GCG
[0044]引物3:上游引物 GGCGGTGGCG ATGCCGTACGACATG
[0045]引物4:下游引物 CCGCTCGAGTTATGCTGTCGATGGG
[0046](3)将步骤(1)、(2)中的PCR产物混合，作为模板，以引物I和引物4为引物，通过PCR的方法(方法与上文相同)获得，胶回收PCR产物fl-linker-aox (具体获得步骤如图1所示)，连接PMD19-T Vector，得到重组载体T_fl-linker-aox。然后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素的转化体，测序鉴定，测序结果表明获得的核苷酸包括fl-linker-aox，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0047](4)将重组载体T-f l-linker-aox和pET22b分别进行双酶切，酶切位点为NdeI和XhoI，双酶切反应体系如下:ddH20 30uL，10XM 5uL，DNA 基因 12uL，NdeI luL，XhoI luL，37°C反应4小时以上，获得酶切产物I和2。
[0048]用T4DNA连接酶连接酶切产物I和2，得到重组载体pET22b_fl-linker-aox (具体获得步骤如图2所示)，连接反应体系如下:10 X T4DNA连接酶缓冲液2.5uL，DNA片段8uL，载体2uL，T4DNA连接酶luL，ddH20 11.5uL，16°C过夜反应。然后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素的转化体，提重组载体，通过重组载体大小判断fl-linker-aox是否已连接上pET22b重组载体，如果出现8000bp左右大小的片段，说明fl-linker-aox已经连接上pET22b重组载体。
[0049]实施例2
[0050]制备萤火虫荧光素酶及其特性的检测
[0051]1、萤火虫荧光素酶基因工程菌株的获得和蛋白的诱导表达及纯化
[0052](I)萤火虫荧光素酶基因工程菌株的获得
[0053]将pET22b-f 1-1 inker-aox重组载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3) (TAKARA)的感受态细胞，然后涂于含有50mg/L的氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基，于37°C恒温培养箱中培养获取大肠杆菌单菌落。分离抗氨苄青霉素的转化体；提取重组载体，跑电泳，根据重组载体大小判断pET22b-f 1-1 inker-aox重组载体是否成功导入大肠杆菌中，如果出现8000bp左右片段，说明pET22b-fl-linker-aox重组载体已经成功导入大肠杆菌中，如图3所示，将该菌株命名为El。
[0054](2)萤火虫荧光素酶的诱导表达及纯化
[0055]在超净台中挑取El菌株的单菌落于加有50uL AMP的50mL的新鲜液体LB培养基，370C，200rmp，震荡培养14_16h，以此为种子，按5% (体积比)的接种量接到50mL新鲜的LB培养基(加50uLAMP)，37°C，200rmp震荡培养至OD值为14?1.5，然后加入终浓度为lmol/L的IPTG 100uL，进行诱导7h，收集A、B、C、D四管2mL菌液，然后12000rmp离心Imin,弃上清，菌泥用2mL pH为7.0的PBS缓冲液重悬，然后在重悬液中各加入1uL溶菌酶和DNA酶；液氮反复冻融5次，破碎菌体，12000rmp离心lmin，上清液过镍柱进行纯化。
[0056]2、萤火虫荧光素酶的酶活产率、酶活、纯度的检测
[0057]对上述4管纯化后的酶分别进行酶活测定，实验设3次重复
[0058]酶活标准反应条件:2uL酶液，0.15mg/mL的焚光素(Promega)，ImM DTT，5mMMgSO4, 25mM Tricine (pH7.8)，10 6MATP,室温下反应 10s，用 Promega 手持 ATP 发光记录检测仪记录10秒钟内光的输出量(RLU)，用光输出量RLU(ReIative light unit)表示酶活，平均酶活可达8.9 X 1wRLUAig纯化蛋白，将收集液进行SDS-PAGE电泳，并进行灰度扫描定量和计算，酶蛋白的纯度大于98%。室温放置I个月后，用同样的方法测定酶活，平均酶活为8.27X1010RLU/mg,具有较高的稳定性。
[0059]3、5L发酵罐发酵
[0060]挑El菌株的单菌落于加有50uLAMP的50mL的新鲜液体LB培养基进行摇瓶培养，转速为200rmp/min，温度为37°C，培养时间为12-14小时，获得种子液。将上述种子液以3-5% (v/v)的量接于5L的NBS发酵罐，37°C发酵培养，通过关联通气量及转速控制溶氧在20% -40%,当葡萄糖消耗完后流加新鲜料液。种子培养基为LB培养基，发酵培养基为??大豆蛋白胨 10 ?12g/L，葡萄糖 10 ?20g/L，Na2HP04 4 ?6g/L，K2HPO4 I ?3g/L，NH4Cl 0.5 ?lg/L, NaCl 0.1 ?0.5g/L，MgSO4.7H20 0.1 ?0.5g/L。发酵完成后，测定 OD 达 57.4，菌体湿重达63.8g (DCff) /L，荧光素酶的产量为:20mg/L，用Promega手持ATP发光记录检测仪记录10秒钟内光的输出量(RLU)，荧光素酶比酶活8.5X 1wRLUAig蛋白，4°C冰箱放置I个月后酶活为8.16 X 1010RLU/mg纯化蛋白。
[0061]可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种改造后的荧光素酶基因，其特征在于:该荧光素酶基因fi核苷酸序列由萤火虫荧光素酶核苷酸序列改造而成，其序列如SEQ ID N0.1所示。2.含有权利要求1所述的重组表达载体。3.权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于:所述重载载体是pET22b-fl，在原始载体pET22b的NdeI和XhoI位点间插入改造后的荧光素酶基因fl。4.权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组载体是pET22b-fl-linker_aox，通过linker连接米根霉aox基因片段f l-linker-aox导入原始载体pET22b中获得重组载体；fl-linker-aox序列如SEQ ID N0.2所示。5.权利要求4所述的重组载体pET22b-fl-linker-aox的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)以荧光素酶基因fl为模板，设计引物I和引物2，通过PCR的方法获得一端连有linker的荧光素酶基因fl的PCR产物； (2)以米根霉aox基因组DNA为模板，设计引物3和引物4，通过PCR的方法，获得一端连有linker的米根霉aox基因的PCR产物； (3)将步骤(1)、⑵获得的PCR产物混合，作为模板，以引物1、4进行PCR获得fl-linker-aox,胶回收 PCR 产物，连接 PMD19-T Vector,得到重组载体 T_fl-linker-aox。6.权利要求5所述的构建方法，其特征在于:步骤(I)所述引物I序列为GGAATTCCATATGATGGAAGACGCC，引物 2 的序列 TTACAAITTGGACTTGGCGGTGGCG ； 步骤(2)所述引物3序列为GGCGGTGGCGATGCCGTACGACATG，引物4序列CCGCTCGAGTTATGCTGTCGATGGG。7.一种产荧光素酶的工程菌，其特征在于:所述工程菌由权利要求2-4任一项所述载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得。8.—种高稳定生产荧光素酶的方法，其特征在于:(I)将重组表达载体pET22b-f l-linker-aox转入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得产荧光素酶工程菌El ； (2)将工程菌El转接于加有luL/ML的AMP的新鲜液体LB培养基，200rmp/min、37°C进行摇瓶培养，培养时间为12-14小时，获得种子液； (3)将步骤(2)获得的种子液以体积比3-5%的量接于NBS发酵罐，370C发酵培养，通过关联通气量及转速控制溶氧在20% -40%，当葡萄糖消耗完后流加新鲜料液，发酵培养产荧光素酶工程菌El获得荧光素酶。9.权利要求8所述的高稳定生产荧光素酶的方法，其特征在于，步骤(3)进行发酵培养的培养基为:大豆蛋白胨10?12g/L，葡萄糖10?20g/L，Na2HP044?6g/L，K2HP04l?3g/L，NH4Cl0.5 ?lg/L，NaCl0.1 ?0.5g/L，MgSO4.7Η200.I ?0.5g/L。
【专利摘要】本发明属于微生物发酵技术领域，提供一种改造后的荧光素酶基因，具体涉及含该基因的重组载体、该载体的构建方法、含有该载体的工程菌以及该工程菌生产荧光素酶的方法。该荧光素酶基因fl核苷酸序列由萤火虫荧光素酶核苷酸序列改造而成，其序列如SEQ？ID？NO.1所示。所述重组载体是pET22b-fl-linker-aox，通过linker连接米根霉aox基因片段导入原始载体pET22b中获得重组载体；该载体包括fl-linker-aox，序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明利用大肠杆菌的偏爱密码子，对萤火虫荧光素酶进行了密码子优化，利于该荧光素酶基因能在后期大肠杆菌工程菌中顺利高效表达。
【IPC分类】C12N15/70, C12N1/21, C12N15/53, C12R1/19, C12N9/02
【公开号】CN105018504
【申请号】CN201510346941
【发明人】黄和, 徐晴, 王磊, 毕建成, 贺沧
【申请人】镇江泰和益元生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月19日