专利名称：一种木聚糖酶及表达木聚糖酶的重组工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种木聚糖酶及表达该木聚糖酶的重组工程菌。
背景技术：
木聚糖酶是可将木聚糖降解成木糖和低聚糖的一类酶的总称，通常所说的木聚糖酶即内切β-1，4-木聚糖酶，内切β-1，4-木聚糖酶作用于木聚糖主链，随机切开木聚糖内部的木糖苷键，将其分解为低聚糖。不同来源木聚糖酶的组成和性质不完全相同，但理化性质存在相似性，如相对分子质量在O. 8万-14. 5万、pH在3-10范围内稳定，最适范围为4_7 ；不同来源木聚糖酶等电点在3-10 ;不同来源的木聚糖酶氨基酸组成相差不大等。
小麦和玉米等植物性原料中含有大量非淀粉多糖，特别是阿拉伯木聚糖，而它不能被单胃动物利用。当木聚糖进入畜禽小肠后，部分溶于水，使得食糜含水量增加，从而使小肠内容物的黏度增加，阻碍了营养物质和消化酶的结合及营养物质在小肠黏膜上的吸收，另外食糜黏度的增加抑制了内源消化酶的活性，降低了食糜的通过速率；不溶性木聚糖包裹营养物质也阻碍了营养物质的释放，降低了营养物质的消化利用率。众多研究表明添加木聚糖酶能降解木聚糖、减少微生物定植并维持肠道正常结构，提高动物体对营养物质利用率(梁永，2012)。Panbangred和Fukusaki (1985)首次利用大肠杆菌表达矮小芽抱杆菌(Bacilluspumilus Ι0Ρ) β-木聚糖酶。随后已有数十种不同来源的木聚糖酶基因在原核生物表达系统中实现了表达。目前，对木聚糖酶在不同真核系统中的表达也进行了研究。应用最普遍的真核表达系统是酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、动物乳腺表达系统、丝状真菌外源表达系统等。研究证实，酵母表达系统作为成熟的表达系统已使多种不同来源的木聚糖酶实现了闻效表达(张红连等，2003 ；Moreau等，1992)。
发明内容
本发明的目的是提供一种木聚糖酶及其重组表达工程菌，即利用基因工程技术手段，将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在中性偏酸性条件下具有较高的活性，可广泛应用于饲料添加剂领域。本发明一方面涉及一种从烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中分离的木聚糖酶，其特征在于I)氨基酸序列为SEQ ID NO 1的木聚糖酶；2)在SEQ ID NO 1中限定的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有烟曲霉的木聚糖酶功能的，由SEQ ID NO :1衍生的蛋白质。上述的烟曲霉的木聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2。本发明还提供用于表达上述木聚糖酶的重组表达载体；所述的重组表达载体携带有序列为SEQ ID NO : 2的编码基因。本发明另一个方面涉及一种用于表达上述木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌携带有表达烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的木聚糖酶基因的表达载体；该毕赤酵母(Pichia pastoris) ZHEl菌株，已于2012年12月5日保藏于位于武汉洛珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M2012504。本发明另一方面涉及上述毕赤酵母工程菌的应用，用于生产木聚糖酶。本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效表达烟曲霉的木聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活达到277U/ml。本发明的重组木聚糖酶在中性偏酸性范围内具有较高的酶活，最适pH值为6.0，在pH 5. 0-7. O的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为55°C，在温度40-60°C的范围内，能保持50%以上的活性。通过在日粮中添加本发明的木聚糖酶，肉鸡的只采食量、只增重分别提高了 5. 7%U2. 2% ;粪样中能量含量、蛋白含量比对照组分别降低了 0.7^^2% ;表观能量利用率提高了 2. 1%，蛋白质表观利用率提高了 6.6%。本发明的 木聚糖酶可有效提高饲料中营养物质的利用率，从而节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。
图1 :PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。图2 :毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳图，箭头所指处为重组木聚糖酶。图3 :重组木聚糖酶的作用pH-相对酶活曲线。图4 :重组木聚糖酶的作用温度-相对酶活曲线。
具体实施例方式下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1烟曲霉木聚糖酶基因的克隆1.1引物设计根据NCBI GenBank号为XM746007.1上基因序列设计引物，上游引物为5’AAATACGTAACACCCGGCTCGGAGCAATAC 3’ ；下游引物为5’ AAGCCTAGGCTAAAAACAGTGATAGTAGC 3，。1. 2目的基因ZHEl的PCR扩增以烟曲霉基因组cDNA为模板，利用上下游引物进行扩增，扩增条件为94°C预变性4min，94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸40s，30个循环后，72°C延伸lOmin。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为ZHE1，琼脂糖凝胶电泳(图1)分析显示，产物大小为609bp。1.3目的基因测序验证将扩增产物ZHFl克隆至pMDlS-T载体，送至北京华大基因测序中心进行测序，测得ZHFl的核苷酸序列为SEQ ID NO :2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO :1。通过NCBI同源序列比对，确定扩增的基因为木聚糖酶基因。实施例2毕赤酵母工程菌的构建2.1表达载体的构建将扩增得到的木聚糖酶基因ZHEl片段，用快速限制性内切酶Avrll、SnaBI进行双酶切，IOOuL 酶切体系为PCR 产物 30uL, IOXbuffer IOuL, AvrII5uL, SnaBI 5uL, ddH2050uL。37°C酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收片段。将表达载体pPIC9k用快速限制性内切酶AvrI1、SnaBI进行双酶切，IOOuL酶切体系为载体 25uL，IOXbuffer IOuL，AvrII 5uL, SnaBI 5uL, ddH20 55uL。37°C酶切 2h 后，琼脂糖胶电泳回收片段。将经限制性内切酶AvrII和SnaBI双酶切的ZHEl片段和pPIC9k载体相连接构 建表达载体pPIC9k-ZHEl。12uL连接体系为ZHE1片段为3. 5uL，pPIC9k载体为6. 5uL，10XT4DNA ligase bufferl. 2uL, T4 DNA ligase O. 8uL。22 °C 连接 5Η，转化大肠杆菌DH5 α，涂布含氨苄青霉素终浓度100ug/mL的LB平板，37°C过夜培养。挑取转化子测序验证，测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37°C过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒PPIC9K-ZHE1。2. 2毕赤酵母工程菌的构建及验证将pPIC9K-ZHEl用PmeII进行线性化，线性化片段用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株。挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养Id后，再转入BMMY培养基中，30°C，250rpm振荡培养，每天添加O. 5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图2所示，工程菌表达的木聚糖酶分子量为20kDa左右，图2中箭头所指处即为重组木聚糖酶。将该阳性转化子命名为毕赤酵母ZHEl (Pichia pastoris ZHE1)，并于2012年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2012504。将上清液进行木聚糖酶活力测定，结果显示，摇瓶水平下保藏的工程菌中木聚糖酶的表达量达到277U/ml，从而证明该菌株能够高效的表达重组木聚糖酶。而且，连续传代也没有出现转入的载体丢失的现象。酶活力检测方法取2ml浓度为I %的木聚糖底物(pH5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml经pH5. 5乙酸乙酸钠缓冲液适当稀释并经37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37°C精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AF。酶活单位定义在37°C、pH值为5. 5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放
Iμ mol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。酶活计算公式
.[(/], — Ar ) X K + I ,, ,xlF iX N X 1000
Mxt
式中XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml ;AF为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；(；为标准曲线的截距；Μ为木糖的摩尔质量，150. 2g/mol ；t为酶解反应时间，min ;N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，Immol=IOOO μ mol。实施例3木聚糖酶的酶学性质测定3.1最适反应pH的测定采用pH值分别为2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，
将发酵的上清液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应PH值的缓冲液配制，在37°C下分别进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明的重组木聚糖酶最适反应pH值为6. 0，为酸性木聚糖酶。3. 2最适反应温度的测定在ρΗ5· 5 条件下，分别测定 30°C、35 V、40°C、45 V、50°C、55 V、60 V、65 V温度时
发酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度相对酶活曲线。结果如图4所示，本发明生产的木聚糖酶最适反应温度为55°C。3. 3温度耐受性测定用PH5. 5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释发酵上清液，木聚糖底物也用对应pH值的缓冲液配制。在651、701、751下分别处理21^11和5min，然后在37°C，pH5. 5的条件下测定酶活，以未处理的酶活为100%，计算相对酶活。结果如表I所示，65°C处理2min后，木聚糖酶的残余酶活为22. 61%，70°C处理2min后，残余酶活为5. 08%，75°C处理后，无酶活。表I重组木聚糖酶温度耐受性检测表
权利要求
1.一种木聚糖酶，其特征在于 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的木聚糖酶； 2)在SEQID NO:1中限定的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有烟曲霉的木聚糖酶功能的，由SEQ ID N0:1衍生的蛋白质。
2.用于编码权利要求1所述的木聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQID N0:2。
3.用于表达权利要求1所述的木聚糖酶的重组表达载体；所述的重组表达载体携带有序列为SEQ ID NO:2的编码基因。
4.一种用于表达权利要求1所述的木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，其保藏编号为CCTCCNO: M2012504。
5.权利要求4所述的毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的应用。
全文摘要
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种木聚糖酶及其重组表达工程菌。本发明通过将烟曲霉的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到毕赤酵母工程菌，保藏编号为CCTCC NO: M 2012504。该工程菌能高效分泌表达木聚糖酶，摇瓶发酵酶活高达277U/mL。重组木聚糖酶在中性偏酸性范围内具有较高的酶活，最适pH值为6.0，在pH 5.0-7.0的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为55℃，在温度40-60℃的范围内，能保持50%以上的活性。本发明的重组木聚糖酶可广泛用作饲料添加剂，能有效提高营养物质的利用率。
文档编号C12N1/19GK103013958SQ20121056284
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者肖志壮, 张霞, 王海, 李冬冬 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司