青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基因及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及青藏高原一年生野生大麦HVEXPB7 基因的克隆和分析，还涉及利用BSMV-VIGS方法研究该基因在青藏高原一年生野生大麦 XZ5根毛生长及耐旱性中的作用。
【背景技术】
[0002] 干旱是影响农作物生长与产量的一个主要环境因素。干旱胁迫引起植株体内一系 列生理生化和基因表达的变化。植物的耐旱性或对干旱的适应能力是一个复杂的性状，涉 及很多代谢途径和表型特征（Hu和Xiong，2014)，因此解密植物的耐旱机制仍然是一个具 有挑战性的任务。
[0003] 根毛是根表皮细胞的管状突起，在养分和水分的吸收、根系土壤固着以及根与土 壤微生物的互作等方面具有重要的作用（Libault等，2010)。研究发现，很多经过长期驯化 的植物根系常常具有发达的根毛，这也被视为现代分子育种的一个重要特征。
[0004] Expan s i η是非酶性质的细胞壁松弛和重构蛋白，参与细胞壁的伸长与扩张， 因此在种子萌发、根系生长，叶片伸长和果实成熟等多种生物学过程中发挥着重要功能 (Cosgrove，2015)。根据expansin家族基因的序列特征，该家族基因被分成四个亚家族： EXPA、EXPB、EXLA和EXLB，其中EXPB对单子叶植物细胞壁的作用更明显（Zhou等，2014 ; Han等，2015)。EXPB基因一般都含有内含子，但是不同个体间内含子的长度和数量存在明 显差异。EXPB蛋白包括DPDD_1和Pollen_allerg_l两个功能域及其它一些保守结构如： DH)D_1功能域中6-8个保守的半胱氨酸残基（Cys，C)、Pollen_allerg_l中4个保守的色 氨酸（Trp，W)和HFD(His-Phe-Asp)保守结构，这些序列特征对其功能的发挥是不可或缺 的。很多的实验证据已经表明expansin与根毛的生长与发育有关。拟南芥（Arabidopsis thaliana L. )AtEXP7和AtEXP18在根毛细胞中特异表达，并且能够调控根毛的发生和伸 长（Lin 等，2011)。水稻（Oryza sativa L.)0sEXPB2、0sEXPB5 和大麦（Hordeum vulgare L. )ΗνΕΧΡΒ1都被证明对根系建成和根毛生长发育起到调控作用（Kwasniewski和Szarejko 2006 ;Won 等，2010 ;Zou 等，2015)。
[0005] 与传统的转基因方法验证基因功能相比，病毒诱导基因沉默技术具有速度快、操 作简单、高通量、成本低等优势，能够高效鉴定当代植株基因功能缺失的生理和表型变化， 从而明确基因功能。但是大多数的VIGS载体都只适合在双子叶植物上应用。基于大麦条 纹花叶病毒改造的BSMV载体（由RNAa、RNAfi和RNAy组成，其中外源基因片段可插入 RNA γ的NheI酶切位点间，形成RNA γ :目标基因重组载体，侵染植株时三条RNA链缺一不 可）是专一针对单子叶植物的VIGS载体（Wang等，2010)，目前为止，已经在一些重要的单 子叶粮食作物如大麦、小麦（Triticum aestivum L·)，水稻和玉米（Zea mays L.)上得到了 成功应用，弥补了其它一些VIGS载体不能应用于单子叶粮食作物的不足，是近年来VIGS研 究的一个热点（Lee等，2012)，但是在野生大麦上的应用还未见报道。
[0006] 与栽培大麦相比，青藏高原一年生野生大麦（Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)具有丰富的遗传多样性（Dai等，2012 ;2014)，并且由于其长期受到各种恶劣 生长环境的驯化，形成了一套独特的抗（耐）性基因调控网络，因此从青藏高原一年生野生 大麦中发掘优异的抗（耐）性相关基因，进而应用于栽培大麦或其他作物，对作物品种改良 具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种从青藏高原一年生野生大麦XZ5中克隆的 HvEXPB7基因，及其对干旱条件下XZ5根毛生长的作用。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种青藏高原一年生野生大麦HvEXPB7基 因，为SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。备注说明：HvEXPB7cDNA来源于青藏高原一年生野 生大麦（Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum) XZ5〇
[0009] 本发明还同时提供了上述HvEXPB7基因编码的蛋白质，为SEQ ID NO :2所示的 氨基酸序列。备注说明：HvEXPB7氨基酸序列来源于青藏高原一年生野生大麦（Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)XZ5〇
[0010] 本发明还同时提供了一种BSMV:HvPDS重组载体，将SEQ ID No :3所示的286bp 的HvPDS基因片段连入RNAy载体的NheI位点间，从而构建而得。备注说明：SEQ ID No: 3为用于构建BSMV:HvPDS重组载体的HvPDS基因片段来源于青藏高原一年生野生大麦 (Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)XZ5〇
[0011] 本发明还同时提供了一种BSMV:HvEXPB7重组载体，将SEQ ID No :4所示的258bp 的HvEXPB7基因片段连入RNAy载体的NheI位点间，从而构建而得。备注说明：SEQ ID No: 4为用于构建BSMV: HvEXPB7重组载体的HvEXPB7基因片段来源于青藏高原一年生野生大麦 (Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)XZ5〇
[0012] 本发明还同时提供了一种BSMV-VIGS体系，利用重组质粒BSMV:HvPDS在青藏高原 一年生野生大麦XZ5上建立而得。
[0013] 本发明还同时提供了上述HvEXPB7基因的用途：该基因用于调控大麦的根毛的生 长，从而增强大麦的耐旱性。
[0014] 作为本发明的HvEXPB7基因的用途的改进：该基因可以调控青藏高原一年生野生 大麦XZ5中根毛的生长，与干旱条件下XZ5的多根毛表型密切相关，对XZ5的耐旱性发挥作 用。
[0015] 备注说明：利用重组质粒BSMV:HvEXPB7在青藏高原一年生野生大麦XZ5上研究 HvEXPB7基因的用途。
[0016] 本发明以发明人前期筛选到的高耐旱青藏高原一年生野生大麦XZ5为材料（Zhao 等，2010)，克隆和分析干旱胁迫下野生大麦根毛生长调控关键基因，对阐明野生大麦根毛 响应干旱胁迫的分子机理和耐旱育种及生产具有重要意义。
[0017] 本发明的方案具体如下：
[0018] 本发明利用 RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)方法克隆了青藏高原一 年生野生大麦HvEXPB7基因的全长cDNA序列如SEQ ID No :1所示，该基因编码的氨基酸序 列如SEQ ID No :2所示。
[0019] 本发明还利用BSMV-VIGS方法在青藏高原一年生野生大麦XZ5中成功沉默了 HvPDS报告基因，首次建立了野生大麦的BSMV-VIGS体系，并利用该体系验证了干旱胁迫下 HvEXPB7基因对XZ5根毛生长的调控作用。
[0020] HVEXPB7基因克隆与分析：基于根毛转录组测序结果中唯一一个在干旱条件 下于XZ5根毛中高表达的EXPB基因片段，通过RACE方法从XZ5中克隆了该基因的 全长cDNA序列，命名为HvEXPB7。HvEXPB7基因 cDNA全长1278bp，编码一个306aa 的蛋白序列，该蛋白分子量为32kDa，等电点pi = 4. 79。将HvEXPB7蛋白序列通过 SMART (http://smart. embl-heidelberg. de/)网站进行功能域预测分析，结果显示该 蛋白含有两个功能域：DTOD_1功能域和Po 11 en_al I erg_l功能域。将HvEXPB7蛋白序 列和水稻 0sEXPB7 (UniProtKB :Q9LD07)、玉米 ZmEXPB7 (GeneBank :ΑΑΚ56130· 1)和小麦 TaEXPB7 (GeneBank :AAS48884. 1)的蛋白序列进行保守域分析，结果显示在DPDD_1功能域 及其附近含有6个保守的半胱氨酸残基（Cys，C)，P〇llen_allerg_l功能域含有4个保守的 色氨酸（T