一种抗氧化物质安石榴甙用于提高雄性生育力的制作方法
【专利摘要】本发明涉及安石榴甙(Punicalagin)在减少氧化损伤，尤其在减少睾丸氧化损伤，特别是在减小脂多糖(LPS)诱导的睾丸氧化损伤，以及恢复及提高男性生育力方面的用途。
【专利说明】一种抗氧化物质安石榴甙用于提高雄性生育力
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化药学领域,具体涉及安石槽式(Punicalagin)的抗氧化功能,尤其涉及有效减小脂多糖(LPS)诱导的辜丸氧化损伤，及其在恢复和提闻雄性生育力方面的用途。
【背景技术】
[0002]不育症是一个影响人们心理和生理的重大疾病。大约有15%的夫妇存在不同形式的不育，这其中由男性因素引起的不育约占50%。氧化性损伤是一个影响男性不育的重要病因(Aitken and Roman2008 ；ffright, Milne et al.2014)。氧化性损伤主要是机体中的氧化性物质和抗氧化物质的失衡，导致过多的氧化性物质存在。氧化性物质能够导致精子损伤、畸变，最终导致不育。例如，睾丸中的氧自由基异常增加将破坏DNA和蛋白质。已有许多研究表明一些金属性物质能促进睾丸氧化应激，导致氧化损伤(Mahanta, Gogoiet al.2012 ；Aitken, Smith et al.2014)。也有报道表明很多药物能促进睾丸氧化应激(Apostoli and Catalani2011 ；Marzec-ffroblewska, Kaminski et al.2012),增加细胞内活性(ROS)，导致DNA、蛋白质和脂类的氧化。比如细菌细胞壁的脂多糖(LPS)也能诱导免疫细胞产生氧化应激效应。机体通过抗氧化性物质来抑制氧化应激从而保护自身安全。抗氧化性物质能平衡氧自由基对机体的损害。人体产生抗氧化物质是通过基因表达的抗氧化蛋白和饮食中的抗氧化物质(Agarwal and Sekhon2011 ；Marzec-ffroblewska, Kaminskiet al.2012 ；ffalczak- Jedrzejowska, Wolski et al.2013 ；0yeyipo, Raji et al.2014)。最近研究的一些植物和食物提取物(姜黄素，番茄红素，杨梅素，槲皮素，樟脑，丁香酚，柠檬烯，白藜芦醇等)的功能备受关注(Ilbey, Ozbek et al.2009 ；Krishnamoorthy, Selvakumaret al.2013)。这些植物和食物提取物能够恢复生育功能，改善糖尿病相关的勃起功能障碍，保护生殖腺，产生抗氧化作用，增加精子数目等方面都有报道。也有一些水果提取物被用来治疗睾丸组织的毒性效应和治疗不育研究(Wang, Zhao et al.2002 ；Alpsoy, Kanter etal.2014)。
[0003]如上所述，氧化应激经常会影响雄性生育功能，机体内的抗氧化物质时常不足以抵消氧化应激状态。因此，需要发现有效的抗氧化物质来消除过氧化状态。因此，本发明试图从水果中发现有效的抗氧化性物质。
[0004]本发明中发现石榴中的安石榴甙具有非常有效的抗氧化和保护睾丸的氧化损伤的功能。安石榴甙具有抵抗氧化损伤，提高人类男性生育力方面的用途。
【发明内容】
[0005]本发明为安石榴甙提供了一个新的应用领域。安石榴甙具有剂量依赖性的保护睾丸的氧化损伤的功能。安石榴甙具有高效的抗氧化能力，它可以裂解成小的多酚被机体吸收，抑制氧化过程。
[0006]本发明发现脂多糖(LPS)诱导睾丸氧化损伤，导致雄鼠生育力水平下降，安石榴甙可以恢复LPS导致的生育力水平下降，提高生育能力。还发现安石榴甙能够增加转录因子Nrf2在睾丸中的表达水平，以及通过抑制NF-κ B信号通路，从而保护睾丸的氧化损伤。
[0007]具体地，本发明涉及以下各项:
[0008]1.安石槽式(Punicalagin)用于人体或动物体中抗氧化损伤的用途。
[0009]2.根据I所述的用途，所述氧化损伤为睾丸氧化损伤。
[0010]3.根据I或2所述的用途，所述氧化损伤由氧化性物质引起。
[0011]4.根据3所述的用途，所述氧化性物质包括活性氧自由基(R0S)，活性氮自由基(RNS)，放射性物质，金属性物质，硫氧化物，脂多糖(LPS)。
[0012]5.根据3所述的用途，所述氧化性物质为脂多糖。
[0013]6.安石榴甙用于恢复人类男性或雄性动物生育力的用途。
[0014]7.安石榴甙用于提高人类男性或雄性动物生育力的用途。
[0015]8.根据1-6任一项所述的用途，其中所述安石榴甙增加转录因子Nrf2的表达水平和/或抑制NF- K B信号通路。
[0016]9.根据1-6任一项所述的用途，其中所述安石榴甙可以缓解LPS诱导的生殖细胞空泡化，曲细精管降解和精子数量减少。
[0017]发明详述
[0018]以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。
[0019]本发明的第一个方面提供安石榴甙(Punicalagin)用于人体或动物体中抗氧化损伤的用途。安石榴甙具有高效的抗氧化能力，它可以裂解成小的多酚被机体吸收，抑制氧化过程。
[0020]在一个优选的实施方案中，所述抗氧化损伤为减少氧化物质对睾丸的氧化损伤。本领域技术人员已知可以对睾丸造成氧化损伤的物质，包括但不限于活性氧自由基(ROS)，活性氮自由基(RNS)，放射性物质，金属性物质，硫氧化物，脂多糖(LPS)等。
[0021]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及所述安石榴甙在减少由LPS引起的睾丸氧化损伤方面的用途。
[0022]本发明的另一个方面提供安石榴甙在恢复和/或提高人类男性或雄性动物生育力方面的用途。
[0023]在优选的实施方案中，所述安石榴甙可以缓解LPS诱导的生殖细胞空泡化，曲细精管降解和精子数量减少。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1-图2:脂多糖剂量选择。根据睾丸的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)(图1)和脂类过氧化物酶(LPO)(图2)来选择脂多糖(LPS)的剂量。随机分成四组(每组6只小鼠)，第一组100 μ g/g2天,第二组lmg/g2天,第三组100 μ g/g3天,第四组lmg/g3天。第一组100 μ g/g2天:按照小鼠体重计算,每天腹腔注射100 μ g/g LPS 一次,连续注射两天，第三天杀鼠做实验；第二组lmg/g2天:按照小鼠体重计算,每天腹腔注射lmg/g LPS 一次，连续注射两天，第三天杀鼠做实验；第三组100μ g/g3天:按照小鼠体重计算，每天腹腔注射100yg/g LPS一次,连续注射三天,第四天杀鼠做实验；第四组lmg/g3天:按照小鼠体重计算，每天腹腔注射lmg/g LPS 一次,连续注射三天,第四天杀鼠做实验。
[0025]图3-图4:安石槽式(Punicalagin)剂量选择。根据睾丸的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)(图3)和脂类过氧化物酶(LPO)(图4)来选择安石榴甙的剂量。随机分成二组(每组6只小鼠)，第一组5 μ g/g4天,第二组50 μ g/g4天。第一组5 μ g/g4天:按照小鼠体重计算，每天腹腔注射5 μ g/g安石榴甙一次，连续注射四天，第五天杀鼠做实验，第二组50 μ g/g4天:按照小鼠体重计算，每天腹腔注射lmg/g安石榴甙一次，连续注射四天，第五天杀鼠做实验。
[0026]图5:各处理组鼠的注射流程。随机分成四组(每组6只小鼠)，对照组，连续注射灭菌水四天，四次；安石榴甙组，连续注射安石榴甙5 μ g/g四天，四次；脂多糖组，连续注射脂多糖lrng/g两天，两次；安石榴甙+脂多糖组，连续注射安石榴甙5 μ g/g四天，四次，前两天连续注射脂多糖lmg/g两天，两次。用于以后实验。
[0027]图6-7:各处理组小鼠睾丸中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量(图6)和脂类过氧化物酶(LPO)含量(图7)。图6和7分别用睾丸GSH和LPO的量来指示睾丸的氧化还原电位和脂质过氧化物形成。
[0028]图8 ;显示小鼠睾丸中被破坏的曲细精管。
[0029]图9:显示小鼠睾丸组织形态学。
[0030]图10:各处理组小鼠睾丸TNFa，NFkB，Nrf2的mRNA水平。其中安石榴甙下调NF- K B和TNF a的mRNA表达水平，上调Nfr2的mRNA表达水平。
【具体实施方式】
[0031]本发明主要涉及安石榴甙的抗氧化性能，具体涉及其恢复睾丸氧化应激造成的生育力低下。安石榴甙是一个多酚类化合物，易溶于水。它能够通过不同的作用途径来抵抗氧化损伤。
[0032]本发明的目的可以具体通过以下技术方案来实现:
[0033]本研究使用ICR雄鼠为动物模型。首先，我们通过腹腔注射选择不同剂量的LPS诱导的小鼠睾丸氧化应激和氧化损伤。接下来，通过腹腔注射选择不同剂量的安石榴甙来保护小鼠睾丸氧化应激和氧化损伤。安石榴甙保护小鼠睾丸氧化应激和氧化损伤具有剂量依赖性。然而，在一定剂量的安石榴甙处理后，显示出安石榴甙的毒性效应，我们的结果显示在腹腔注射50ug/g安石榴甙后，61 %的小鼠死亡(三次实验，两次4只死亡，一次3只死亡)。
[0034]GSH和LPO作为生物体氧化应激的标准，通过检查睾丸中的GSH和LPO的含量来确定氧化应激状态。对照组和安石榴甙处理组显示睾丸中相似的GSH含量和较低的LPO含量。LPS处理组显示睾丸中较高的LPO含量和低GSH含量。在安石榴甙和LPS处理组显示睾丸中的LPO含量比单独LPS处理组低。这些实验结果显示LPS能诱导睾丸的氧化损伤，安石榴甙具有抗氧化的能力，来保护睾丸的氧化损伤。
[0035]同时，我们也从睾丸的形态学方面和生育力方面研究了 LPS诱导的睾丸的氧化性损伤和安石榴甙的抗氧化损伤效应。也证明了安石榴甙具有抗氧化的能力，来保护睾丸的氧化损伤。
[0036] 本发明提示安石榴甙能够有效地减小脂多糖(LPS)诱导的睾丸氧化损伤，并可以恢复和提高人类男性或雄性动物的生育力。
[0037]实施例1:药物剂量选择
[0038]实验小鼠
[0039]ICR小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，在中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心饲养，实验动物遵循标准操作规程，并经中国科学技术大学实验动物伦理审查。
[0040]LPS剂量选择
[0041]材料:LPS购自Sigma公司，LPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，GSH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0042]I)取8周大雄性ICR鼠，
[0043]2)随机分成四组，每组6只小鼠，第一组100yg/g2天，第二组lmg/g2天，第三组100 μ g/g3 天,第四组 lmg/g3 天,
[0044]3)第一组100 μ g/g2天:按照小鼠体重计算,每天腹腔注射100 μ g/g LPS 一次,连
续注射两天，第三天杀鼠做实验，
[0045]第二组lmg/ g2天:按照小鼠体重计算,每天腹腔注射lmg/g LPS 一次,连续注射两天，第三天杀鼠做实验，
[0046]第三组100 μ g/g3天:按照小鼠体重计算,每天腹腔注射100 μ g/g LPS 一次,连续注射三天，第四天杀鼠做实验，
[0047]第二组lmg/g3天:按照小鼠体重计算,每天腹腔注射lmg/g LPS 一次,连续注射三天，第四天杀鼠做实验，
[0048]4)取各组小鼠睾丸组织，用LPO和GSH试剂盒检测睾丸的LPO和GSH的含量(具体步骤如实验试剂盒说明书所述)，
[0049]5)分析各处理组睾丸组织的LPO和GSH含量。
[0050]安石榴甙剂量选择
[0051]材料:安石槽式购自Sigma公司。
[0052]I)取8周大雄性ICR鼠。
[0053]2)随机分成二组，每组6只小鼠，第一组5 μ g/g4天，第二组50 μ g/g4天，
[0054]3)第一组5 μ g/g4天:按照小鼠体重计算，每天腹腔注射5 μ g/g安石榴甙一次，连续注射四天，第五天杀鼠做实验，
[0055]第二组50μ g/g4天:按照小鼠体重计算，每天腹腔注射50 μ g/g安石榴甙一次，连续注射四天，第五天杀鼠做实验，
[0056]4)取各组小鼠睾丸组织，用LPO和GSH试剂盒检测睾丸的LPO和GSH的含量(具体步骤如实验试剂盒说明书所述)，
[0057]5)分析各处理组睾丸组织的LPO和GSH含量。
[0058]实施例2 =LPS和安石榴甙处理后小鼠的生育指标检测
[0059]实验方法:
[0060]实验动物处理
[0061]I)取8周大雄性ICR鼠。
[0062]2)随机分成四组，每组6只小鼠。对照组，连续注射灭菌水四天，四次；安石榴甙组，连续注射安石榴甙5 μ g/g四天，四次；脂多糖组，连续注射脂多糖lmg/g两天，两次；安石槽式+脂多糖组，连续注射安石槽式5 μ g/g四天，四次,前两天连续注射多糖lmg/g两天，两次。
[0063]3)各处理组鼠的注射流程见图5，用于以后试验。
[0064]睾丸氧化应激检测(LP0和GSH含量检测)
[0065]LPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，GSH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0066]I)各实验组动物处理如上所述，
[0067]2)取各组小鼠睾丸组织，用LPO和GSH试剂盒检测睾丸的LPO和GSH的含量(具体步骤如实验试剂盒说明书所述)，
[0068]3)分析各处理组睾丸组织的LPO和GSH含量。
[0069]睾丸组织形态学检测
[0070]I)各实验组动物处理如上所述，
[0071]2)将切取的睾丸组织浸泡在苦味酸固定剂(饱和苦味酸:甲醛:乙酸=15:5:1)中，室温12小时，水洗过夜，
[0072]3)将烘箱温度调至80°C融解石蜡，
[0073]4)乙醇梯度脱水:75% 乙醇、30minX2，95% 乙醇、15minX2，100% 乙醇、100%IOminX 2，
[0074]5) 二甲苯 5-lOmin，
[0075]6)将切取的睾丸组织放入烘箱中已经预先融化的100%石蜡三遍，每次30min，
[0076]7)在80°C恒温金属浴上将取出的睾丸组织置于100%石蜡模具内，倒入石蜡包埋后并贴上标签，于室温凝固，
[0077]8)切片 4 μ m。
[0078]9)将石蜡切片置于60°C烘箱中烤切片4_6h，
[0079]10) 二甲苯脱蜡 8minX2，
[0080]11)梯度乙醇水化:100%乙醇5min, 955^905^70%乙醇各2min,蒸懼水2min,
[0081]12)苏木素染色5min，流水冲洗15min以上返蓝，
[0082]13)梯度乙醇脱水:70%、80%、90%乙醇各2min，
[0083]14)伊红染色5s (可根据染色结果和要求调整时间)，
[0084]15)95%、100%、100% 乙醇各 2min，
[0085]16) 二甲苯透明 5minX2，
[0086]17)采用中性树胶封片。
[0087]生育力检测
[0088]I)各实验组动物处理如上所述，
[0089]2)将各处理组雄鼠分为单只/笼，
[0090]3)将每只雄鼠按照1:2的比例，放入10周大的ICR雌鼠交配，
[0091]4)记录雌鼠的怀孕数和生仔数，
[0092]5)雄鼠生育力=(怀孕雌鼠数/雌鼠总数)*100%，
[0093]6)同时观察记录小鼠的活动行为是否正常。[0094]相关基因表达检测
[0095]I)各实验组动物处理如上所述，
[0096]2)提取各处理组小鼠辜丸总RNA，
[0097]3)采用商品化试剂盒(TaKaRa Bio, Inc.)进行 RT-PCR 及 real-time PCR 等，技术手段均按照试剂盒说明书进行。
[0098]4) TNF a，NF K B, Nrf2 的 RT-PCR 和实时 PCR。
[0099]统计分析
[0100]采用Student’s t-test检验变量间显著差异性,数值以mean土SD显示。P值小于
0.05作为统计显著性阈值。
[0101]实验结果
[0102]本研究使用ICR雄鼠为动物模型。首先，我们通过腹腔注射选择不同剂量的LPS(图1-2)诱导的小鼠 睾丸氧化应激和氧化损伤。接下来，通过腹腔注射选择不同剂量的安石榴甙(图3-4)来保护小鼠睾丸氧化应激和氧化损伤。安石榴甙保护小鼠睾丸氧化应激和氧化损伤具有剂量依赖性(图3-4)。然而，在一定剂量的安石榴甙处理后，显示出安石榴甙的毒性效应，我们的结果显示在腹腔注射50ug/g安石榴甙后，61%小鼠死亡。
[0103]GSH和LPO作为生物体氧化应激的标准，通过检查睾丸中的GSH和LPO的含量来确定氧化应激状态。对照组和安石榴甙(5ug/g)处理组显示睾丸中较高的GSH含量(图6)和较低的LPO含量(图7)。LPS (lmg/g)处理组显示睾丸中较高的LPO含量(图7)和低GSH含量(图6)。在安石榴甙(5ug/g)+LPS (lmg/g)处理组显示睾丸中的LPO含量比单独LPS处理组低(图7)。这些实验结果显示LPS能诱导睾丸的氧化损伤，安石榴甙具有抗氧化的能力，来保护睾丸的氧化损伤。
[0104]我们也从睾丸的形态学方面研究了 LPS诱导的睾丸的氧化性损伤，如产生多核细胞，生殖细胞空泡化，曲细精管降解和精子数量减少。然而安石榴甙+LPS处理组显示睾丸的损伤远低于单独LPS组诱导的睾丸损伤。从曲细精管图(图8)可以看出，单独LPS组较安石榴甙+LPS处理组的曲细精管破裂和降解程度更严重；从睾丸形态图(图9)可以看出单独LPS组较安石榴甙+LPS处理组，曲细精管和生殖细胞空泡更严重，精子数量更少。证明了安石榴甙具有抗氧化的能力，来保护睾丸的氧化损伤。同时，安石榴甙能够消除LPS诱导的TNF α和NF K B基因的激活(图10)，和升高抗氧化性的Nrf2基因的表达，来抗氧化损伤。
[0105]最终，我们发现单独的LPS处理鼠，小鼠的生育力下降(表1)。在LPS处理后，交配实验显示雌鼠怀孕率为0，一个月后恢复正常；而安石榴甙+LPS处理组，交配实验显示60%雌鼠怀孕，另外40%推迟一周后怀孕。安石榴甙能够恢复LPS诱导的生育力下降，该实验结果提示安石榴甙可能能够提高雄性生育力。
[0106]表1.通过交配实验，获得各处理组鼠的生育率结果
[0107]
【权利要求】
1.安石槽式(Punicalagin)用于人体或动物体中抗氧化损伤的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述氧化损伤为睾丸的氧化损伤。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述氧化损伤由氧化性物质引起。
4.根据权利要求3所述的用途，所述氧化性物质包括活性氧自由基(ROS)，活性氮自由基(RNS)，放射性物质，金属性物质，硫氧化物，脂多糖(LPS)。
5.根据权利要求3所述的用途，所述氧化性物质为脂多糖。
6.安石榴甙用于恢复人类男性或雄性动物生育力的用途。
7.安石榴甙用于提 高人类男性或雄性动物生育力的用途。
8.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述安石榴甙可以增加转录因子Nrf2的表达水平和/或抑制NF- K B信号通路。
9.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述安石榴甙可以缓解LPS诱导的生殖细胞空泡化，曲细精管降解和精子数量减少。
【文档编号】A61K31/7048GK104000837SQ201410270457
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】孙斐, 法伊扎·饶, 李文清, 黄河龙 申请人:中国科学技术大学