一种利用重组大肠杆菌发酵生产l-脯氨酸的方法
【技术领域】
[0001] -种利用重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 在众多合成人体蛋白质的氨基酸中，L-脯氨酸是一种非极性氨基酸，其重要性体 现在医药、农业、化工、食品等许多领域。在医药方面，L-脯氨酸是一些特殊药物的合成原 料；农业中，L-脯氨酸的可以增强庄稼的抗逆性能力；在化工领域，L-脯氨酸和它的一些衍 生物也是重要的手性分子，在一些反应中可以作为催化剂使用；L-脯氨酸在食品营养等方 面也有重要作用。
[0003] 最早的L-脯氨酸主要依靠水解蛋白质获得，由于繁杂的生产和纯化步骤，不仅最 终的L-脯氨酸产量低、原料利用率很低，而且在生产过程中加入了大量的有毒化学试剂， 污染环境，反应后的废水废渣也很难处理。对微生物资源的深入开发与利用，以及育种技术 在现代技术领域中的不断提高，微生物发酵法以其成本低，污染少，杂质少，纯度高等优势 在工业生产中日益占主导地位。早期，国内外L-脯氨酸生产菌株的选育主要是通过化学诱 变、物理诱变等传统方式，从大量诱变产物中筛选获得具有营养缺陷型、结构类似物抗性等 突变株。虽然利用传统的诱变方法也得到很多高产的L-脯氨酸生产菌株，但这些传统的方 法有很多局限性。伴随着基因工程和分子克隆技术的迅速发展，人们不断探索新的技术手 段来控制L-脯氨酸的代谢途径，如代谢工程，育种技术等，其目的都是为了提高L-脯氨酸 的产量。
【发明内容】
[0004] 本发明通过将经定点突变后的谷氨酸激酶基因与高效启动子连接后，在大肠杆菌 中过量表达该谷氨酸激酶，并能在脯氨酸发酵培养基中以葡萄糖为碳源，来直接获得大量 的L-脯氨酸，工业应用前景广阔。
[0005] 本发明所述的方法主要是通过重组菌的发酵可以大量获得L-脯氨酸，其特征在 于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：将色氨酸串联启动子和γ-谷氨酸激酶基因 重组到载体上并进行全质粒PCR定点突变，得到含有受脯氨酸反馈抑制作用显著降低的 γ -谷氨酸激酶基因的重组质粒，将该重组质粒转化至微生物细胞中。培养该重组细胞，可 积累产生大量的脯氨酸。
[0006] 本发明中的γ-谷氨酸激酶基因（GenBank登录号：χ00786. 1)通过PCR克隆得到， 该基因来源于Escherichia coli BL21(DE3)。色氨酸串联启动子从实验室已有的载体上酶 切获得。
[0007] 为了使γ -谷氨酸激酶基因在宿主细胞中表达，将克隆得到的目的基因与色氨酸 串联启动子共同插入表达载体中，将该载体转入合适的宿主细胞中实现目的基因的表达。
[0008] 作为表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pET-28a、pKYPIO、pUC19、 pAMP、pBR322 等。
[0009] 作为宿主细胞，要能够表达目的基因，除了使用大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞 菌、芽孢杆菌、酵母菌等菌株，也可以使用动物细胞作为宿主。
[0010] 本发明可以应用于L-脯氨酸的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以 利用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。
[0011] 作为微生物可以利用的碳源，有葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油等。
[0012] 作为微生物可以利用的氮源，可以是氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐类或其他含氮 化合物，还可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆柏等有机氮源。
[0013] 作为微生物可以利用的无机盐，有磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙 等。
[0014] 重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在 20-37°C，培养时间12-72小时。
[0015] 本发明的方法是通过重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸，具有重要的工业应用价 值。
【附图说明】
[0016] 附图是重组载体pET28a-Ptrp2-proBA2构建图。
【具体实施方式】
[0017] -般性说明：【具体实施方式】中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式 质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒由上海生工购买，每个操作完全按照试剂盒的 说明。
[0018] 种子培养基（LB):胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. 0-7. 2。
[0019] Kan抗性平板：1 %胰蛋白胨，0. 5%酵母抽提物，I % NaCl，硫酸卡那霉素 50 μ g/ mL〇
[0020] 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0· 5M KC1，0. 15M CaCl2,0. 25M MgCl2。
[0021] TE 缓冲液（500mL，IOmM Tris-HCl (pH 8.0)，ImM EDTA (pH 8.0)) :5mL IM pH 8.0 的Tris-HCl缓冲液（称取121. Ig Tris置于IL烧杯中，加入适量去离子水，搅拌至完全溶 解，再加入浓盐酸（约42mL)调节pH至8. 0,容量瓶定容至1L，室温保存。），lmL 0. 5M pH =8. 0的EDTA溶液（于IL烧杯中准确称取146. Ig EDTA，加入适量去离子水，搅拌溶解， 然后加入NaOH (约20克）调节pH值为8 (pH = 8的EDTA可完全溶解），定容至1L，室温存 放，加入去离子水混合均勾并定容500mL，室温存放。
[0022] 裂解缓冲液（IOmL) :9. 34mL TE，600 yL 10% SDS，60yL 20mg/mL 的蛋白酶 K，终 浓度为1或5mg/mL的RNase。
[0023] 重组菌生成的L-脯氨酸可通过以下方法测定：将发酵液离心后，取上清，适当稀 释后取ImL于IOmL试管中，加入ImL冰乙酸，摇勾后加入ImL酸性萌三酮（取冰乙酸60mL、 2mol/L的磷酸溶液40mL，加入2. 5g茚三酮，70°C水浴加热溶解，用棕色试剂瓶保存冷却后 的试剂。其中2mol/L磷酸溶液的配置为：称取9. 22g 85%的!^04，加水至40mL。）摇匀后 沸水浴lh，接着加入冰乙酸2mL，摇匀后冷水冷却，然后测定515nm波长处的吸光度值。
[0024] 实施例1 :谷氨酸激酶基因的获得
[0025] 在脯氨酸的合成代谢中，谷氨酸激酶（proB)和谷氨酸脱氢酶（proA)总是相辅相 成的，两者的表达与作用会相互影响，而且两者的基因也紧邻，因此本实施方式将二者作为 一个整体来设计得到proBA基因片段，根据发表在NCBI中的proBA基因序列（GenBank登 录号：x00786. 1)设计一对引物P1(SEQ ID N0:3)、P2(SEQ ID N0:4)，PCR扩增得到目的基 因 proBA。
[0026] 本实施方式中，PCR的模板为大肠杆菌基因组，提取方法：取I. 5mL菌液（过夜培 养），12000rpm离心30s收集菌体；不影响细菌沉淀的情况下尽可能除去上清液；将菌体