专利名称：一种重组表达质粒及其在制备抗肿瘤免疫基因治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域中的基因药物，特别是涉及一种可激活机体免疫反应并具有抗肿瘤效果的抗肿瘤免疫基因治疗药物。
背景技术：
恶性肿瘤的免疫耐受除了与肿瘤细胞本身特征性低表达主要组织相容性抗原和协同刺激分子如B7. I、CD86等外，还与肿瘤所处的微环境有密切关系。在肿瘤微环境中存在大量免疫抑制性细胞因子如IL-10、肿瘤生长因子β等，肿瘤细胞正是通过微环境中细胞因子网络的调节来逃避抗肿瘤免疫反应(Coussens LM, Werb Z. Inflammation andCancer[J]. Nature,2002,420(6917) :860-7 ；6abrilovich D. Mechanisms and functionalsignificance of tumour-induced dendritic-cell defects[J]. Nat Rev Tmmunol,2004,4(12) :941-52.)。因此，可以通过改变肿瘤微环境中的细胞因子来影响肿瘤的免疫微环境，诱导机体产生抗肿瘤细胞的免疫反应。肿瘤的免疫基因治疗就是基于以上原因逐步发展起来的。免疫基因治疗实际上是递送某些细胞因子基因或共刺激分子基因进入肿瘤细胞或体细胞内，通过这些基因在体内的表达来影响肿瘤细胞的免疫微环境，激发或调动机体免疫功能从而控制或杀伤肿瘤细胞。因此，免疫基因治疗因为其良好的安全性和有效性已成为肿瘤免疫治疗研究中的常用方法。人们对肿瘤的免疫基因治疗已经进行了大量的研究，最初选择单一的细胞因子基因介导免疫治疗，之后逐步向具有协同作用的免疫调节因子基因联合应用的方向发展(Tatsumi T, Takehara T, Kanto T, et al. B7-1 (CD80)-gene transfer combinedwith interleukin_12administration elicits protective and therapeuticimmunity against mouse hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1999,30(2)422-9. ；Hofbauer GF, Baur T, Bonnet MC, et al. Clinical phase I intratumoraladministration of two recombinant ALVAC canarypox viruses expressing humangranulocyte-macrophage colony-stimulating factor or interleukin-2 thetransgene determines the composition of the inflammatory infiltrate [J].Melanoma Res，2008，18 (2) :104-11.)。其中，可用于免疫调节因子基因联合应用的研究有B7. I与IL-12在小鼠模型中能够产生抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤细胞生长(Tatsumi T, Takehara T, Kanto T, et al. B7-1 (CD80)-gene transfer combined withinterleukin-I2administration elicits protective and therapeutic immunityagainst mouse hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology,1999,30 (2) :422-9. ；LeeYS, Kim JH, Choi KJ, et al.Enhanced antitumor effect of oncolytic adenovirusexpressing interIeukin-I2and B7—1 in an immunocompetent murine model.Clin Cancer Res. 2006 Oct I ；12(19) :5859-68.) ；GM-CSF 和 IL-2 联合应用能够在局部产生生物学和免疫学效果(Hofbauer GF, Baur T, Bonnet MC, et al. Clinicalphase I intratumoral administration of two recombinant ALVAC canarypoxviruses expressing human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor orinterleukin-2 the transgene determines the composition of the inflammatoryinfiltrate. Melanoma Res. 2008 ；18(2) :104-11. )GM_CSF 与 B7. I 联合应用能够诱导产生更强的抗肿瘤免疫反应(Choi KJ, Kim JH, Lee YS, et al. Concurrent delivery ofGM-CSF and B7—1 using an oncolytic adenovirus elicits potent antitumor effect.Gene Ther. 2006Jul ；13(13) :1010-20. ；Sumimoto H, Tani K, Nakazaki Y, et al. GM-CSFand B7~l (CD80)co-stimulatory signals co-operate in the induction of effectiveanti-tumor immunity in syngeneic mice[J].Int J Cancer,1997,73 (4) :556-61.)；病毒载体形式的IL-12和GM-CSF基因联合不仅能够发挥协同作用产生更强的抗肿瘤免疫还能够预防胸腺萎缩(Zhang SN, Choi IK, Huang JHChoi KJ, et al. OptimizingDC vaccination by combination with oncolytic adenovirus coexpressingIL-12and GM-CSF. Mol Ther. 201IAug ；19(8) :1558-68. Zhang SN, Choi IK, Kim JS，YunCO.Strengthening of antitumor immune memory and prevention of thymic atrophymediated by adenovirus expressing IL_12and GM-CSF. Gene Ther. 201IOct 13. [Epub ahead of print])。虽然文献已证实IL_12，GM_CSF和B7. I其中两两之间可以分别联合应用，但显然其较更多细胞因子的联合应用仍有局限性，而寻找更多因子联合应用以及联合方式是研究者的新课题。
发明内容
本发明目的在于提供一种使用多细胞因子进行免疫调节的重组表达质粒及其应用，例如提供一种可激活机体免疫反应并具有抗肿瘤效果的抗肿瘤免疫基因治疗药物。本发明提供的重组表达质粒，其同时携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因。其中所述人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因在载体中的位置为自上游至下游依次为人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，所述GM-CSF基因与B7. I基因通过linker相联构成融合基因，并通过IRES序列与IL-12基因相连。用于构建所述重组表达质粒的出发载体为任意一种可在哺乳动物表达外源基因的真核表达载体，如 pVAXl、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP_Nl (ClonTech公司)、pCMV (Stratagene 公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI-neo (Promega公司)、pPICZ a、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)。WpVAXl为出发载体构建的携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重组表达质粒命名为pVAX-IL-12-GB。本发明所提供的抗肿瘤免疫基因治疗药物，其活性成分为上述携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重组表达质粒。在所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂。本发明同时提出利用前述重组表达质粒制备肿瘤免疫基因治疗药物的方案。采取以上技术方案，本发明的有益效果
本发明抗肿瘤免疫基因治疗药物的活性成分为命名为pVAX-IL-12-GB的重组表达质粒，是将人IL-12、GM-CSF和B7. I三种免疫调节因子基因克隆到同一质粒DNA载体PVAXI中，通过内部核糖体进入位点(IRES)实现上、下游基因的共同表达，将该载体导入宿主，能够同时表达人免疫调节因子IL-12、GM-CSF和B7. 1，这是因为IRES序列可以使上、下游两个基因翻译在同一条mRNA，因而表达出的蛋白在时间和空间上接近，人IL-12基因位于IRES的上游，融合基因GM-CSF-B7. I位于IRES下游，在GM-CSF和B7. I两种蛋白间加入一个表达8肽的I inker,可以被细胞内一种普遍存在蛋白酶-furin识别并切断,使GM-CSF和B7. I分子分离，从而不影响它们的空间构象，以利于发挥各自的生物学效应。实验证明，本发明药物的活性成分IL-12、GM-CSF和B7. I三种免疫调节因子基因可在真核细胞内的表达，同时采用电穿孔的方式注射小鼠证实其可以在活体内表达。本发明是一种新型抗肿瘤免疫基因治疗剂，多种抗肿瘤免疫调节因子联合应用，能够发挥彼此间的协同刺激作用，更好的诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，为进一步开展肿瘤免疫基因治疗研究 奠定了坚实的基础，应用前景广阔。
图I为重组表达质粒pVAX-IL-12-GB的双酶切和PCR鉴定结果图2为转染有质粒pVAX-IL-12-GB的293T细胞的IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因的mRNA表达水平检测结果图3为转染有质粒pVAX-IL-12-GB的293T细胞的IL-12基因基因的蛋白表达水平的ELISA检测标准曲线和检测结果图4为检测转染有质粒pVAX-IL-12-GB的细胞的GM-CSF基因的蛋白表达水平的ELISA检测标准曲线和检测结果图5为转染有质粒pVAX-IL-12-GB的细胞中B7. I的蛋白表达水平的流式细胞术检测结果图6为转染有质粒pVAX-IL-12-GB的细胞中B7. I的蛋白表达水平的荧光显微镜下图片图7为质粒pVAX-IL-12-GB通过电穿孔递送后动物体内表达验证的免疫组化染色
结果
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I、重组表达质粒pVAX-IL-12-GB的制备本发明抗肿瘤免疫基因治疗药物的活性成分为携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重组表达质粒pVAX-IL-12-GB，在该质粒中，人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因在载体中的位置为自上游至下游依次为人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，所述GM-CSF基因与B7. I基因通过linker相联构成融合基因(GM-CSF-B7. I)，并通过IRES序列与IL-12基因相连，即自IRES上游为IL-12基因、IRES下游为融合基因GM-CSF-B7. I。质粒的构建方法如下将含有人IL-12基因的pCI-IL-12质粒(构建方法参见文献王伟，高江平，于继云等.人白细胞介素12双亚基共表达pVAXl-IRES-hIL12载体的构建与表达[J].军医进修学院学报，2010，31 (6) 600-3)先用 BssHII 酶(New England Biolabs 公司)单酶切，Klenown I 酶(New England Biolabs 公司)补平回收后再用 Nhe I 酶(New EnglandBiolabs公司)单酶切，得到一平一粘的人IL-12基因片段，将携带IRES序列和由GM-CSF基因和B7. I基因组成的融合基因GM-CSF-B7. I (该融合基因是将GM-CSF基因与B7. I基因是通过linker相联构成的，linker序列为GGCGGCAGGGGTCGACGCGGCGGC(序列表中序列I))的载体pVAX-IRES-GM-CSF-B7. I (简称pVAX_IRES_GB，构建方法参见文献刘宁，阎瑾琦，冉多良等.肿瘤基因疫苗免疫增效载体PVAX1-IRES-GM/B7的构建与表达[J].军事医学科学院院刊，2008，32 (3) =249-52)先用Cla I酶单酶切，再用Klenown I酶补平后用NheI酶单酶切得到一平一粘的载体片段，最后将两个片段用T4DNA连接酶(TaKaRa公司或New England Biolabs)连接后转化入E. coli. DH5 α感受态大肠杆菌,用含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养平板进行筛选，挑取阳性克隆，提质粒(用北京三博远志生物技术有限公司的质粒小量提取试剂盒)，用限制性内切酶Nhe I和Pme I进行双酶切鉴定，鉴定结果如图I所示(Ml. DNA Marker (DL 5000) ；1.质粒 pVAX-IL_12_GB ;2·质粒 pVAX-IL_12_GB 的 Nhe I 和Pme I双酶切产物；M2. DNA Marker (DL 2000))，经酶切获得了 4000bp的通过IRES序列相连的IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的融合基因(GM-CSF-B7. I)片段和3000bp的载体片段，与预期结果相符，再对IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的融合基因(GM-CSF-B7. I)片段进行PCR鉴定，IL-12基因的PCR鉴定引物为上游引物Fl :5’-ATCGATCTAGCCACCATGGAGACAGAC-3’(序列表中序列 2)和下游引物 Rl :5’-GCGCGCTAACTGCAGGGCACAGATGC-3’(序列表中序列3) ,GM-CSF基因和B7. I基因的融合基因(GM-CSF-B7. I)的PCR鉴定引物为上游引物F2 5，-ATGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGC-3 ’(序列表中序列 4)和下游引物R2 5，-TTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTCAATCTC-3 ’(序列表中序列 5)(所用 PCR 弓丨物均由Invitrogen公司合成)，PCR反应条件为先94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环。PCR鉴定结果如图I所示(Ml. DNA Marker (DL5000) ；1.质粒 pVAX-IL-12-GB ;3. IL-12 基因的 PCR 鉴定结果；M2. DNA Marker (DL 2000)),PCR可以扩增出1800bp的IL-12基因片段和1200bp的GM-CSF-B7. I融合基因片段，与预期结果相符，表明经扩增依次获得了 1800bp的IL-12基因片段和1200bp的GM-CSF基因和B7. I基因融合基因(GM-CSF-B7. I)片段，与预期结果相符，最后将经酶切鉴定和PCR鉴定正确的阳性克隆质粒送英骏生物技术公司进行测序分析，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的依次携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，并且GM-CSF基因和B7. I基因构成融合基因(GM-CSF-B7. I)，并通过IRES序列与IL-12基因相连的重组表达质粒，命名为pVAX-IL-12-GB，即为本发明所述抗肿瘤免疫基因治疗药物的活性成分。本实施例构建的pVAX-IL-12-GB质粒，特别设计使用IRES序列以使上、下游两个基因翻译在同一条mRNA，人IL-12基因位于IRES的上游，融合基因GM-CSF-B7. I位于IRES下游，因而使表达出的蛋白在时间和空间上接近；在GM-CSF和B7. I两种蛋白间加入一个表达8肽的I inker,可以被细胞内一种普遍存在蛋白酶-furin识别并切断，使GM-CSF和B7. I分子分离，从而不影响它们的空间构象，以利于发挥各自的生物学效应。本申请以后续试验验证该pVAX-IL-12-GB质粒设计的独特性和有效性。实施例2、检测转染有质粒pVAX-IL-12-GB的细胞中IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因的表达水平一、将pVAX-IL-12-GB重组表达质粒转染293T细胞将转染有pVAX-IL-12-GB重组表达质粒的阳性克隆菌液接种于200mL LB液体培养基中，在37°C下培养200rpm振荡12小时，大量提取pVAX_IL-12_GB超纯质粒(用天根生化科技公司的无内毒素质粒大量提取试剂盒)，取对数生长期的293T细胞提前I天分到六孔板中，第2天长至60%-70%时,用转染试剂Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)将pVAX-IL-12-GB超纯质粒转染293T细胞，6小时后更换有10%胎牛血清的1640完全培养基 (Gbico公司产品)，以转染pVAXl空载体质粒(Invitrogen公司产品)为空白对照，每种质粒两个复孔，5% C02、37°C继续培养48小时。二、转染有质粒pVAX-IL-12-GB的293T细胞的IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因的mRNA表达水平检测吸取转染后48小时的细胞上清,按照每孔O. 5mL加入Trizol (Invitrogen公司产品)，一步法提取细胞总RNA，以提取的细胞总RNA为模板，逆转录合成其cDNA (用东洋纺公司逆转录试剂盒)，再以合成的cDNA为模板，对IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因进行PCR扩增，以检测IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因在293T转染细胞中的表达水平，IL-12基因的PCR鉴定引物为上游引物Fl 5’ -ATCGATCTAGCCACCATGGAGACAGAC5-3’ 和下游引物 Rl 5，-GCGCGCTAACTGCAGGGCACAGATGC-3，，GM-CSF-B7. I 融合基因(GM-CSF-B7. I)的PCR 鉴定引物为上游引物 F2 :5 ’ -ATGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGC-3，和下游引物 R2 :5’ -TTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTCAATCTC-3’ (所用 PCR 引物均由 Invitrogen 公司合成)，PCR反应条件为先94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸lmin，共25个循环。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(M.DNA marker(DL2000)l.RT-PCR鉴定IL-12基因的转录转染pVAX-IL-12-GB的293T细胞；2. RT-PCR鉴定IL-12基因的转录转染pVAX的293T细胞；3. RT-PCR 鉴定 GM-CSF-B7. I 融合基因的转录转染 pVAX-IL_12_GB 的 293T 细胞；4. RT-PCR鉴定GM-CSF-B7. I融合基因的转录转染pVAX的293T细胞)，经扩增获得了 1800bp的IL-12基因片段和1200bp的GM-CSF-B7. I融合基因片段，与预期结果相符，表明转染有质粒pVAX-IL-12-GB的293T细胞的IL-12基因和GM-CSF-B7. I融合基因在mRNA水平获得表达。三、ELISA法检测转染有质粒pVAX_IL-12_GB的细胞中IL_12、GM_CSF的蛋白表达水平吸取转染后48小时的细胞上清，4°C、3000r/min离心20min，吸取上清分装。根据预实验的结果将上清稀释100倍和200倍后用于检测IL-12的分泌表达水平，将上清稀释5倍和10倍后检测GM-CSF的分泌表达水平，用人IL-12和人GM-CSF的ELISA检测试剂盒(北京奇松生物有限公司产品)分别检测人IL-12和人GM-CSF的表达水平，显色后用Bio-RAD酶标仪450nm读取OD值，根据标准品检测结果绘制标准曲线。其中，人IL-12的表达水平标准曲线如图3所示(a. IL-12ELISA检测标准曲线；b.转染后细胞上清中IL-12的浓度)，人GM-CSF的表达水平标准曲线如图4所示(a. GM-CSFELISA检测标准曲线；b.转染后细胞上清中GM-CSF的浓度)，统计分析得到浓度与OD值的线性关系人 IL-12 为 y = 23. 31x (R2 = O. 989)，人 GM-CSF 为 y = 311. 5x (R2 = O. 994)。根据以上公式，可以计算出人IL-12在转染重组质粒和转染空载体的细胞上清中的含量分别为 3930. 65 (±59. 04)pg/mL 和 396. 85 (±30. 47)pg/mL，统计分析两组细胞上清中人 IL-12含量存在明显差异(P < O. 01)，人GM-CSF的转染重组质粒pVAX-IL-12-GB和空载体pVAX的细胞上清中含量分别为1921. 17 (±26. 72)pg/mL和329. 03 (±28. 10)pg/mL，统计分析细胞上清中人IL-12和人GM-CSF含量，结果转染pVAX-IL-12-GB质粒的细胞上清中人IL-12、人GM-CSF表达量与转染空载体组细胞上清中的表达量存在显著差异(P < O. 01)，表明人IL-12、人GM-CSF在转染有pVAX_IL-12_GB载体的细胞中获得高水平表达。
四、流式细胞术检测转染有质粒pVAX-IL-12-GB的细胞中B7. I的蛋白表达水平B7. I基因位于融合基因的下游，可以锚定在细胞膜上，可通过流式细胞学和免疫荧光检测B7. I分子在细胞膜上的表达水平，方法为0. 5%胰酶消化细胞，预冷的含有2%新生牛血清的PBS洗涤细胞两次，加入I 100稀释的FITC标记的抗B7. I的抗体(eBioscience公司产品)200μ I重悬细胞，4°C避光孵育I小时后，PBS洗涤细胞2遍，500 μ I重悬细胞，分别进行流式细胞学检测和荧光显微镜观察。其中，Β7. I蛋白表达水平的流式细胞术检测结果如图5所示(a.转染pVAX空质粒细胞；b.转染pVAX-IL-12-GB质粒细胞)，流式细胞学检测表达B7. I蛋白的细胞量可达20%，与转染空载体的293T细胞存在明显差异；荧光显微镜下图片见图6所示(a.转染pVAX空质粒细胞；b.转染pVAX-IL-12-GB质粒细胞，X 40)，也可以见到表达下游B7. I基因的细胞发出绿色荧光，而转染pVAX空质粒的细胞无荧光染色。检测结果表明pVAX-IL-12-GB质粒转染293T细胞后，可以检测人IL_12、GM_CSF和B7. I三种免疫调节因子在同一真核表达载体中获得表达。五、pVAX-IL-12-GB质粒的递送和动物体内的表达验证将pVAX-IL-12-GB超纯质粒用PBS稀释到浓度为O. 5 μ g/ μ 1，按照50 μ g/100 μ I重组质粒PVAX-IL-12-GB注射入C57BL/6小鼠(来源于军事医学科学院动物中心)后腿股四头肌组织，随后即用BTX公司ECM-830型电穿孔导入仪在注射部位施以电压刺激，电脉冲条件为180V，25ms，间隔6ms，IHzX6次，以pVAX空质粒作为对照。48小时后颈椎脱臼法处死小鼠，手术剥取小鼠免疫部位肌肉组织，立即将其放置于4%多聚甲醛溶液中进行组织固定，组织固定后7天，石蜡包埋固定切片，将制备好的石蜡切片进行免疫组化染色，用兔抗人IL-12多克隆抗体和“二步法免疫检测试剂”(中杉金桥生物技术有限公司产品)对免疫小鼠的肌肉组织切片进行染色。检测结果如图7所示(a.电穿孔注射pVAX质粒小鼠肌肉组织免疫组化检测；b.电穿孔注射pVAX-IL-12-GB质粒小鼠肌肉组织免疫组化检测，X 20)，注射pVAX_IL-12_GB质粒的小鼠肌肉组织内可以观察到大量棕褐色阳性颗粒(一所指向的褐色颗粒，这些褐色颗粒是基因表达后人IL-12抗体免疫组化染色的阳性结果，而注射pVAX空载体的小鼠肌肉组织内未能检测到明显阳性表达，实验结果表明电穿孔的方法可以有效地将免疫基因治疗剂pVAX-IL-12-GB递送到小鼠体内，并且该免疫基因治疗剂也可以在小鼠活体内成功表达。本实施例充分证实了实施例I构建的pVAX-IL-12-GB质粒能够同时表达人免疫调节因子IL-12、GM-CSF和B7. I。本发明将三者构建到同一载体中实现其共同表达，可以实现三者协同作用从而诱导更强的抗肿瘤免疫反应，针对肿瘤、慢性感染性疾病这些病因复杂或由多基因控制的疾病，本发明多基因联合应用的效果显然较依靠单一因子或两种因子联用效果要优异；另一方面，文献(参见背景技术中的介绍)证实了 IL-12，GM-CSF和B7. I两两之间分别联合均可以发挥协同作用，增强彼此抗肿瘤免疫反应，其作用效果能够互相促进，未见相互之间作用抵消或产生负效应的报道，而本发明中细胞因子之间的连接物也是在生物制药领域中经过证实有效可用的生物材料，由此可以确证本发明提供的pVAX-IL-12-GB质粒作为抗肿瘤免疫基因治疗药物应该是安全和有效的。免疫基因治疗通过细胞因子以及共刺激分子等基因直接在宿主细胞内表达和加工，从而完整地保留了表达产物的天然结构和生物活性。细胞因子基因在体内持续分泌和/或共刺激分子基因在免疫活性细胞或肿瘤细胞表面的持续表达，能够改变肿瘤细胞周围的 免疫微环境，诱导机体产生抗肿瘤免疫反应。与此同时克服了细胞因子直接注射需要反复多次给药以及引起严重的全身副反应等缺点。免疫基因治疗因为其良好的安全性和有效性已成为肿瘤免疫治疗研究中的常用方法。
权利要求
1.一种重组表达质粒，其同时携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因。
2.根据权利要求I所述的重组表达质粒，其特征在于所述人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因在载体中的位置为自上游至下游依次为人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，所述GM-CSF基因与B7. I基因通过linker相联构成融合基因，并通过IRES序列与IL-12基因相连。
3.根据权利要求2所述的重组表达质粒，其特征在于用于构建所述重组表达质粒的出发载体为任意一种可在哺乳动物表达外源基因的真核表达载体，如pVAXl、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP-Nl (ClonTech 公司)、pCMV (Stratagene公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI-neo (Promega 公司)、pPICZ a、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)。
4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于以pVAXl为出发载体构建的携带人免疫调节因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重组表达质粒命名为pVAX-IL-12-GB。
5.一种抗肿瘤免疫基因治疗药物，其活性成分为权利要求I至4任一所述的重组表达质粒。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤免疫基因治疗药物，其特征在于在所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂。
7.权利要求I至4任一所述重组表达质粒在制备肿瘤免疫基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可激活机体免疫反应并具有抗肿瘤效果的抗肿瘤免疫基因治疗药物。本发明抗肿瘤免疫基因治疗药物的活性成分为pVAX-IL-12-GB，是将人IL-12，GM-CSF和B7.1三种免疫调节因子基因克隆到同一质粒DNA载体pVAX1中，通过内部核糖体进入位点(IRES)实现上、下游基因的共同表达，将该载体导入宿主，能够同时表达人免疫调节因子IL-12、GM-CSF和B7.1。本发明是一种新型抗肿瘤免疫基因治疗剂，多种抗肿瘤免疫调节因子联合应用，能够发挥彼此间的协同刺激作用，更好的诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，为进一步开展肿瘤免疫基因治疗研究奠定了坚实的基础，应用前景广阔。
文档编号C12N15/85GK102776235SQ20121006555
公开日2012年11月14日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者于继云, 张亮, 徐元基, 王伟, 董金凯, 阎瑾琦 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所