAGGGGATGTTTTAAACTCCAATTTTTATATATTTGGCATTATTCAAATTGCAAACAAA TATGATGACTCTCTTTCTCAAAGAAACATATGCCGTTAGGGTGATCCCAGCGCTTCACTTAGAATGGTTTTTCATA GCATTAAATGATATGCCACGTAGGAAAAAACATGATGTGCCATTTTATTAACTTAGGAAAGAGAAGAAAATTGGGTC TTCTCAAAATGATCATCATCTAACAAAATGTCTCTTTGTTTATTTGTGCAAAGAGTAAATGTGCATCGTGCAATGTC ATGCATGCTGCCAACCAAGATTAATTTCTATTTAGTTGAACCTGTGCAACATTTAAAGTGTGAAGTAATTTTTGTTG GACTTGAAGCGACAAAGCACCTTGGTCGATTAGGCCATCCCCAACCCATGGTGTCCATGGGTGGTGTCTAGAGCAGT GAGAGATCAATAAATGCATATATGGACACTACCTCCCCATTGCATCGTTTATATACCAGTTTTCATAGGCAAAAAAA AATTAGTAGCTCTTTGCATGTAACATTAACAGAGGAGGGTCAGCTGTGGCAAGCAAGCAAGCAGACGCGGGAGGGGA GGCGCGCAGCAGGCATGGTGACGGGGTAGGGCGCAGCGGATCGAGATGCGAGGATTTTTTTTTGGGGGGGTGGGGTG GGGGGAGAGAAACGAGTCATCCAACCCAACGCGGATTTAGCTAGTTTCCAGTGCCTTGGAACAGCCGCCGAAACGGT GTCGCGCATGCGACCTGGTTTCTATGTTTTTGCTTCTTTCTCTTCTTTTATTCCGTTGCCACATCAACTTTTTGTCT AGTTGGCAGCCTAATTAATTCTATGGAAACCAGGTGACATGGAGGGTTGGGGACATGGTGGAAAAAACCGGAACGGG CCGACAGTTCAACCGGAAAAAACCAGAACCCGTTCAGTTCAAAAGAAAGACCGGACATGCATATGACCCGCTTTGAA CCGGCAGAACCGGTCGGTTTTTCTATGAACCGGTCATTAAACCGTCCCCGGTTAGACCGAACAAGCCACAATAATCT TGAAATGGGCCTTGATGTGGCCCAATTGGTCTGCCTAGAGCGTTTTGGTTGGCAAAAATCAATCTCCTATTCTCGGC ACGTGTGATATACAATGGTAAGTGAGATATACAATTCTCGGCACGGCTACATTACAAGGTGTCGCATTGTGTCAATG TTTGGTTAATTTGCTAGATTCACATAATACATGCCAGGAAGTTCAGAACAATGTGTTGCCTTTCACCGGAAAACTTT GTTGGAGCAAATGCCTTCTTCTTTTTTGCTTCTGCTTCTTGAGTCCATGTGGAGGAAGCAGTAGATAGCTGATGATA TCAGGATTCCTTCTGTGTCTGTGTAGGTGTAGCAACACCACTATAATTTTTATTTAGCAACACAATATCAATTTGGT CTATAAAAGTATGAATTAAATCAATCCCCAACCACAATTAGAGTAAGTTGGTGAGTTATTGTAAAGCTCTGCAAAGT TAATTTAAAAGTTATTGCATTAACTTATTTCGTATCACAAACAAGTTTTCACAAGAGTATTAATGGAACAATGAAAA CCATTGAACATACTATAATTTTTTTTCTTACTGAAATTATATAATTCAAAGAGCATAAACCCACACAGTCGTAAAGT TCCACGTGTAGTGCATTATCAAAATAATAGCTTACAAAACATAACAAACTTAGTTTCAAAAGTTGCAATCCTTATCA CATTGACACATAAAGTGAGCGATGAGTCATGTCATTATTTTTTTGCTCACCATCATGTATATATGATGGGCATAAAA GTTACTTTGATGATGATATCAAAGAACATTTTTAGGTGCACCTAACAGAATATCCAAATAATATGACTCACTTAGAT CCTAATATAGCATCAAGCAAAACTAACACTCTAAAGCAACCGATAGGGAAACATCTATAAATAGACAAGCATAATGA AAACCCTCCTCATCCTTCACACAATTCAAACATTATAGTTGAAGCATAGTAGTAGAATCCTACAAAAo2. 根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段提取自水稻属植物，优 选为日本晴水稻。3. -组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其 特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段： CACAGAAACACACAGGGGATGT ;所述第二引物的 DNA 序列包含片段：TITTGTAGGATTCTACTACTAT。4. 一种含有权利要求1所述的DNA片段的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载 体为在植物表达载体PCAMBIA1391的多克隆位点插入权利要求1所述的DNA片段得到的重 组质粒，在所述重组表达载体中，所述DNA片段连接于载体中待表达的基因序列的上游。5. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述待表达基因为具有改善植物胚 乳性状功能的基因。6. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的DNA片段。7. -种根据权利要求1中任意一项所述的DNA片段在培育转基因植物中的应用，其特 征在于，所述应用包括：利用权利要求1中所述的DNA片段构建重组表达载体，在所述重组 表达载体中，所述DNA片段连接于目标基因的上游；利用冻融法将所述重组表达载体转入 到根癌农杆菌中，采用农杆菌介导方法将所述根癌农杆菌转化到植物细胞、组织或器官中 进行培育。8. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植 物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待表达基因为具有改善植物胚乳性 状功能的基因。
【专利摘要】一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段pENP5及其应用。本发明公开一种DNA片段，所述DNA片段包含：1)序列表中SEQ？ID？NO：1所示的DNA序列；或者2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以的同源性，且具有启动子功能的DNA片段。该DNA片段可以用作胚乳特异表达启动子。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【IPC分类】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/84, C12N15/11
【公开号】CN105018496
【申请号】CN201510493103
【发明人】李 浩, 杨剑波, 杨亚春, 魏鹏程, 李莉, 秦瑞英, 马卉, 许蓉芳
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月12日