沉 淀重悬于600 μ L裂解液（560 μ L TE缓冲液，40 μ L 10 % SDS)，涡旋振荡混匀，37°C温育 Ih ;加入198yL 5M NaCl，混匀，静置5min ;12000rpm离心IOmin ;取上清液于另一离心管 中，加入等体积的苯酚颠倒混匀（避免剧烈振荡离心管，否则DNA容易断裂），静置5min ; 12000rpm离心3min后，转移到另一个离心管（ImL的枪头剪短约2mm，可防止吸到界面杂 质），反复抽提至无白色蛋白；转移上清到一个新的离心管中，为了除去残留的苯酚加入等 体积的氯仿，颠倒混勾，12000rpm离心3min ;取一个新的离心管转移上清，加入2. 5倍体 积-20°C预冷的无水乙醇，轻轻混匀后可见DNA絮状沉淀，置于-20°C冰浴30min ; 12000rpm 离心10min，弃去上清，用400 μ L 70%乙醇（室温）洗绦DNA沉淀2次；12000rpm离心2min， 弃去上清，将DNA沉淀于室温晾干；溶解DNA使用50 μ L TE，-20°C保存；电泳鉴定。
[0027] 实施例2 :色氨酸串联启动子基因的获得
[0028] 色氨酸串联启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生 产应用的强启动子。由于两个色氨酸串联启动子串联起来可提高表达强度，因此实验室其 他研宄人员通过优化色氨酸串联启动子，然后全基因合成色氨酸串联启动子。
[0029] 本实施方式中色氨酸串联启动子序列见SEQ ID NO: 1。
[0030] 实施例3 :pr〇BA表达质粒及重组菌的构建
[0031] 先得到proBA基因，proBA基因需要通过PCR扩增得到，得到的proBA基因5'端序 列带有Hind III (A~AGCTT)酶切位点，而3'端有XhoI ((TTCGAG)酶切位点，将proBA基因及 质粒载体pET-28a分别用Hind III和XhoI消化处理，将双切酶后的proBA基因、pET-28a质粒 载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4DNA连接酶将pr 〇BA、pET-28a基因片段连接起来。 16°C连接过夜后，将10 μ L的连接液转入大肠杆菌JM109。挑取转化后的单菌落培养提取质 粒进行验证，然后进一步测序验证基因序列是否正确。从而得到了构建好的pET-28a-pr 〇BA 重组质粒，同时获得重组大肠杆菌JM109/pET-28a-proBA。
[0032] 由于色氨酸串联启动子基因序列5'端序列带有EcoR I (G~AATTC)酶切位点，3'端 有HindIII (A'AGCTT)酶切位点，将色氨酸串联启动子、pET-28a-proBA用EcoR I和HindIII 两种限制性核酸内切酶双酶切，将双酶切后的色氨酸串联启动子、pET-28a-pr〇BA质粒载体 用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4DNA连接酶将色氨酸串联启动子、pET-28a-pr 〇BA基 因片段连接起来。16°C连接过夜后，将IOyL的连接液体转入大肠杆菌JM109中。挑取转 化后的单菌落培养提取质粒进行验证，从而得到了构建好的pET-28a-Ptrp2-pr 〇BA重组质 粒，同时得到重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA。
[0033] 实施例4 :含有双突变目的基因 pr〇BA2基因的重组大肠杆菌的构建
[0034] 使用设计好的突变引物 P3(SEQ ID N0:5)、P4(SEQ ID N0:6)，以 pET-28a-Ptrp2-pr〇BA质粒为模板进行全质粒PCR定点突变；结束后用Dpn I消化产物除 去模板；将10 μ L消化后的产物转入大肠杆菌JM109中。挑取单菌落培养提质粒测序，验证 基因序列是否正确。从而得到了构建好的pET-28a_Ptrp2-proBA2重组质粒，同时获得重组 大肠杆菌 JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA2 〇
[0035] 本实施方式中proBA2基因序列见SEQ ID NO:2
[0036] 实施例5 :重组菌株的发酵实验
[0037] 摇瓶培养：在Kan抗性平板上挑取重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA2单 菌落，接种到LB液体培养基（含硫酸卡那霉素）中，37°C、220rpm过夜培养后，按6%接种 量接入250mL摇瓶中的脯氨酸发酵培养基，在旋转式摇床中30°C、220rpm培养24h，然后取 发酵液检测L-脯氨酸浓度。L-脯氨酸的测定方法详见实施例一般性说明。发酵结果显示， 重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA2的L-脯氨酸产量达到4. 44g/L。
【主权项】
1. 提高含有重组DNA的L-脯氨酸生物合成系统活性的方法，其中的含有重组DNA的 L-脯氨酸生物合成系统是通过将编码γ -谷氨酸激酶的基因片段重组到载体上并转入微 生物细胞，得到具有L-脯氨酸生物合成活性增强的重组微生物。
2. 权利要求1所述的重组微生物中，编码γ-谷氨酸激酶的基因是来自大肠杆菌的 proBA基因。
3. 权利要求1所述的增强L-脯氨酸生物合成系统活性的方法，其特征在于通过导入受 脯氨酸反馈抑制显著减少的γ-谷氨酸激酶基因，并增加重组微生物中的该γ-谷氨酸激 酶基因的拷贝数来实现。
4. 权利要求3所述的重组微生物中，受脯氨酸的反馈抑制显著减少的酶基因是来自大 肠杆菌的proBA2基因。
5. 权利要求3所述的增加 γ -谷氨酸激酶基因在重组微生物中的拷贝数的方法，其特 征是将γ-谷氨酸激酶基因连接到一个多拷贝质粒来实现。
6. 权利要求3所述的多拷贝质粒包括但不局限于pET-28a、ρΚΥΡΙΟ等。 7. L-脯氨酸的生产方法，其特征是将权利要求1、2、3、4所述的重组微生物在培养基上 培养，将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在葡萄糖存在下，于水性介质中 使葡萄糖转化为L-脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-脯氨酸。
8. 权利要求1、2、3、4、所述的重组微生物包括但不局限于大肠杆菌属、棒状杆菌属、假 单胞菌属、芽孢杆菌、酵母菌等。
【专利摘要】本发明公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，该重组大肠杆菌携带具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因以及色氨酸串联启动子的重组质粒。其中重组质粒是通过将克隆得到的γ-谷氨酸激酶基因，以及实验室的色氨酸串联启动子连接到同一质粒上并进行全质粒PCR定点突变得到的。本发明还公开了所述大肠杆菌在L-脯氨酸生产中的应用。
【IPC分类】C12N15-75, C12P13-24, C12N15-77, C12N15-81, C12N1-21, C12N15-70, C12N15-78, C12N1-19
【公开号】CN104561072
【申请号】CN201410665449
【发明人】张震宇, 胡丹丹, 范永明
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年11月19日