药物级别质粒dna的制备方法

专利名称：药物级别质粒dna的制备方法
技术领域：
本发明涉及高度纯化的质粒DNA(pDNA)的制备，具体地涉及用于基于质粒的治疗中的药物级别质粒DNA的生产和分离。
背景技术：
分子生物学方面的发展清楚地表明，基于质粒的治疗，具体是在疫苗和人类基因治疗领域，是治疗疾病的有效的途径。然而，这种技术的显著障碍是寻找有效的途径来将目的基因递送到细胞中。安全和有效地将正常基因递送到人类细胞中的一种有前途方法是通过质粒DNA。质粒DNA是封闭的、环形的细菌DNA，目的DNA序列可以被插入其中。一旦被递送给人类细胞，pDNA开始复制并产生插入的DNA序列的拷贝。因而，研究人员将质粒DNA视为有前途的赋形剂，用于将正常基因递送到人类细胞内来治疗各种疾病状态。
实现这种新技术的研究开发和人类治疗需要大量的质粒DNA。由于用于基因治疗和其他临床应用的质粒DNA通常通过例如大肠杆菌(Escherichiacoli)(E.coli)的细菌产生，需要一些方法来从细菌细胞的基因组DNA(gDNA)，以及细菌细胞中的内毒素和蛋白中有效地分离质粒DNA。因而，对于可用于从细菌细胞分离大量质粒DNA的，简单、耐用和可扩大规模的(scalable)的纯化过程，存在着不断增长的需求。
在任何质粒纯化过程中的一个重要步骤包括裂解细菌细胞以释放细胞内容物，然后可以从中分离pDNA。实际上，首先必需的是实现细胞重悬浮、细胞裂解、和宿主污染物的中和与沉淀这三个步骤。细胞重悬浮通常利用人工搅动或磁性搅拌器，和匀浆器或叶轮混合器，以将细胞重悬浮在重悬浮缓冲液中。细胞裂解可以通过人工涡旋或磁力搅拌来进行，以将重悬浮的细胞与裂解溶液(由稀释的碱(alkali)(碱(base))和洗涤剂组成)混和；然后将混合物保持在室温(20-25摄氏度)或冰上保持一段时间，例如5分钟，以完全裂解。如上所述，人工涡旋和磁力搅拌不是可扩大规模的。第三个阶段是宿主污染物的中和与沉淀。来自第二阶段的溶胞产物通常通过温和的涡旋或磁力搅拌与冷中和溶液混和以酸化溶胞产物，之后置于冰上10-30分钟以促进高分子量染色体DNA、宿主蛋白和其他宿主分子的变性和沉淀。人工涡旋和磁力搅拌都不是可扩大规模的。
一般地，通过用溶菌酶短时间处理或经由碱或乙酸钾(KOAc)处理来消化细胞壁。一般还添加RNase来降解细菌悬浮液的RNA。这些化学步骤在小规模地裂解细胞方面可能是有效率的。然而，粘度的增加使得大规模加工非常困难。制备质粒的可选简单且快速的方法包括细菌的溶菌酶处理，然后在约100℃在合适的缓冲液中煮沸20到40秒，形成不溶的基因组DNA、蛋白和碎片的不溶块，将质粒留在溶液中，带有RNA作为主要污染物。然后，添加NaOH和十二烷基磺酸钠(SDS)的混合溶液，目的是溶解细胞质膜。NaOH部分地使DNA变性和部分地降解RNA，SDS起作用来溶解膜并使蛋白变性。接着，通过添加5N乙酸钾(pH 4.8)来沉淀SDS-蛋白质复合物和细胞碎片。此时，pH对于中和所述操作中使用的NaOH和使质粒复性都是很重要的。然而，这种技术不适合于扩大到大体积的细菌发酵，仅适用于低于五升的发酵。此后，使用离心来除去沉淀，从而在上清液中获得目的质粒。并且，这些系列操作需要缓慢和稳定地混合，以避免细菌染色体DNA被切断成小的片段和聚集物，使得它们污染质粒，并且难以实现大规模的加工。
裂解细胞的一种常见替换性方法，被称为碱裂解，包括将细菌细胞的悬浮液(溶液1)与碱性裂解性溶液(溶液2)混合。溶液2由洗涤剂和碱组成，用裂解细菌细胞并释放细胞内物质的洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)以及用以使细胞的蛋白质和核酸(具体是gDNA和RNA)变性的碱例如氢氧化钠。由于细胞裂解和DNA变性时，溶液的粘度显著地升高。在变性之后，添加酸性溶液，例如乙酸钾(溶液3)以中和氢氧化钠、诱导核酸的复性。gDNA的长片段随机地重结合，并形成网络，作为絮状物、捕集蛋白(entrappingprotein)、脂质和其他核酸沉淀出来。十二烷基硫酸盐的钾盐也发生沉淀，带走与之结合的蛋白。pDNA(质粒DNA)的两条链互相缠绕，通常重结合形成初始质粒，保持在溶液中。
现有技术一般按照分批模式描述这种裂解技术，即，通过次序性地将溶液添加到容器或槽中来混合不同的溶液。因为碱性的溶胞产物是非常难以操作的粘弹性流体，这种方法的一个困难在混合不同溶液期间产生。由于剪切应力引起gDNA的段裂，然后它将变得极难从pDNA重分离，需要一些方法来避免对流体施加剪切应力。此外，大的pDNA(即，大于约10千碱基对)在混合过程期间也对剪切破坏敏感。在含有细胞悬液的溶液与裂解溶液混合之后，粘弹性的碱性溶胞产物与中和溶液混合。再一次，由于溶液的粘弹性质，这个混合过程是成问题的。
此外，在扩大分批裂解处理的规模的另一个难处包括在尝试限制剪切应力以避免片段化gDNA时混合不同液体的效率。如早先说明的，片断化的基因组DNA的色谱性状与pDNA的非常相似，使得它实际上不可能通过标准纯化过程来去除。因而，使用分批处理来裂解细菌细胞的几种局限性是明显的，例如扩大规模，由于片断化的gDNA的污染回收的pDNA质量低，和获得的相对低数量的pDNA。
与分批方法相比，也已经提出了使用一系列静止混合器连续地混合各种细胞-裂解溶液的几种方法。根据这些方法，细胞悬浮溶液和细胞裂解溶液被同时添加到静止混合器。离开第一静止混合器的裂解细胞溶液，和沉淀溶液然后被同时添加到第二静止混合器。离开这个第二混合器的溶液含有沉淀的溶胞产物和质粒。裂解细胞的其他连续模式包括使用流通换热器(flow-through heat exchanger)，其中悬浮细胞被加热到70-100℃。在换热器中细胞裂解之后，排出流进行连续流动或分批式的离心，离心期间细胞碎屑和基因组DNA被沉淀，在上清液中留下质粒DNA。
从大体积的微生物发酵大规模分离和纯化质粒DNA因此需要开发改进的质粒制备过程。
尽管当前使用许多方法来裂解细菌细胞，它们都没有解决由液体的粘弹性质和混合步骤中涉及的剪切力引起的难题。因而本发明涉及大规模地连续碱裂解细菌细胞悬浮液的新方法，并在限制剪切力方面提供了主要的优点。
在质粒DNA制备中的另一个重要步骤是质粒分离(isolation)或分隔(separation)和纯化。从细菌发酵分离和纯化质粒DNA的传统技术适合于小的和实验室规模的质粒制备。在破坏含质粒的细菌宿主细胞之后，随后的醋酸盐中和引起的宿主细胞基因组DNA的沉淀，蛋白一般通过例如离心来除去。含有质粒DNA的液相用醇类沉淀，然后在存在溴化乙锭的情况下使用CsCl进行等密度(isopycnic)离心来分离各种形式的质粒DNA，即，超螺旋的、有缺口的环形的、和线性化的。在用醇类进行DNA沉淀之后需要用丁醇进一步提取来除去残余的溴化乙锭。随后进行其他的纯化步骤来除去宿主细胞蛋白。
这些用于分离质粒DNA的当前方法有几个限制。例如，涉及使用大量易燃有机溶剂(例如，乙醇和异丙醇)和有毒化学品，例如，溴化乙锭、苯酚和氯仿的纯化方法，对于质粒DNA的大规模分离和纯化一般是不合需要的。对氯化铯离心的替换性方法可被用于质粒DNA纯化，例如，空间排阻层析、羟磷灰石上的层析、和基于反相或阴离子交换的各种层析法。这些替换对于以实验室规模生产少量的研究材料可能是足够的，但是一般不是可容易地扩大规模的，并且不能生产大量的质粒DNA。
经过如上所述的一系列操作，有可能获得相对高纯度的质粒(此后，所述分离和纯化核酸的方法称为化学分离法)。然而，使用化学分离法，分离和纯化过程是复杂的，并且必需使用大量的有机溶剂，因此它引起废弃溶剂的处理及其他许多问题。
除了化学的分离和纯化方法之外，存在着通过电泳分离质粒的方法。电泳方法包括纸电泳和凝胶电泳，凝胶电泳是当前常用的。电泳方法在获得高纯度质粒方面具有优点，然而它具有长的分离时间、难以收集、低的样品载荷等等许多问题。因此，现状是，仅当希望进一步改善通过所述化学分离和纯化方法纯化的质粒级分的纯度时使用电泳分离。
用于分离两种形式的质粒DNA的当前可用的方法利用离子交换层析(Duarte et al.，Journal of Chromatography A，606(1998)，31-45)或空间排阻层析(Prazeres，D.M.，Biotechnology Techniques Vol.1，No.6，June 1997，p417-420)，伴随着使用添加剂，例如聚乙二醇(PEG)、洗涤剂，和其他成分，例如六胺钴、亚精胺、和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。然而，当前已知的方法不能提供有效率和有成本效益的超螺旋且有断口(或松弛)的DNA的分离。此外，许多已知的方法有使用PEG或其他添加剂的不利问题，在质粒DNA的制造中这可能是不期望的，因为它们需要额外的分离、清除和质量控制方法，这可能是困难的、更费时的和更昂贵的。分离超螺旋和松弛形式的质粒DNA的已知方法的其它形式利用非常昂贵的、专有的树脂，其在处理期间也利用了溶剂，例如乙腈、乙醇和其他成分，如三乙胺和四丁基胺磷酸盐。分离超螺旋和松弛DNA的其他方法依靠空间排阻层折，其涉及根据大小上的微小差异分离两种形式的质粒DNA。这些柱一般是相对长的，存在显著的难以扩大规模的问题，使得实现大规模生产不可行。此外，空间排阻方法需要浓缩的样品溶液，由于DNA的高粘性质，获得有质粒DNA的溶液是不可行的。质粒DNA制品是从细菌制品生产的，常常含有松弛和超螺旋质粒DNA的混合物，根据FDA的要求常常需要内毒素去除，因为已知许多细菌产生的内毒素在接受所述质粒DNA的宿主中引起炎症反应，例如发热或脓毒症(sepsis)。这些内毒素一般是脂多糖或其片段，是革兰氏阴性细菌的外膜的成分，存在于宿主细胞和的DNA制备物和寄主细胞膜或大分子中。因此在用于治疗或预防用途的质粒DNA的纯化中内毒素的去除是关键和必需的步骤。从质粒DNA溶液中去除内毒素主要使用内毒素的带负电结构。然而质粒DNA也是带负电的，因此分离通常用结合这两种分子的阴离子交换树脂来实现，在一定条件下，优选洗脱结合内毒素的质粒DNA。这种分离产生仅仅是部分的去除，因为显著数量的内毒素与质粒DNA一同洗脱，和/或实现非常少的质粒DNA回收。
从大体积的微生物发酵大规模分离和纯化质粒DNA因而需要开发改进的质粒制备方法。还需要以更简单的途径和在较短的时间分离和纯化大量质粒DNA的方法。对于基于质粒的研究和治疗也是合乎需要，核酸可以以可再现的方式被分离和纯化同时保持着相同结构，来避免混杂物对人体的副作用，核酸需要被分离和纯化到足够高的纯度。
然而，使用所述常规方法，存在着不能大量获得足够高纯度的核酸，具体是质粒DNA的难题。因此，本发明目标是提供利用至少两个层析步骤的分离方法，其能在较短的时间以最高的纯度级别分离大量的质粒DNA。
发明概述本发明基于生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法的发现。通过本发明的方法生产和分离的质粒DNA含有极低水平的污染性染色体DNA、RNA、蛋白和内毒素。根据本发明生产的质粒DNA具有足以用于基于质粒的治疗的纯度。
因而，本发明包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法，其包括细胞裂解的步骤，其中有(a)湍流设备(a means for turbulent flow)，以快速地混合细胞悬液与裂解细胞的溶液；和(b)层流设备(a means for laminar flow)，以允许基本没有搅动地保温(a)中形成的混合物，其中所述在(a)中形成的混合物从湍流设备流动到层流设备。
本发明的进一步的实施方式中，该装置(mechanism)可以另外包括添加用于中和所述裂解溶液的第二溶液的设备，其中在(b)中保温的混合物从所述层流设备流动到所述用于添加第二溶液的设备。
在另一个实施方式中，该装置可被用于从细胞分离质粒DNA的方法，包括(a)在所述湍流设备中混合所述细胞与碱性裂解性溶液(lysingsolution)；和(b)通过添加酸性溶液中和所述碱性裂解性溶液。
本发明进一步的包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法，所述质粒DNA基本上没有污染物并且因而是药物级别的DNA。
本发明的另一个目的涉及分离和纯化核酸和质粒DNA的方法。更详细地，其涉及分离对于研究和基于质粒的治疗有用的、药物级别的核酸和质粒DNA的方法。根据本发明的方法分离的质粒DNA制品可以进行至少包括三螺旋层析的纯化步骤，可以进一步包括阴离子交换层析和疏水性相互作用层析。
因而这些方法包括在此描述的连续碱裂解步骤与随后的阴离子交换层析和/或三螺旋层析，和/或进一步的疏水性相互作用层析组合。
因而这些方法还包括在此描述的连续碱裂解步骤与随后的组合形式的阴离子交换层析、三螺旋层析和疏水性相互作用层析步骤的组合。溶胞产物过滤或其他絮凝物去除可以先于第一层析步骤进行。
本发明的一个目的是最大化来自宿主细胞/质粒DNA组合的质粒DNA产量。
本发明的另一个目的是提供基本上没有细菌宿主RNA的质粒DNA制备物。
本发明的另一个目的是提供基本上没有细菌宿主蛋白的质粒DNA制备物。
本发明的另一个目的是提供基本上没有细菌宿主染色体DNA的质粒DNA制品。
本发明的另一个目的是提供基本上没有细菌宿主内毒素的质粒DNA制品。
本发明的另一个目的是提供制备用于研究和基于质粒的治疗的、高纯度的、药物级别质粒DNA的方法，并且其能扩大到大规模生产。
因而本发明包括基本上没有污染物、高纯度和完整的、比现有技术优越的药物级别质粒DNA，所述DNA包括载体主干、治疗基因和相连的调节序列。
本发明还涉及质粒DNA液体制剂，其在室温长时间是稳定的且保持不降解的，因而对于用于研究和相关人类治疗的质粒DNA的保存是有用的。
最后，本发明还涉及连续碱性细胞裂解装置，包括能以所述细胞悬液的相反方向注射碱性液体的第一混合器或注射器，小直径的第一管道以在混合物内产生湍流，大直径的第二管道以在混合物中产生层流，用于在一端注射中和溶液并在另一端收获混合物的第二混合器或注射器。
本发明的其他目的和益处将在随后的说明书中部分地阐述，在某种程度上根据说明书将变得更为明显，或可以从本发明的实践中习得。通过特别在附随的权利要求中指出的元素和组合的方式，将实现和达到本发明的目的和益处。
需要理解的是，以上的一般性说明和随后的详细说明都仅是示范性的和说明性的，而不是对本发明的限制，如所要求的。
附随的图，合并到本说明书中并作为本说明书的一部分，与说明书一同说明了本发明的一个(几个)实施方式，用来解释本发明的原理。
附图的简要说明

图1是可用于本发明的连续式细胞裂解的设备的示意图。
图2是在连续细胞裂解设备中混合器M1的示意图。
图3是使用单步的阴离子交换层析(AEC)、或阴离子交换层析与三螺旋亲和层析(THAC)组合的两步法，和包括组合形式的阴离子交换层析的步骤、三螺旋亲和层析的步骤和疏水性相互作用层析(HIC)的步骤的三步法，比较关于gDNA、RNA、蛋白质、内毒素污染物的纯化产量的表格，ND意思是未检出低灵敏度分析方法。
图4是比较分离和纯化质粒DNA的各种方法的表格，例如，单独的或组合的阴离子交换层析(AEC)、HAC、羟磷灰石层析(HAC)、疏水性相互作用层析(HIC)、反相层析(RPC)、空间排阻层析(SEC)、三螺旋亲和层析(THAC)，和根据本发明的方法。提供了关于纯化的质粒DNA质量的结果。ND，未检出(低灵敏度分析方法)。
图5A和5B是显示保存在+25℃和+5℃达90天的质粒DNA的脱嘌呤作用和断口速率(开放环形质粒形式的形成)的图。
定义酸性意思是涉及或含有酸；具有小于7的pH值。
碱性意思是涉及或含有碱或碱；具有大于7的pH值。
连续的意思是不中断，没有中断。
基因组DNA意思是来源于染色体或存在于染色体中的DNA。
层流意指溶液水的流动方面的流动类型，其中每个粒子(particle)按照与每个粒子平行的方向移动。
溶胞产物意指通过细胞裂解的处理产生的材料。术语裂解是指通过使用含裂解试剂的溶液进行化学处理，使缓冲溶液(即，细胞悬液)中的细胞的细胞壁和/或细胞膜破裂的行为。裂解试剂包括例如，碱、洗涤剂、有机溶剂和酶。在优选的实施方式中，进行细胞的裂解以从宿主细胞释放完整的质粒。
中和以实现(溶液)中性，或使得(酸或碱/碱)经历中和作用。通过这个术语，我们意指中和溶液使溶液的pH达到5和7之间的pH，优选的约7，或更优选的比以前更接近7的pH的情况。
牛顿流体是液体，其中剪切应力与速度梯度成正比，并垂直于剪切面。比例的常数被称为粘度。牛顿流体的实例包括液体和气体。
非牛顿流体是一种液体，其中剪切应力不与速度梯度完全成正比，并垂直于剪切面。非牛顿流体可能不具有明确的粘度。非牛顿流体包括塑性固体、幂律流体、粘弹性流体(兼备粘性和弹性特性)、和时间依赖性粘滞流体。
质粒DNA意指由不是染色体的DNA环组成的小的细胞内含物，其可能具有将非内源DNA片段插入其中的能力。构建质粒的方法包括在Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中描述的那些。
对本发明来说，术语流动是指通常通过泵的作用使液体以具体的流速(例如，升每分钟)通过混合器。应当注意到，通过混合器的流速被认为影响裂解、沉淀和混合的效率。
“断口”或“松弛”DNA是指不是超螺旋的DNA。“超螺旋”DNA是本领域公知的术语。
“污染混杂物”是希望从中隔离或分离出DNA的任何物质。污染混杂物包括，但不限于宿主细胞蛋白、内毒素、宿主细胞DNA和/或RNA。应理解，什么东西被认为是污染混杂物可以取决于有关实施本发明的方法的内容。污染混杂物”可以是、或可以不是宿主细胞衍生的，即，它可以是或可以不是宿主细胞混杂物。
“分离”或“纯化”第一成分(诸如DNA)是指从其他成分中富集所述第一成分，该第一成分最初与所述的其他成分一同存在。在此提供了期望的和/或可获得的纯化的程度。
术语基本上没有和高度纯化的被定义为约95％和优选的大于98.99％的纯度，或没有污染物，或具有低于5％，和优选低于1-2％的污染物。
药物级别DNA在此被定义为含有不超过约5％、和优选的不超过约1-2％的细胞成分，诸如细胞膜的DNA制品。
药物级别质粒DNA在此被定义为含有百万分率或ppm(＜0.0001％，即＜0.0001mg每100mg质粒DNA)的基因组DNA、RNA和蛋白污染物的DNA制备物。
更确切地说，药物级别质粒DNA在此是指含有低于约0.01％、或低于0.001％、和优选的低于0.0001％、或优选的低于0.00008％(＜0.00008％，即＜0.00008mg每100mg质粒DNA))的染色体DNA或基因组DNA的DNA制备物。
药物级别质粒DNA在此是指含有低于约0.01％、或低于0.001％、和优选的低于0.0001％、或优选的低于0.00002％(＜0.00002％，即＜0.00002mg每100mg质粒DNA))的RNA污染物的DNA制备物。
药物级别质粒DNA在此是指含有低于约0.0001％、和最优选的低于0.00005％(＜0.00005％，即＜0.00005mg每100mg质粒DNA)的蛋白质污染物的DNA制品。
药物级别DNA在此是指含有低于0.1EU/mg内毒素的DNA制品。
药物级别DNA在此是指优选的在形式上主要是环形的DNA，和更确切的说含有超过80％、85％、90％、95％，或超过99％的封闭环形质粒DNA。
T形管是指T形结构的管道，其中T形是单片管形材料(tubing)由按所述结构产生的，或组合一或多片管形材料以产生所述结构。T形管具有三个臂，和臂连于在其上的中心区域。T形管可用于混合成分，两个流体可以各自流入到T的臂之一中，在中性区域汇合，从第三臂流出。混合作为流体合并发生。
湍流意指流体粒子以横向通过主要流动方向的方向进行不规则随机运动，在给定点的速度在数值和方向上不定地变化。
粘弹性是指液体兼备粘性和弹性特性。
发明的详细说明本发明基于生产高产量的药物级别质粒DNA的规模可扩大的方法的发现。具体地，本发明基于使用宿主细胞的连续碱裂解制备和分离高度纯化的质粒DNA的方法的发现。
第一个步骤，接种宿主细胞，即在指数生长期用质粒DNA转化，并在含抗生素例如四环素LB培养基的平板上划线。然后将来自平板的单个菌落各自接种到独立的无菌塑料锥形烧瓶中补充有合适的抗生素四环素的20mlLB培养基中，在摇动保温器中在37度生长12-16小时。然后这些培养物之一被用于接种添加到2L锥形烧瓶中的200ml的无菌LB培养基。使其在摇动保温器上在37℃和200rpm生长，用于接种两个5L锥形烧瓶，在摇动保温器上在30℃和200rpm生长，5小时后、在2个单位的OD600nm下，当处于指数生长期中期时用于接种发酵容器。
宿主细胞培养和接种是本领域公知的。一般地，使宿主细胞生长直到它们达到高的生物量和细胞处于指数生长期，以具备大量的质粒DNA。可以使用两种不同的方法，即分批和补料-分批发酵。
分批发酵容许通过对生长温度和使用的碳源的操作来控制生长速率。如在此使用的，术语“分批发酵”是一种细胞培养过程，通过这种过程，用于细胞生长和制备包含在培养的细胞中的质粒的所需的所有营养物在接种时大量过量地存在于容器中(例如，比现有技术的营养物浓度过量10倍)，从而避免了在灭菌后添加之后向无菌容器中进行添加的需求，以及对复杂的补料模式和策略的需求。
根据本发明有用的另一种发酵类型是补料分批发酵，在其中通过在细胞生长期间向培养物中添加营养物来控制细胞生长速率。如在此使用的，“补料分批发酵”是指一种细胞培养过程，其中通过在发酵期间小心监控向培养物中添加代谢产物来控制生长速率。根据本发明的补料分批发酵允许细胞培养物达到比分批发酵更高的生物量。
以下针对50L制品描述发酵过程的实例和示范性的补料添加速率。然而，其他体积，例如10L、50L、或大于500L，取决于设备的规模，也可以使用如下所述的示范性补料速率来处理。
高度富集的分批培养基和补料分批培养基发酵适合于高细胞密度培养物的产生，以最大化具体质粒的产量和容许在仍处于指数生长中时以高生物量收获。
饲喂分批发酵使用葡萄糖或甘油作为碳源。所述发酵以分批模式进行直到初始的碳底物(葡萄糖)耗尽。通过DO的突然升高注意到，并通过对该事件后立即采取的样品的葡萄糖分析来确认这个时点。然后启动早先准备的补料培养基泵。泵速率通过来自Curless等(Bioeng.381082-1090，1991)的模型来确定，通过引用将所述文献完整地合并在此。设计该模型以便于控制补料分批过程的补料阶段。在初始的分批过程中，非抑制性浓度的底物被以它们最大比生长速率(max)生长的细胞消费，使得在接种后得到生物量水平急速升高。由于有毒代谢产物的积累，培养物不能以这种速率无限地生长。(Fieschio et al.，″Fermentation Technology Using RecombinantMicroorganisms.″In Biotechnology，eds.H.J.Rhem and G.Reed.WeinheimVCH Verlagsgesellschaft mbH 7b117-140，1989)。为了容许持续的对数生长，该模型计算生长限制性碳底物的基于时间的补料速率，而不需要反馈控制，从而给出操作员设定的的补料-分批阶段的生长。将它选择在一定水平，这种水平不引起抑制性代谢产物的积聚，并且足以得出高的生物量。
一般地，分批发酵使用高水平的(例如，是现有技术浓度的4倍)前体，其存在于富集的分批培养基中。具体地，在分批培养基中酵母提取物的数量富集到形成5g/l(如在LB培养基中)到20g/升，从而提供巨大数量的生长因子和核酸前体。培养基还补充有硫酸铵(5g/l)，其作为有机氮的来源。在补料-分批发酵中的补料过程期间，前体(硫酸铵形式的有机氮)的添加是设计为用来防止对质粒质量方面的有害影响。
根据本发明的方法的一个重要的方面是细胞裂解。因而，本发明包括用于制备和分离高度纯化的质粒DNA的过程，其包括细胞裂解的步骤，其中有(a)湍流设备，以快速地混合细胞悬液(附图1中的溶液1)与可裂解细胞的溶液(附图1中的溶液2)；和(b)层流设备，以允许基本上没有搅动地保温(a)中形成的混合物，其中所述在(a)中形成的混合物从湍流设备流动到层流设备。
根据本发明的一个的实施方式，该装置可以另外包括添加中和所述裂解溶液的第二溶液(附图1中的溶液3)的设备，其中在(b)中保温的混合物从所述层流设备流动到所述添加第二溶液的设备。
在另一个实施方式中，该装置可被用于从细胞分离质粒DNA的方法，包括(a)在所述湍流设备中混合所述细胞与碱性裂解性溶液；和(b)通过添加酸性溶液中和所述碱性裂解性溶液。
尽管当前使用许多方法来裂解细菌细胞，它们都没有解决由液体的粘弹性质和混合步骤中涉及的剪切力引起的难题。本发明的一个目的是使用T形管在粘弹性流体出现之前均一地和非常快速地混合细胞悬液(溶液1)和碱性溶液(溶液2)的方法。因而根据本发明的连续裂解提供了限制剪切力方面的主要优点。T形管一般具有小直径的管形材料，通常直径小于1cm，优选约2到8mm，更优选约6mm，来提高混合的流体的接触时间，但是这种方法不利用由穿过管道而诱导的混合。以下的表1显示了湍流、层流和湍流设备的参数B1a、B1b、B2各自的变化，它们相应的流速S1、S2和S3如附图1中所展现。
表1
本发明的另一个目的是具有非T管道的混合器或注射器，其允许细胞分散到裂解溶液中。因此，与例如通过槽中的桨来搅拌液体时相比对通过管道的液体的机械应力大大地降低了。混合的初始效率在随后的几秒钟甚至产生了更高的效率，因为这种液体还没有粘弹性质，通过小直径管道实现的混合是非常有效的。与此相反，当使用T形管混合时，起始混合仅是适度的，而流体快速地变成粘弹性的，在流入管道时引起相当大的问题。这种部分混合产生仅部分细胞的裂解，因此在中和作用之前只能释放一部分质粒。
根据本发明，我们鉴定了裂解期间的两个阶段，称为阶段I和阶段II。这两个阶段相应于I)细胞的裂解和II)核酸的变性，引起产生粘弹性流体的流变性能方面的主要变化。调整管道的直径使得满足这两个阶段的要求成为可能。在小直径的管道(B1a)内，混合增加。这是用于阶段I的结构。在大直径的管道(B1b)内，混合(并且由此剪切应力)减少。这是阶段II采用的结构。
因此，我们使用在附图2中描述的称为M1的混合器。也可以使用任何T形装置来提供根据本发明的细胞悬液的分散物。使用这种混合器，溶液通过一个或多个小直径的孔口以与液流相反的方向地(counter current)注射到碱性裂解性溶液中，以获得有效率的分散。这些孔口在所描述的结构中的直径约0.5mm到2mm，优选的约1mm。
混合物离开混合器M1短时间(约2.5秒)通过小直径的管道(附图1)。直径和流动时间的组合可以容易地计算以维持湍流。这些参数的变化的实例在表1中提供。对管道直径的所有标注提供的都是管道的内径，而不是外径，外径包括了管道壁自身的厚度。在管道中的这种短暂停留时间允许溶液1和2的非常快速的匀化作用。假定溶液1和溶液2在阶段I中仍然是牛顿流体，在匀化作用阶段期间流动模式是湍流。在离开这个管道时，溶液1和2是均化的，悬浮中的细胞裂解开始。
然后匀化的混合物通过直径大得多的第二管道(B1b)(附图1)，在其中发生细胞的裂解和粘弹性流体的形成。在这个阶段期间，可以使混合最小化，尽可能地容许溶液“静息”来限制湍流，以使将gDNA片段化的任何剪切应力最小化。在本发明的在一个实施方式中，约1到3分钟、约2分钟，和优选的1分20秒的接触时间足以完成细胞裂解和使核酸变性。在变性阶段期间，流体的流动模式是层流，推动SDS和氢氧化钠向细胞组分的缓慢的扩散。
由此获得溶胞产物，然后用称为M2的Y混合器来混合中和作用溶液3。在本发明的在一个实施方式中，Y混合器的内径约4到15min，或约6到10mm，可以是约6mm或约10mm。小直径管道(例如，约6mm管道)位于Y混合器的出口以容许快速(＜1秒)，有效的混合溶胞产物与溶液3。然后在收获槽中收集中和的溶液。在中和作用期间，pH的快速降低诱导了絮凝物形成(即，团或块的形成)。另一方面，部分变性的质粒非常快速地复原并保留在溶液中。絮状物在收获槽中逐渐沉下，带走大部分的污染物。
附图1中的示意图显示了连续裂解(CL)系统的一个实施方式。连续裂解可以自身使用或与其他过程一起使用。
本发明的方法可以被用于裂解任何类型的细胞(即，原核的或真核的)，用于任何与裂解有关的目的，例如，从靶细胞中释放需要随后纯化的所需质粒DNA。在优选的实施方式中，本发明的方法被用于裂解含有质粒的宿主细胞来释放质粒。
根据本发明的连续碱性裂解步骤的过程可以对从发酵收获的细胞来进行，所述发酵已经生长到未达静止期的细胞生物量，并因而处于指数生长(2-10g干重/升)。所述连续碱性裂解步骤也可以对从发酵收获的细胞进行，所述发酵已经生长到不再处于指数生长的、但未达静止期的高细胞生物量，具有约10-200g干重每升的细胞的浓度，优选为12-60g干重每升。
本发明进一步的包括制备和分离高度纯化的质粒DNA的方法，所述质粒DNA基本上没有污染物并且因而是药物级别的DNA。通过本发明的方法生产和分离的质粒DNA含有极低水平，即，百万分率(ppm)的污染染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素，并主要含有封闭的环形质粒DNA。根据本发明制备的质粒DNA具有足以用于研究和基于质粒的治疗的纯度。
本发明的方法包含纯化步骤，所述纯化步骤包括三螺旋亲和层析和进一步的离子交换层析步骤，本发明的方法可进一步包括疏水性相互作用层析或凝胶渗透层析。离子交换层析的步骤可以是流化床离子交换层析和轴向和/或径向高分辨率阴离子交换层析，因而该方法包括在此描述的连续碱裂解步骤，与随后的离子交换层析、三螺旋亲和层析和疏水性相互作用层析步骤组合，按该顺序发生。溶胞产物过滤或其他絮凝物去除可以先于第一层析步骤进行。在此描述的用于纯化质粒DNA的本发明的方法是可扩大规模的，因而可扩大到大规模生产。
在本发明的某些实施方式中，连续裂解可以于其他的纯化步骤组合来产生含pDNA的高纯度产品。例如，它可以与絮凝物去除(例如溶胞产物过滤、沉淀或离心)、离子交换层析(例如阳离子或阴离子交换)、三重亲和层析和疏水性相互作用层析中的至少一个组合。在一个实施方式中，连续裂解之后依次是阴离子交换层析、三重亲和层析，和疏水性相互作用层析。在另一个实施方式中，连续裂解之后依次是溶胞产物过滤、阴离子交换层析、三重亲和层析，和疏水性相互作用层析。这些步骤允许确实可扩大规模的质粒制造过程，其可以生产大量的前所未有的纯度的pDNA。宿主DNA& RNA以及蛋白质处在亚-ppm范围。
本发明的方法也可以使用进一步的SEC、反相层析、羟磷灰石层析等的步骤，与根据本申请在此描述的步骤组合。
可以采用絮凝物去除来为产生的pDNA产品提供更高的纯度。可以使用这个步骤来除去大部分沉淀的材料(絮凝物)。进行絮凝物去除的一种机制是通过溶胞产物过滤步骤，例如通过1到5mm，优选的3.5mm的栅格滤器(grid filter)，之后是作为最终(polishing)过滤步骤的深度过滤。进行絮凝物去除的其他方法是通过离心或沉淀。
可以采用离子交换层析来为产生的pDNA产品提供更高的纯度。可以根据污染物的性质和溶液的pH值来选择阴离子交换。
可以采用阴离子交换层析来为产生的pDNA产品提供更高的纯度。阴离子交换层析通过结合带负电的(或酸性)分子来支持带正电的分子而起作用。则，使用离子交换层析容许根据分子的电荷来分离分子。通过这种技术可以容易地分离分子的家族(酸性、碱性和中性的)。可以使用分步洗脱方案，许多污染物在早期级分洗脱，pDNA在较晚的级分洗脱。对于从pDNA制品除去蛋白质和内毒素，阴离子交换是非常有效的。
对于离子交换层析，填充材料和制备这种材料的方法以及制备过程、聚合和功能化阴离子交换层析，通过它洗脱和分离质粒DNA是本领域公知的。
基础材料(base material)被用于阴离子交换层析的填充材料，如果展现疏水性的各种官能基团或各种离子交换基团可以通过合成基础材料之后的后期反应导入，用于合成基础材料的化合物可以是任何化合物。单官能单体的实例包括苯乙烯、o-卤代甲基苯乙烯(o-halomethylstyrene)、m-卤代甲基苯乙烯、p-卤代甲基苯乙烯、o-卤代烷基苯乙烯、m-卤代烷基苯乙烯、p-卤代烷基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、α-甲基-o-卤代甲基苯乙烯、α-甲基-m-卤代甲基苯乙烯、α-甲基-p-卤代甲基苯乙烯、α-甲基-o-卤代烷基苯乙烯、α-甲基-m-卤代烷基苯乙烯、α-甲基-p-卤代烷基苯乙烯、o-羟甲基苯乙烯、m-羟甲基苯乙烯、p-羟甲基苯乙烯、o-羟烷基苯乙烯、m-羟烷基苯乙烯、p-羟烷基苯乙烯、α-甲基-o-羟甲基苯乙烯、α-甲基-m-羟甲基苯乙烯、α-甲基-p-羟甲基苯乙烯、α-甲基-o-羟烷基苯乙烯、α-甲基-m-羟烷基苯乙烯、α-甲基-p-羟烷基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙类酸缩水甘油酯、羟乙基丙烯酸酯、羟甲基丙烯酸酯和乙烯基醋酸酯。最优选的化合物是环烷基基团被芳香环、卤素例如Cl、Br、I和F，和2到15个碳原子内的直链和/或分支的饱和烃类取代。多官能单体的实例包括二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、三乙烯基甲苯、二乙烯基萘、三乙烯基萘、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯、二丙烯酸二甘醇酯、亚甲基双甲基丙烯酰胺、和亚甲基双丙烯酰胺。
可以通过后期反应导入各种离子交换基团。基础材料的制备包括第一步骤，其中单功能单体和多官能单体按适当的比例称出，添加用于调整形成的粒子中孔的、精确称出的稀释剂或溶剂以及类似地精确称出的聚合引发剂，随后充分搅动。然后对混合物进行水包油型悬浮聚合作用，其中混合物被添加到溶解了预先精确称出的悬浮稳定剂的水溶液中，通过用搅拌器混合形成目标大小的油滴，通过逐渐地加热混合的溶液进行聚合作用。单功能单体与多功能单体的比例一般约1摩尔单功能单体，和约0.01到0.2摩尔多功能单体，以获得软的基础材料颗粒。聚合作用引发剂也没有具体的限制，使用通常采用的azobis型和/或过氧化物型。
可以使用悬浮稳定剂例如离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和有两亲性的聚合物或它们的混合物，来防止油滴自身之间的聚集。
用于离子交换层析以纯化质粒DNA的填充材料优选具有相对大的孔直径，具体是在1500到4000埃的范围内。表面改性以将离子交换基团导入基础材料是本领域公知的。
两种类型的洗脱液可被用于离子交换层析。可以使用含有低浓度的盐的第一洗脱液和含有高浓度的盐的第二洗脱液。洗脱方法包括从逐步地从第一洗脱液交换到第二洗脱液，梯度洗脱方法连续地改变从第一洗脱液到第二洗脱液的组成。可以使用通常用于这些离子交换层析洗脱液中的缓冲液和盐。对于含有低浓度的盐的第一洗脱液，缓冲液浓度10到50mM、pH值6到9的水溶液是具体优选的。对于含有高浓度的盐的第二洗脱液，洗脱液C中添加了0.1到2M钠盐的水溶液是具体优选的。对于钠盐，可以使用氯化钠和硫酸钠。
此外，可以使用二价金属离子的螯合剂，实例例如，乙撑二胺-四乙酸，用于抑制由于大肠杆菌的溶胞产物中DNA降解酶造成的质粒降解。二价金属离子螯合剂的浓度优选的为0.1到100mM。
各式各样的商业上可获得的阴离子交换基质适合于在本发明中使用，包括但不限于可以从POROS Anion Exchange Resins、Qiagen、Toso Haas、Sterogene、Spherodex、Nucleopac和Pharmacia获得的那些。例如，柱(PorosII PI/M，4.5mm×100)最初用pH 7.5的20mM Bis/TRIS Propane和0.7MNaCl平衡。加载样品，并用相同的初始缓冲液冲洗。然后应用约25倍柱容积的0.5M到0.85M NaCl洗脱梯度，收集级分。优选的阴离子交换层析包括Fractogel TMAE HiCap。
根据分离和纯化质粒DNA的过程的优选的实施方式，本发明涉及通过组合的离子交换层析和三螺旋层析来分离和纯化核酸和/或质粒DNA的方法，用于有效地获得大批量高纯度的核酸。
三螺旋亲和层析具体地在专利US 6,319,672、6,287,762以及申请人的国际专利申请公开WO02/77274中描述了。
三螺旋亲和层析基于寡核苷酸和双链DNA内靶序列的特异性杂交。这些寡核苷酸可以含有以下碱基-胸腺嘧啶核苷(T)，其能与双链DNA的A.T双联体(doublet)形成三联体(triplet)(Rajagopal et al.，Biochem 28(1989)7859)；-腺嘌呤(A)，其能与双链DNA的A.T双联体形成三联体；-鸟嘌呤(G)，其能与双链DNA的G.C双联体形成三联体；-质子化的胞嘧啶(C+)，其能与双链DNA的G.C双联体形成三联体(Rajagopal et al.，loc.cit.)；
-尿嘧啶(U)，其能与A.U或A.T碱基对形成三联体。
优选的，使用的寡核苷酸包含富胞嘧啶的同型嘧啶(homopyrimidine)序列，和存在于是同型嘌呤-同型嘧啶(homopurine-homopyrimidine)序列的DNA中的特异性序列。胞嘧啶的存在使得三螺旋成为可能，三螺旋在酸性pH是稳定的，其中胞嘧啶是质子化的，在碱性pH是不稳定的，其中胞嘧啶被中和。
寡核苷酸和存在于DNA中的特异性序列优选是互补的以容许形成三螺旋。通过使用完全互补的寡核苷酸和特异性序列，可以获得最好的产量和最好的选择性。例如，寡核苷酸聚(CTT)和特异性序列聚(GAA)。优选的寡核苷酸具有序列5′-GAGGCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7(SEQ ID NO1)，其中碱基GAAG不形成三螺旋，但允许寡核苷酸从连接臂隔开；序列(CTT)7。这些寡核苷酸能够与含有互补单元(GAA)的特异性序列形成三螺旋。所述序列具体为含有7、14或17个GAA单元的区域，如在实施例中描述的。
特别感兴趣的另一个序列是序列5′-AAGGGAGGGAGGA GAGGAA-3′(SEQ ID NO2)。这个序列与寡核苷酸5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID NO3)或5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID NO4)形成三螺旋。在这种情况下，寡核苷酸按反平行方向与多嘌呤链结合。这些三螺旋仅在存在Mg2+的情况下是稳定的(Vasquez et al.，Biochemistry，1995，34，7243-7251；Beal and Dervan，Science，1991，251，1360-1363)。
如上所述，所述特异性序列可以是天然存在于双链DNA中的序列，或是人工地导入到后者中的合成序列。特别有益的是使用能与天然存在于双链DNA中的序列形成三螺旋的寡核苷酸，所述序列例如存在于质粒的复制起点中或存在于标记基因中。对此，已知通过序列分析，这些DNA的某些区域，具体是复制起点中，可能具有同型嘌呤-同型嘧啶区域。合成能与这些天然的同型嘌呤-同型嘧啶区域形成三螺旋的寡核苷酸，有利地允许本发明的方法应用于未改进的质粒，具体是商售的质粒pUC、pBR322、pSV等等类型。在天然存在于双链DNA中的同型嘌呤-同型嘧啶序列之中，可以提及包含存在于大肠杆菌质粒ColE1复制起点中的序列5′-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(SEQ ID NO5)的全部或部分的序列。在这种情况下，形成三螺旋的寡核苷酸具有序列5′-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3′(SEQ ID NO6)，并交替地与双螺旋的两条链结合，如Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992，114，4976-4982)和Jayasena和Johnston(Nucleic Acids Res.1992，20，5279-5288)所描述的。也可以提及质粒pBR322 β-内酰胺酶基因(Duval-Valentin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)的序列5′-GAAAAAGGAAGAG-3′(SEQ ID NO7)。
已经在质粒ColE1以及质粒pCOR的复制起点中鉴定了能与具体寡核苷酸形成三螺旋的合适的靶序列。pCOR质粒是具有条件性复制起点的质粒，具体见US 2004/142452和US 2003/161844中的描述。ColE1衍生的质粒含有12mer的同型嘌呤序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO8)，位于(mapped)参与质粒复制的RNA-II转录产物的上游(Lacatena et al.，1981，Nature，294，623)。该序列与12-mer互补5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO9)寡核苷酸形成稳定的三螺旋结构。pCOR骨架含有14个非重复碱基的同型嘌呤片段(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO10)，其位于pCOR的γ起始复制子的富A+T片段中(Levchenko et al.，1996，Nucleic Acids Res.，24，1936)。该序列与14-mer互补的寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQID NO11)形成稳定的三螺旋结构。相应的寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO8)和5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO11)有效地和特异地靶向它们各自的、位于ColE1 ori或者pCOR(oriγ)的复制起点内的互补序列。实际上，单个非经典(non-canonical)的三联体(T*GC或C*AT)可能引起对三螺旋结构的完全的去稳定。
使用能与存在于复制起点或标记基因中的序列形成三螺旋的寡核苷酸是特别有益的，因为它使得使用相同的寡核苷酸来纯化含有所述复制起点或所述标记基因的任何DNA成为可能。因而，修饰质粒或双链DNA以将人工特异性序列掺入其中不是必要的。
尽管完全互补的序列是优选的，然而要理解的是，在寡核苷酸的序列和存在于DNA中的序列之间某些错配是可忍受的，只要它们不导致太大的亲合性损失。可以提及存在于大肠杆菌β-内酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ ID NO12)。在这种情况下，中断多嘌呤序列的胸腺嘧啶可以由第三链的鸟嘌呤识别，从而形成G*TA三联体，当其与两个T*AT三联体侧接时是稳定的。(Kiessling et al.，Biochemistry，1992，31，2829-2834)。
根据具体的实施方式，本发明寡核苷酸包含序列(CCT)n、序列(CT)n或序列(CTT)n，其中n是1到15之间的整数，包括1和15。使用(CT)n或(CTT)n型的序列是特别有益的。申请人证明了，实际上，纯化产量受到寡核苷酸中C的量的影响。具体地，如在实施例7中所示，当寡核苷酸含有较少的胞嘧啶时纯化产量升高。要理解的是，本发明的寡核苷酸也可以组合(CCT)、(CT)或(CTT)单元。
使用的寡核苷酸可以是天然的(由未修饰的天然碱基组成)或化学修饰的。具体地，寡核苷酸有利地可以具有某些化学改变，允许提高它对核酸酶的抗性或保护性、或对具体序列的亲合性。还应理解的是寡核苷酸意指任何连接的连续核苷，其经历了骨架的修饰，目的是使它对核酸酶更有抗性。在可能的修饰之中，可以提及能与DNA形成三螺旋的寡核苷酸硫代磷酯(phosphorothioate)(Xodo et al.，Nucleic Acids Res.，1994，22，3322-3330)，以及具有formacetal或甲基膦酸酯骨架的寡核苷酸(Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，7767-7768)。还有可能的是使用用核苷酸的α异头物(anomers)合成的寡核苷酸，其也与DNA形成三螺旋(Le Doan et al.，NucleicAcids Res.1987，15，7749-7760)。对骨架的另一种修饰是氨基磷酸酯连接。例如，可以提及Gryaznov和Chen描述的N3′-P5′核苷酸间氨基磷酸酯连接，其给出了与DNA形成特别稳定的三螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3143-3144)。在其它骨架的修改之中，也可以提及使用2’-O-甲基核糖、磷酸二酯等的核苷酸(Sun and Hélène，Curr.Opinion Struct.Biol.，116，3143-3144)。最后，基于磷的骨架可以被如PNA(肽核酸)中的聚酰胺骨架替代，其也能形成三螺旋(Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500；Kim et al.，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481)，或被如DNG(脱氧核糖核胍，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6097-6101)中的基于胍的骨架取代，或被DNA的聚阳离子类似物取代，其也形成三螺旋。
第三链的胸腺嘧啶也可以被5-溴尿嘧啶替代，其增加寡核苷酸对DNA的亲合性(Povsic and Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，3059-3061)。所述第三链也可以含有非天然碱基，在这些之中可以提及7-deaza-2’-脱氧黄嘌呤核苷(Milligan et al.，Nucleic Acids Res.，1993，21，327-333)、1(2-脱氧-β-D-核糖呋喃糖基(ribofuranosyl))-3-甲基-5-氨基-1H-pyrazolo[4，3-d]嘧啶-7-酮(one)(Koh and Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1470-1478)，8-氧腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2’-O-甲基伪异胞嘧啶，或本领域技术人员已知的任何其它修饰(对于综述参见Sun and Hélène，Curr.Opinion Struct.Biol.，1993，3，345-356)。
寡核苷酸的另一种类型的修饰具体地具有改进寡核苷酸和特异性序列之间的相互作用和/或亲合性的目的。具体地，根据本发明的最有益的修改在于使寡核苷酸的胞嘧啶甲基化。这样甲基化的寡核苷酸显示了在更接近中性的pH(≥5)范围中与特异性序列形成稳定的三螺旋的值得注意的性质。因而与现有技术的寡核苷酸相比有可能在更高的pH值起作用(work)，也就是说在质粒DNA降解风险小得多的pH值起作用。
用于本发明的方法的寡核苷酸的长度在5到30个碱基之间。有利地使用长度大于10个碱基的寡核苷酸。对于每个独立的情况，所述长度可以由本领域的技术人员改变，以适合相互作用的所需选择性和稳定性。
根据本发明的寡核苷酸可以通过任何已知的技术合成。特别地，它们可以由核酸合成仪的方法制备。非常明显地可以使用本领域的技术人员已知的任何其它方法。
为了允许与支持物的共价偶联，寡核苷酸通常被功能化。因而，它可以在5’或3’位置被硫醇、胺或羧基末端基团修改。具体地，添加硫醇、胺或羧基使得，例如，将寡核苷酸偶联到带有二硫化物、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧化物、溴化氰或醛功能(function)的支持物成为可能。这些偶联通过在寡核苷酸和支持物之间建立二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺连接来形成。可以使用本领域技术人员已知的任何其他方法，诸如双功能偶联试剂。
此外，为了改进与偶联的寡核苷酸的杂交，寡核苷酸含有碱基的“臂”和“间隔区”序列可能是有益的。臂的使用使得以与支持物的选定距离结合寡核苷酸在实际上成为可能，容许改进其与DNA的相互作用的状况。所述臂有利地由线性碳链和胺组成，所述线性碳链包含1到18个，和优选的6或12个(CH2)基团，所述胺允许与柱结合。所述臂被连接到寡核苷酸、或“间隔区”的磷酸酯，所述“间隔区”包含不干扰杂交的碱基。因而，所述“间隔区”可以包含嘌呤碱基。举例来说，所述“间隔区”可以包含序列GAGG。所述臂有利地包括包含6或12个碳原子的线性碳链。
三联体亲和层析对于除去RNA和基因组DNA是非常有效的。这些可以是功能化的层析支持物，散装的或预先装入在柱中，功能化的塑性表面或功能化的乳胶珠、磁性的或具有其它性质。优选使用层析支持物。举例来说，能使用的层析支持物是琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖以及它们的衍生物(例如，Sephadex、Sepharose、Superose等等)，聚合物例如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或移植或未移植的硅。层析柱可以以扩散或灌注模式操作。
为了获得更好的纯化产量，具体有益的是在质粒上使用含有与寡核苷酸杂交的几个位置的序列。几个杂交位置的存在实际上促进所述序列和寡核苷酸之间的相互作用，引起在纯化产量方面的改善。因而，对于含有(CCT)、(CT)或(CTT)基序的n个重复的寡核苷酸，优选使用含有至少n个互补基序、优选的n+1个互补基序的DNA序列。带有n+1个互补基序的序列因而提供了与寡核苷酸杂交的两个位置。有利地，DNA序列含有多达11个杂交位置，也就是说n+10个互补基序。
根据本发明的方法可被用于纯化任何类型的双链DNA。后者的实例是环状DNA，例如质粒，其通常带有一个或多个由治疗重要性的基因。这个质粒也可以带有复制起点、标记基因，等等。本发明的方法可以直接应用于细胞溶胞产物。在这个实施方式中，通过转化和随后的细胞培养扩增的质粒，在细胞的裂解之后直接被纯化。本发明的方法也可以应用于澄清的溶胞产物，也就是说应用于细胞溶胞产物的中和作用和离心之后获得的上清液。它很明显也可以应用于通过已知方法预纯化的溶液。这种方法还容许从包含不同序列的DNA的混合物中纯化带有重要序列的线性或环状DNA。根据本发明的方法也可以用纯化双链DNA。
细胞溶胞产物可以是原核或真核细胞的溶胞产物。
对于原核细胞，细菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、S.typhimurium或链霉菌(Strepomyces)可以作为实例提及。对于真核细胞，可以提及动物细胞、酵母、真菌等等，更具体的，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或酵母属(Saccharomyces)酵母菌或COS、CHO、C127、NIH3T3等细胞。
可以采用至少包括三联体亲和层析步骤的本发明的方法来为产生的pDNA产品提供更高的纯度。在三联体亲和层析中，寡核苷酸与支持物例如层析树脂或其他基质结合。然后使要纯化的样品与结合的寡核苷酸混合，例如，通过将样品施加到含有结合于层析树脂的寡核苷酸的层析柱。样品中所需的质粒将与寡核苷酸结合，形成三联体。在寡核苷酸和质粒之间的键可以是Hoogsteen键。这个步骤可以在pH≤5、高盐浓度、20分钟或更多的接触时间的条件下发生。可以采用洗涤步骤。最后，在中性缓冲液中出现胞嘧啶去质子化作用，从结合了寡核苷酸的树脂洗脱所述质粒。
根据最优选的实施方式，分离和纯化核酸和/或质粒DNA的方法包括组合的离子交换层析、三螺旋亲和层析和疏水性相互作用层析的步骤。
疏水性相互作用层析使用基质上的疏水部分来吸引用于纯化的样品中分子中的疏水区域。应当注意到，这些HIC支持物通过“群集”效应来工作，当这些分子结合时没有形成或共用共价键或离子键。由于非常有效地除去开放环形质粒形式和其他污染物，例如gDNA、RNA和内毒素，疏水性相互作用层析是有益的。
疏水性相互作用层析的基础材料的合成、以及制备方法、聚合和功能化疏水性相互作用层析、和通过它洗脱和分离质粒DNA是本领域公知的，具体地在美国专利No6,441,160中描述，通过引用将它合并在此。
基础材料(base material)被用于疏水性相互作用层析的填充材料，如果展现疏水性的各种功能基团或各种离子交换基团可以通过合成基础材料之后的后期反应导入，用于合成基础材料的化合物可以是任何化合物。单功能单体的实例包括苯乙烯、o-卤代甲基苯乙烯、m-卤代甲基苯乙烯、p-卤代甲基苯乙烯、o-卤代烷基苯乙烯、m-卤代烷基苯乙烯、p-卤代烷基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、α-甲基-o-卤代甲基苯乙烯、α-甲基-m-卤代甲基苯乙烯、α-甲基-p-卤代甲基苯乙烯、α-甲基-o-卤代烷基苯乙烯、α-甲基-m-卤代烷基苯乙烯、α-甲基-p-卤代烷基苯乙烯、o-羟甲基苯乙烯、m-羟甲基苯乙烯、p-羟甲基苯乙烯、o-羟烷基苯乙烯、m-羟烷基苯乙烯、p-羟烷基苯乙烯、α-甲基-o-羟甲基苯乙烯、α-甲基-m-羟甲基苯乙烯、α-甲基-p-羟甲基苯乙烯、α-甲基-o-羟烷基苯乙烯、α-甲基-m-羟烷基苯乙烯、α-甲基-p-羟烷基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯(glycidyl methacrylate)、丙烯酸缩水甘油酯(glycidyl acrylate)、羟乙基丙烯酸酯(hydroxyethyl acrylate)、羟甲基丙烯酸酯(hydroxymethacrylate)和乙烯基醋酸酯(vinyl acetate)。最优选的化合物是在以下部分发生取代的环烷基基团芳香环、卤素例如Cl、Br、I和F，和2到15个碳原子的直链和/或分支的饱和烃类取代。
多功能单体的实例包括二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、三乙烯基甲苯、二乙烯基萘、三乙烯基萘、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯、二丙烯酸二甘醇酯、亚甲基双甲基丙烯酸酯(methylenebismethacrylamide)、和亚甲基双丙烯酸酯(methylenebisacrylamide)。
可以通过后期反应将各种疏水的功能基团或各种离子交换基团导入。为了最小化由于基础材料本身展现的疏水性、或由于盐浓度的变化和pH值的变化导致基础材料本身的膨胀或缩小对所需的分离的目标产品的影响，优选使用相对亲水的单体制备基础材料，诸如甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、羟乙基丙烯酸酯、羟甲基丙烯酸酯和乙烯基醋酸酯。基础材料的制备包括第一步骤，其中单功能单体和多功能单体按适当的比例称出，添加用于调整形成的粒子中的孔的、精确称出的稀释剂或溶剂，和类似地精密称出的聚合引发剂，随后充分搅动。然后使混合物经受水包油型悬浮聚合作用，其中混合物被添加到溶解了预先精确称出的悬浮稳定剂的水溶液中，通过用搅拌器混合形成目标大小的油滴，通过逐渐地加热混合的溶液进行聚合作用。
单功能单体与多功能单体的比例一般约1摩尔单功能单体，和约0.01到0.2摩尔多官能单体，以获得软的基础材料颗粒。多功能单体的比例可以增加到约0.2到0.5摩尔，以获得硬的基础材料颗粒。单独的多官能单体可用于获得更加硬的颗粒。
聚合引发剂也没有特别的限制，使用通常采用的azobis型和/或过氧化物型。
可以使用悬浮稳定剂例如离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和有两亲性的聚合物或它们的混合物，来防止油滴自身之间的聚集。
形成的粒子的直径通常约2到500μm。优选的粒子直径包括2到30μm，更优选的约2到10μm。当目的是大规模高纯度地纯化核酸时，所述粒子的直径是约10到100μm，当从粗制贮存溶液分离目标产品时，所述粒子的直径可以是100到500μm，更优选约200到400μm。为调整粒子直径，可以在聚合作用期间调整搅拌器的转速。当需要小直径的粒子时，转数的数值可以升高，当期望大的粒子时，转数的数值可以降低。在此，由于使用的稀释剂被用于调整形成的粒子中的孔洞，稀释剂的选择是特别重要的。作为基本的概念，对于将用于聚合作用的溶剂，通过用不同方式组合对于单体而言是不良溶剂的溶剂和对于单体而言是良好溶剂的溶剂，来进行调整。取决于需要分离的核酸的分子大小适当地选择孔洞直径的大小，但是优选的，对于用于疏水性相互作用层析的填充材料所述孔洞的直径在500到4000埃的范围内，对于用于离子交换层析的填充材料所述孔洞的直径在1500到4000埃的范围内。
在疏水性相互作用层析中，对于分离不同疏水性的核酸优选的通过分别利用不同疏水性的填充材料，基础材料的表面改性是重要的。
疏水基团可以从长链或分支的基团中选择，包括具有2到20个碳原子的饱和烃基团或不饱和烃基团。芳香环也可被包括在烃基团内。
疏水基团也可以在具有下式的化合物中选择 其中n＝0到约20，亚甲基基团可以是直链或分支的，m＝0到约3，烃基团可以是直链或分支的，A是C＝O基团或醚基团，但是亚甲基基团可以在没有A的情况下直接与基础材料结合。
疏水基团可以进一步包括具有2到20个碳原子的烷撑二醇(alkyleneglycol)的醚基团，其由0到10个重复单元组成，其中与基础材料反应的功能基团的对端可以是按照原样留下的OH基团，或可以用1到4个碳原子的烃基团帽化。
以上描述的疏水基团可以单独地使用，或在混合物中使用以修饰表面。
对于象质粒一样的低疏水性，6到20个碳原子的烃基的链是优选的。具有2到15个碳原子的烃基长链用于分离高疏水性的化合物，例如来源于大肠杆菌的RNA和人类和动物细胞中的RNA。具有4到18个碳原子的烃基用于分离相对低疏水性的化合物，例如来源于大肠杆菌的DNA和人类及动物细胞中的DNA。
在分离这些化合物时，不限于所述的例子，可以适当地选择化合物来修饰表面。实际上，填充材料的疏水性程度取决于培养基中的盐浓度或用于吸附的洗脱液中的盐浓度而变化。此外，填充材料的疏水性程度根据导入基础材料的基团数量的不同而不同。
疏水性相互作用层析的基础材料的孔的直径具体优选500到4000埃，但取决于希望分离的核酸的分子大小可以从所述范围中适当地选择。一般地，因为核酸在填充材料上的保存以及吸附能力(样品引导(leading))由于孔的直径不同而不同，优选的对大的分子核酸使用大孔隙直径的基础材料，对小的分子核酸使用小孔隙直径的基础材料。
例如，使用含卤素化合物和/或羰基卤化物和催化剂例如FeCl3、SnCl2或AlCl3，并利用Friedel-Craft反应，苯乙烯基础材料可以与包含烃基长链的疏水基团反应，有可能作为去卤素化合物和/或酰化的化合物直接在基础材料中添加芳香环。在基础材料是含有卤素基团的粒子的情况下，例如，使用在待添加的功能基团中含有OH的化合物，如丁醇，和利用Williamson反应和碱性催化剂例如NaOH或KOH，有可能通过醚键导入功能基团。在期望添加的功能基团是含氨基的化合物如己胺的情况下，有可能使用碱性催化剂例如NaOH或KOH并利用去卤素酸性反应来添加。相反地，对于含有OH基团的基础材料，如果预先将环氧基、卤素基团或羰基卤化物基团导入到期望添加的功能基团中，有可能通过醚或酯键导入功能基团。对于含有环氧基的基础材料，如果与带有包含在功能基团中的OH基团或氨基的化合物反应，有可能通过醚或氨基键导入功能基团。此外，在期望添加的功能基团含有卤素基团的情况下，有可能通过使用酸催化剂通过醚键添加功能基团。由于导入到基础材料中的功能基团的比例受到期望分离的目标产品的疏水性的影响，它不能被限制，但是一般地，每1g干燥基础材料添加具有约0.05到4.0mmol功能基团的填充材料是适合的。
对于表面改性，描述了在形成基础材料或粒子之后通过后期反应添加功能基团的方法。根据相同的方法进行表面改性，其中基础材料在使用聚合之前添加的单体和所述功能基团的聚合作用之后形成。
基础材料也可以是多孔的硅胶。制造硅胶的方法包括，使用例如烷基三甲氧基硅烷的化合物直接将硅烷偶联到根据″Latest High-Speed LiquidChromatography″，289页以后(Toshio Nambara和Nobuo Ikegawa撰写，TokyoHirokawa Bookstore 1988年出版)中描述的方法制造的粒子。在使用含有环氧基的硅烷偶联剂连接硅烷之前或之后，可以根据上述方法添加功能基团。导入的功能基团的比例为每1g干燥基础材料添加约0.05到4.0mmol的功能基团是适合的。
将洗脱液用于疏水性相互作用层析分离或纯化步骤。通常，使用两种类型的洗脱液。一种洗脱液含有高浓度的盐，而第二洗脱液含有低浓度的盐。可以使用包括逐步地从高盐浓度的洗脱液置换为低盐浓度的洗脱液的洗脱方法、和连续地将组成从一种洗脱液变为另一种的梯度洗脱方法。可以使用通常用于疏水性相互作用层析的缓冲液和盐。对于含有高浓度的盐的洗脱液，1.0到4.5M的盐浓度和pH值6到8的水溶液是具体优选的。对于含有低浓度的盐的洗脱液，0.01到0.5M的盐浓度和pH值6到8的水溶液是具体优选的。通常，硫酸胺和硫酸钠可被用作盐。
可以通过依次组合导入了弱疏水性功能基团的填充材料和导入了强疏水性功能基团的填充材料进行疏水性相互作用层析质粒DNA纯化步骤。实际上，培养基培养的大肠杆菌含有大量疏水性不同的各种成分，例如多聚糖、大肠杆菌基因组DNA、RNA质粒和蛋白质。还已知的是，甚至在核酸自身之间液存在疏水性差异。与质粒相比，成为混杂物的蛋白质具有更高的疏水性。
许多疏水性相互作用层析树脂时商业上可获得的，例如Fractogelpropyl、Toyopearl Source isopropyl、或任何其他具有疏水基团的树脂。最优选的树脂是Toyopearl散装聚合介质。Toyopearl是综合了高的机械和化学稳定性的甲基丙酸烯聚合物。树脂可以作为非功能化的“HW”系列树脂获得，可以用表面化学作用衍化用于离子交换层析或疏水性相互作用。可以使用具有不同的表面化学特性和疏水性水平的四种类型的Toyopearl HIC树脂。Toyopearl HIC树脂的疏水性根据以下系列而增加Ether、Phenyl、Butyl和Hexyl。具有1000埃孔隙直径的、优选的Toyopearl HIC树脂(即，ToyopearlHW-65)的结构显示如下
以上描述的Toyopearl树脂可以具有各种粒子大小级别。Toyopearl 650C具有约50到150μm的粒子大小，优选的约100μm，而Toyopearl 650M具有约40到90μm的粒子大小，优选的约65μm，Toyopearl 650S具有约20到50μm的粒子大小，优选的约35μm。公知的是粒子大小影响分辨率，即，从C到M到S粒子大小级别分辨率提高，因而具有越来越小的粒子大小。用于根据本发明分离和纯化质粒DNA的方法中HIC层析步骤最优选的Toyopearl树脂是丁基Toyopearl(Toyopearl butyl)-650S，其是由TosohBioscience提供的商品。
根据优选的实施方式，进行进一步的渗滤步骤。根据本领域已知的标准技术，在这个过程中适合使用标准的、商业上可获得的渗滤材料。优选的渗滤方法是取决于质粒的大小使用具有30,000到500,000范围内的分子量截留值的超滤膜。这个渗滤步骤容许进行缓冲液交换，随后进行浓缩。通过切向流动过滤(膜截留值，30kDa)将洗出液浓缩3到4倍达到约2.5到3.0mg/mL的目标浓度，浓缩物通过以恒定体积用10倍体积的盐水渗滤进行缓冲液交换，用盐水调节到目标质粒浓度。根据浓缩物样品在260nm的吸光率计算NV1FGF浓度。通过0.2μm空舱(capsule)过滤器过滤NV1FGF溶液，并分成几个等分量，在2-8℃保存于冷藏室中的容器中直到进一步的处理。这产生了纯化的浓缩物，超螺旋质粒的质粒DNA浓度为约70％、75％、80％、85％、90％、95％和优选的99％。使用这个方法总的质粒回收为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和80％，平均回收率60％。
依据这个实施方式，根据以下条件进行渗滤步骤对步骤a)和步骤b)使用的缓冲液为i)第一次渗滤(步骤a)，利用12.5到13.0倍体积的50mM Tris/HCl、150mM NaCl，pH 7.4(称为缓冲液I)，和ii)对以上步骤a)的保留物进行第二次渗滤(步骤b)，利用3.0到3.5倍体积的盐水赋形剂(150mM NaCl)。根据本发明的这个优选的渗滤步骤有效地和广泛地除去硫酸铵和EDTA。并且，在这个渗滤步骤之后，获得了合适的生理学NaCl浓度(约150mM)，最终Tris浓度低于1mM(200μM到1mM之间)。
通过使用所述渗滤步骤获得的质粒DNA制剂包括NaCl作为盐水赋形剂和适当浓度的Tris缓冲液以维持或控制pH值在7和7.5之间。根据本申请的质粒DNA制剂是特别有用的，因为它们的质粒DNA可以令人惊讶地以稳定的不降解的形式、在这些条件下、在5℃到达25℃即在室温，保存延长的时间。
如所述，根据本发明的分离高纯度质粒DNA的方法可以通过用常规方法简单操作大批量获得。
如上所述的裂解方法，或本领域公知的任何其它裂解方法之后，可以使用纯化质粒的方法。例如，可以使用含有质粒的微生物细胞的流通热裂解。这个过程特别地在国际公开WO 96/02658中描述了。这个具体的换热器由形成螺管的10ft.x 0.25英寸O.D.不锈钢管组成。该螺管被完全地浸没到恒定高温水浴中。该螺管的滞留(hold-up)体积约50mL。热电偶和温度计分别被用于测量进口和出口温度以及水浴温度。使用带有硅树脂管的Masterflex螺形压缩泵(peristaltic pump)将产品流泵入加热螺管中。细胞溶胞产物流出螺管，然后在Beckman J-21分批式离心机中离心用于澄清。在离心之后，可以使用根据本发明的纯化方法纯化质粒DNA。
选择性的细胞裂解可以利用串联的静态混合器。实际上，如WO97/23601所描述的(通过引用合并在此)，第一静态混合器用于裂解通过第一静态混合器的细胞，和用于沉淀通过第二静态混合器的细胞溶胞产物，可被用作在根据本发明的纯化质粒DNA方法之前裂解细胞的可选方法。使用静态混合器，大量细胞可以被轻柔地和连续地以流线方式(in-line)裂解，将其他静态混合器置于流线上来完成其他功能，例如稀释和沉淀。在本发明的方法中有用的适合的静态混合器包括本领域称为静态或不动混合器的任何流通(flow through devise)装置，具有足够的长度以允许本发明的方法。例如，为了裂解细胞，静态混合器将需要具有一定长度，其将提供裂解溶液和细胞之间的足够的接触时间，以使得在通过混合器期间目标细胞得以裂解。在优选的实施方式中，适合的静态混合器含有含有内部螺旋结构，其使得两种液体以相反的旋流相互接触，使得液体在湍流中混合在一起。
根据本发明分离和纯化质粒DNA的方法可被用于分离和纯化任何大小任何类型的载体。可通过根据本发明的方法分离的质粒DNA的大小范围从约5kb到约50kb，优选的15kb到50kb，该DNA包括约3kb的载体骨架(backbone)、治疗基因和相连的调节序列。因而，在本发明中有用的载体主干能够携带约10-50kb或更大的插入物。插入物可以包括来自任何有机体的DNA，但优选的是哺乳动物来源的，除编码治疗蛋白的基因之外可以包括调节序列，例如启动子，聚腺苷酰化序列、增强子、基因座控制区，等等。编码治疗蛋白的基因可以是基因组来源的，因而含有外显子和内含子，如其基因组结构所示的那样，或它可以来源于互补DNA。这种载体可以包括例如，可以以高拷贝数复制的载体骨架，具有用于插入治疗基因的多聚接头、编码选择性标记的基因，例如，SupPhe tRNA，四环素卡那霉素抗性基因，并且其在物理上是小和稳定的。质粒的载体骨架有利地允许插入哺乳动物、其他真核、原核或病毒DNA的片段，产生的质粒可以被纯化并用于体内或体外的基于质粒的治疗。具有相对高拷贝数的载体，即，在20-40拷贝/细胞到1000-2000拷贝/细胞的范围内，可以通过根据本发明的方法分离和纯化。例如，根据本发明的方法，包括pUC复制起点的载体是优选的。pUC复制起点允许更有效的质粒DNA复制和产生比例如pBR322起点的情况增加十倍的质粒拷贝数/细胞。优选的，具有条件复制起点的质粒DNA或如US 2003/1618445中描述的pCOR，可以通过根据本发明的过程分离。产生的高拷贝数大大提高了质粒DNA与染色体DNA、RNA、细胞蛋白和辅因子的比例，改进了质粒产量，便于更容易的下游纯化。因此，根据本发明可以使用任何载体(质粒DNA)。代表性的载体包括但不限于NV1FGF质粒。NV1FGF是编码酸性成纤维细胞生长因子或1型成纤维细胞生长因子(FGF-1)的质粒，对于治疗患有末期外周动脉阻塞性疾病(PAOD)或外周动脉疾病(PAD)的患者是有用的。Camerota等(J Vasc.Surg.，2002，35，5930-936)描述了，患有不可重建的末期PAD的、具有静息疼痛或组织坏死的51名患者，向大腿和小腿中注射了提高的单个或重复剂量的NV1FGF。随后评定了各种参数，例如经皮氧压力，踝和脚趾肱指数，疼痛评估和溃疡愈合。在NV1FGF施用后观察到显著的升高的肱指数、疼痛的减轻、溃疡大小的消退、改善的灌注。
根据本发明有用的宿主细胞可以是任何细菌菌株，即，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株，例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)或芽孢杆菌(Bacillus)，能维持如上所述的质粒高拷贝数；例如20-200个拷贝。可以根据本发明使用大肠杆菌宿主菌株，包括HB101、DH1和DH5αF、XAC-1和XAC-1pir 116、TEX2和TEX2pir42(WO04/033664)。含有F质粒或F质粒衍生物的菌株(例如JM109)通常不是优选的，因为F质粒可能与治疗性质粒产品共纯化。
根据另一个方面，本发明还涉及包含高度纯化的质粒DNA的组合物，其基本上没有污染物或污染物在亚-ppm的范围内，因而是药物级别的DNA。根据本发明的药物级别质粒DNA组合物因而含有亚-ppm(＜0.0001％，即＜0.0001mg每100mg质粒DNA)gDNA、RNA和蛋白质污染物。
药物级别质粒DNA组合物因而含有低于约0.01％、或低于0.001％、和优选的低于0.0001％、或优选的低于0.00008％(＜0.00008％，即＜0.00008mg每100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA。
药物级别质粒DNA组合物因而含有低于约0.01％、或低于0.001％、和优选的低于0.0001％、或优选的低于0.00002％(＜0.0002％，即＜0.0002mg每100mg质粒DNA)的RNA污染物。
药物级别质粒DNA组合物因而含有低于约0.0001％、最优选低于0.00005％蛋白质污染物。
药物级别质粒DNA组合物因而含有低于0.1EU/mg的内毒素。
药物级别质粒DNA组合物因而含有在形式上主要是环形，和更确切的说含有超过80％、85％、90％、95％，或99％的封闭环形质粒DNA。
本发明还涉及质粒DNA液体制剂，其在室温长时间稳定并保持不降解，因而对于用于研究和相关人类治疗的质粒DNA的保存是有用的。
因而本发明涉及稳定的质粒DNA制剂，其包含质粒DNA、非常稀的缓冲溶液和盐水赋形剂，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在以维持所述制剂或组合物的pH值在7和7.5之间。
能维持组合物的pH值在7和7.5之间的缓冲溶液由包含Tris[三(羟甲基)-氨基甲烷]、或赖氨酸和选自强酸(例如盐酸)或弱酸(例如顺丁烯二酸、苹果酸或乙酸)的酸的酸/碱系统，或包含Hepes[2-(4-(2-羟基乙基哌嗪)-1-基)乙磺酸]和强碱(例如氢氧化钠)的酸/碱系统组成。缓冲溶液也可以包含Tris/HCl、赖氨酸/HCl、Tris/顺丁烯二酸、Tris/苹果酸、Tris/乙酸、或Hepes/氢氧化钠。
优选的，pH值维持在7和7.5之间，更具体约7.2。
可用于本发明的制剂中的盐水赋形剂优选的是浓度在100和200mM之间，优选的浓度约150mM的NaCl。其他盐水赋形剂可以包含阴离子和阳离子，选自由醋酸盐、磷酸盐、碳酸盐、SO42-、Cl-、Br-、NO3-、Mg2+、Li+、Na+、K+和NH4+构成的组。
确定缓冲溶液的摩尔浓度以便在一定限制和一定体积内发挥缓冲效应，其中pH值稳定在7和7.5之间。根据本发明的稳定的质粒DNA保存组合物因而包含质粒DNA、盐水赋形剂和缓冲溶液，其中所述缓冲溶液以达1mM的浓度存在，优选在250μM和1mM之间，或优选在400μM和1mM之间，以维持所述制剂或组合物的pH值在7和7.5之间。在根据本发明的缓冲系统之中，浓度400μM的Tris缓冲液溶液给出了特别令人满意的结果，因而在本发明的质粒制剂中是优选的。
如在以下的实施例中所示，根据本发明的质粒DNA制剂展现出在4℃和在室温(RT)，例如20或25℃的极好的稳定性。具体地，质粒DNA制剂在25℃例如RT，可使用1个月、2个月、3个月、到6个月和达12个月的持续时间。
本发明因而涉及包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，足以在4℃到25℃将质粒DNA保持在稳定形式。
本发明还涉及包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，其足以在4℃到25℃将质粒DNA以稳定形式保存1个月、2个月、3个月、到6个月和达12月的延长的时间。
实际上，保存在5℃或在室温的质粒DNA在长时间期间展现出非常低的脱嘌呤作用和开环化速率，低于20％、15％、10％、5％或≤1％每月。
根据本发明组合物可以进一步包含佐剂，例如选自聚乙二醇、pluronic、或聚山梨酸酯糖、或醇的聚合物。
根据另一个方面，本发明涉及在组合物中保存质粒DNA的方法，包括a)从质粒DNA制备纯化的样品和b)将所述质粒DNA的纯化的样品与盐水赋形剂和缓冲溶液组合，所述缓冲溶液维持产生的组合物的pH值在7和7.5之间。
本发明还涉及在达到约20℃的温度在组合物中保存质粒DNA的方法，包括a)制备质粒DNA的纯化的样品，b)将所述质粒DNA的纯化的样品与盐水赋形剂和缓冲溶液组合，其中所述缓冲溶液以低于1mM、或250μM到1mM、优选400μM的浓度存在；和c)在约4℃到达约20℃的温度保存所述质粒DNA组合物。
实施例克隆和分子生物学的普通技术在文献中(Maniatis et al.，T.，E.F.Fritsch，and J.Sambrook，1989.Molecular cloninga laboratory manual，second edition.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York；Ausubel F.M.，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G Seidman and K.Struhl.1987.Current protocols in molecular biology 1987-1988.John Willey and Sons，NewYork.)描述了分子生物学的传统方法，例如用限制性内切酶消化、凝胶电泳、转化大肠杆菌、核酸的沉淀等等。通过根据已经公开的方案(Ausubel et al.，1987)的链终止法确定核苷酸序列。
限制性内切酶由New England Biolabs，Beverly，MA(Biolabs)提供。
为了进行连接，DNA片段在包含50mM Tris/HCl pH 7.4、10mMMgCl2、10mM DTT、2mM ATP的缓冲液中，在存在噬菌体T4DNA连接酶(Biolabs)的情况下保温。
用Biosearch 8600自动DNA合成仪，根据厂家的推荐，用在β位置被cyanoethyl基团保护的亚磷酰胺(phosphoramidite)(Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus and H.K？ster，1984.Polymer support oligonucleotide synthesis，XVIIIUse of β-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragmentssimplifying deprotection and isolation oo the final product.Nucl.Acids Res.，12，4539-4557Giles，J.W.1985.Advances in automated DNA synthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec.)，使用亚磷酰胺化学作用合成寡核苷酸。
需要检测其转化效力的连接的DNA被用于转化以下感受态菌株大肠杆菌DH5α[F/endAl，hsdR17，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，Δ(lacZYA-arqF)U169，deoR，Φ80dlac(lacZΔM15)](对于任何Col E1质粒)；或E.coli XAC-pir(对于任何pCor衍生的质粒)。
根据Klein et al.，1980的方案制造质粒DNA的迷你制品(minipreparations)。
LB培养基用于大肠杆菌菌株的生长(Maniatis et al.，1982)。菌株在37℃保温。细菌在补充有适合的抗生素的LB培养基的平皿上涂布。
实施例1在连续裂解系统的螺管中使用的直径到流速的调整根据雷诺数(Reynolds numbers)的计算。因为以下的分析假定流体的性状是牛顿性的(Newtonian)，以下报告的数字仅是在B1a中完全有效和在B2中在一定程度上有效。
雷诺数的数值容许本领域的技术人员确定遇到的性状(behavior)的类型。在此，我们将仅关注管道中的流体流动(水力工程)。
1)非牛顿流体在工业中最常遇到的两种非牛顿流体是Bingham和Ostwald de Waele。
在这种情况下，雷诺数(Re)如下计算ReN是广义雷诺数ReN＝(1/(2n-3))×(n/3n+1)n×((ρ×Dn×w2-n)/m) (1)D横截面的内径(m)ρ流体的体积质量(volum nass)(kg/m3)w流体的空间速度(m/s)n流动性状(behavior)指数(无量纲的)m流体稠度系数(dyn.sn/cm2)n和m是经验性确定的(流变性状的研究)。
2)牛顿流体对于第一节，在式(1)中我们有Re＝f(内径、μ、ρ和u)因为n和m是μ的函数。
Re＝(u×D×ρ)/μ (2)ρ流体的体积质量(kg/m3)μ流体的粘度(Pa.s，1mPa.s＝1cP)D横截面的内径(m)u流体的平均空间速度(m/s)式(1)，对于n＝1，换算成式(2)。
Q＝流速(m3/h)和S＝横截面的表面面积(m2)和如果μ是cP中给出的，则Re＝(4×(Q/3600)×ρ)/((μ/1000)×∏×D) (3)在圆形的导管中，低于2500的雷诺数流动是层流，2000和500,000之间的雷诺数流动是水力学平滑的湍流。在2000和2500之间的界限被故意地含糊，两种性状类型都被用于确定将会发生什么，根据经验进行选择。
3)计算因为n和m通常是未知的，以下的近似值被用于估计趋势牛顿流体(在所有横截面中)ρ＝1000kg/m3(所有流体)μ＝B1a中为5cP和B1b中为40cP(我们的数据)B2中为2.5cP(我们的数据)对于称为结构1和结构2(没有B1b管道)的两种标准管道结构使用式(3)进行以下的计算表2
在这两种结构中，在所有的阶段流动是层流，溶液不能充分地互相混合。
对于其他管道结构(非B1b管道)，我们有
表3
对于同时存在B1a和B1b管道的各种管道结构使用式(3)进行类似的计算表4
明显地，可以通过调整管道直径和流速获得预定的雷诺数值。
对于B2或对于两节的B1(B1a和B1b)，本领域的技术人员可以预想许多直径和长度的组合。例如，B1的第一部分可以从6mm减少到3mm来降低长度和提高搅动。另外，n和m可以通过对流体的流变特性的研究来确定，并用来确定管道的正确特征。
除了搅动效率之外，还要考虑搅动的持续时间，在本发明的某些实施方式中这可以通过调整螺管的长度来获得。
管道的直径或流体速度看起来在式(1)中不支配非牛顿流体(数据未显示)。换句话说，如果式(1)被用来计算B1b和B2内的情况，与改变流速相比，改变直径看起来不会更有效。当需要高流速时，直径可以随流速一同改变。
这些原则可被用作尽可能地在B1b和B2中限制搅动的基础，以避免gDNA断裂。
在裂解期间，只要gDNA不变性，搅动可以是相当有力的。在B1的开始处降低直径使得提高搅动(提高的Re)以充分混合溶液2和细胞成为可能。另一方面，当细胞被裂解时，可以降低搅动和对管壁的摩擦力以避免核酸断裂。增加直径使得降低搅动(降低的Re)和摩擦(降低的速度)成为可能。
M1混合流体。
B1a在裂解开始时对混合进行微调对流现象(大混合macromixing)。
B1b使得变性发生加上扩散现象(微量混合)。
假定广义雷诺数对非牛顿流体具有与标准雷诺数对牛顿流体一样的意义。具体地，假定在圆形截面的导管中层流法的界限是ReN＜2300。
中和作用在B2内进行。由于引起太有力的的搅动和与管壁的摩擦力(机械应力)，高流速倾向于提高基因组DNA的断裂。使用大直径的管道使得降低搅动(Re)和摩擦力(速度)成为可能。我们在此放置了小直径管道(6mm)来避免不充分的搅动。我们的观察结果显示，为了避免“强力和快速”搅动中和的溶胞产物，B2仅有小直径管道是最佳的。
实施例2我们可以将CL系统分解成5个步骤在特定的实施方式中，结构如下1)混合细胞(溶液1中)+溶液2(M1+3m的6mm管道)。开始通过SDS的细胞裂解，只要DNA不变性就没有断裂的风险。
2)裂解结束和gDNA变性(13m、16mm的管道)。
3)混合溶胞产物+溶液3(M2+3m、6mm的管道)。
4)在4℃收获中和的溶胞产物5)在4℃过夜沉降絮状物和gDNA大片段以下条件可用于进行连续裂解-溶液1EDTA 10mM、葡萄糖(Glc)9g/l和Tris HCl 25mM，pH 7.2。
-溶液2SDS 1％和NaOH 0.2N。
-溶液3乙酸2M和乙酸钾3M。
-流速60l/h溶液1和溶液2-流速90l/h溶液3。
-细胞用溶液1调整到38.5g/l。
溶液1中的细胞通过将它们分散到溶液2中的3个管口，溶液2从反方向到达。
-混合器M1具有几何结构，使得优化双流体的的混合成为可能(参见附图2，混合器的示意图)。
-混合器M1后的管道的第一个部分是B1a，接下来的部分是B1b。
B1a3m长、6mm直径，2.5秒停留时间B1b13m长、16mm直径、77秒停留时间本发明的过程提高了有关效率的优点，概述为分散、短暂的剧烈混合，和通过扩散的温和混合。
使用本发明的过程，裂解的细胞的数目提高了，因而回收的pDNA的数量提高了。
扩散的想法是特别重要的，因为由于流体的性质，特别是粘弹性难以混合这些流体。
本发明的过程使得限制剪切应力因而限制gDNA的断裂成为可能，便于在随后的层析纯化中除去gDNA。
然后的问题是与溶液3混合，其可以被冷却到4℃。在一个实施方式中，本发明的过程使用-混合器M2，其是内径约10mm的Y形装置-管道B2的部分放置在混合器M2之后。
B22m的6mm管道；停留时间1秒以下的表5给出了比较测试中获得的结果，显示了我们的连续裂解法与分批裂解相比的优点。
表5
实施例3
使用的柱是1ml HiTrap柱，用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，Pharmacia)活化，连接到螺形压缩泵(输出＜1ml/min。使用的特异性寡核苷酸在5’末端具有NH2基团，其序列如下5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1)用于这个实施例的缓冲液如下偶联缓冲液0.2M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3。
缓冲液A0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH 8.3。
缓冲液B0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH 4。
所述柱用6ml的1mM HCl洗涤，然后将稀释在偶联缓冲液(1ml中50nmol)中的寡核苷酸施加到柱上，在室温保持30分钟。所述柱按6ml缓冲液A然后6ml缓冲液B的顺序洗涤三次。因而寡核苷酸通过CONH连接共价地结合到柱上。将柱保存在4℃，PBS、0.1％NaN3中，可使用至少4次。
合成以下两种寡核苷酸寡核苷酸48175’-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAGAGAGAAGAA GAAGAAGG-3’(SEQ ID NO13)和寡核苷酸48185’-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTTTCTCG-3’(SEQ ID NO14)这些寡核苷酸，当杂交并克隆到质粒中时，向相应的质粒中导入同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO15)，如上所述。
相应于这两个杂交寡核苷酸的序列被克隆在质粒pBKS+(StratageneCloning System，La Jolla CA)的多克隆位点，该质粒携带氨苄青霉素抗性基因。为此，按以下方式杂交寡核苷酸1μg的所述两种寡核苷酸被一同放置在40ml最终缓冲液中，所述缓冲液包含50mM Tris-HCl pH 7.4、10mMMgCl2。将这个混合物加热到95℃，然后置于室温，使得温度缓慢降低。在30μl最终缓冲液中，10ng的杂交的寡核苷酸的混合物与用BamHI和EcoRI消化的200ng质粒pBKS+(Cloning System，La Jolla CA)连接。连接之后，将等分量转化到DH5a中。将转化的混合物涂布到补充有氨苄青霉素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的L培养基上。在这个培养基中重组克隆应当显示没有蓝色着色，与允许大肠杆菌β-半乳糖苷酶的片段ω的α-互补的亲本质粒(pBKS+)相反。在迷你制备(minipreparation)来自6个克隆的质粒DNA之后，它们全部显示了位于pBKS+的EcoRI和BamHI位点之间的PstI位点的消失，和含有多克隆位点的448-bp PvuII条带的分子量增加。选择一个克隆，相应的质粒被命名pXL2563。通过使用质粒pBKS+(Stratagene Cloning System，LaJolla CA)的引物-20(5’-GACCGGCAGCAAAATG-3’SEQ ID NO16))(Viera J.and J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived system forinsertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene，19，259-268)测序证实克隆的序列。根据供应商的推荐根据Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化质粒pXL2563。这个质粒DNA制备物此后用于以下描述的实施例中。
在如1.1.描述的与寡核苷酸偶联的HiTrap柱上，从还含有质粒pBKS+的溶液中纯化质粒pXL2563。
用于这个纯化的缓冲液如下缓冲液F2M NaCl、0.2M醋酸盐，pH 4.5到5。
缓冲液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
所述柱用6ml缓冲液F洗涤，将质粒(400μl缓冲液F中的20μgpXL2563和20μg pBKS+)施加到柱上，在室温下保温2小时。用10ml缓冲液F洗涤柱，然后用缓冲液E进行洗脱。在1％琼脂糖凝胶上电泳和溴化乙锭着色后检测质粒。溶液中质粒的比例通过测量它们对大肠杆菌的转化活性来估计。
从含有30％pXL2563和70％pBKS+的混合物开始，在柱出口收获了含100％pXL2563的溶液。通过260和280nm的OD比值估计的纯度，从1.9提高到2.5，这显示了通过这种方法除去了污染蛋白质。
实施例4将寡核苷酸(5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1))偶联到柱上通过如实施例3描述的进行。为了偶联，寡核苷酸在5’末端用胺基修饰，所述胺基通过含有6个碳原子的臂与间隔区的磷酸酯连接(Modified oligonucleotide Eurogentec SA，Belgium)。根据供应商的推荐使用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化质粒pXL2563。用于这个实施例的缓冲液如下缓冲液F0-2M NaCl、0.2M醋酸盐，pH 4.5到5。
缓冲液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
所述柱用6ml缓冲液F洗涤，然后将在400μl缓冲液F中稀释的100μg pXL2563施加到柱上，在室温保温2小时。用10ml缓冲液F洗涤柱，然后用缓冲液E进行洗脱。通过在260nm测量光密度给质粒定量。
在这个实施例中，结合在缓冲液中进行，缓冲液的NaCl的摩尔浓度为从0到2M(缓冲液F)。当NaCl的摩尔浓度下降时，纯化产量减少。结合缓冲液的pH值可以从4.5到5，纯化产量在4.5更好。也有可能使用碱性pH值的另一种洗脱缓冲液因而洗脱用包含50mM硼酸盐，pH 9，0.5mMEDTA的缓冲液进行。
将寡核苷酸(5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1)偶联到柱上如实施例3描述的进行。根据供应商的推荐使用WizardMegaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化质粒pXL2563。用于这个缓冲液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
所述柱用6ml缓冲液F洗涤，然后将在400μl缓冲液F中稀释的100μg pXL2563施加到柱上，在室温保温一个小时。用10ml缓冲液F洗涤柱，然后用缓冲液E进行洗脱。测量通过寡核苷酸柱之前和之后存在于质粒样品中的基因组或染色体大肠杆菌DNA的含量。使用大肠杆菌galK基因中的引物通过PCR给这个基因组DNA定量。根据以下方案这些引物的序列由Debouck et al.(Nucleic Acids Res.1985，13，1841-1853)描述5′-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3′(SEQ ID NO17)和5′-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3′(SEQ ID NO18)。
反应培养基包括，在25μl CR缓冲液(Promega France，Charbonnières)中1.5mM MgCl2；0.2mM XTP(Pharmacia，Orsay)；0.5μM引物；20U/mlTaq聚合酶(Promega)。根据以下顺序进行反应-95℃ 5分钟-95℃ 10秒 30个循环60℃ 30秒78℃ 1分钟
-78℃ 10分钟。
扩增的DNA片段长度124个碱基对，在存在SybrGreen I(MolecularProbes，Eugene，USA)的情况下通过在3％琼脂糖凝胶上电泳分离，然后参考来自大肠杆菌菌株B(Sigma，ref D4889)的Ultrapur基因组DNA系列进行定量。
实施例5这个实施例描述了以所谓“迷你制备”规模从细菌培养物的澄清溶胞产物纯化质粒DNA离心1.5ml含有质粒pXL2563的DH5α菌株过夜培养物，将沉淀重悬浮在100μl 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mMEDTA中。添加200μl 0.2M NaOH，1％SDS，翻转试管进行混合，然后添加150μl、3M乙酸钾，pH 5，翻转试管混合。在离心之后，收回上清液，加载到如实施例1所述获得的寡核苷酸柱上。结合、洗涤和洗脱与实施例3中描述的相同。从1.5ml培养物中回收了大约1μg质粒。获得的质粒，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭着色分析，呈“超螺旋”环状DNA的单个条带的形式。在通过这个方法纯化的质粒中没有检测到高分子量(染色体)DNA，或RNA的痕迹。
实施例6这个实施例描述了在与实施例5相同的条件下进行的质粒DNA纯化实验，从20ml含有质粒pXL2563的DH5α菌株细菌培养物开始。用2ml 0.2M NaOH，1％SDS进行裂解，用1.5ml 3M乙酸钾，pH 5进行中和。然后用3ml 2-丙醇(propanol)沉淀DNA，沉淀加入0.5ml 0.2M醋酸钠，pH 5，0.1M NaCl中，加载到如以上实施例描述获得的寡核苷酸柱上。柱的结合、洗涤和洗脱如以上实施例描述的进行，不同的是洗涤缓冲液的NaCl摩尔浓度是0.1M。获得的质粒，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭着色分析，呈“超螺旋”环状DNA的单个条带的形式。纯化的质粒中没有检测到高分子量(染色体)DNA，或RNA的痕迹。用限制性内切酶消化质粒得出3千碱基的预期分子量的单个条带。使用的质粒含有盒，所述盒含有巨细胞病毒启动子、萤光素酶编码基因和来源于质粒pXL2563的同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO15)。含有这个质粒的菌株DH1(Maniatis et al.，1989)在7升发酵罐中培养。从200克细胞制备澄清的溶胞产物细胞沉淀置入2升25mM Tris，pH 6.8，50mM葡萄糖，10mM EDTA中，向其中添加2升0.2M NaOH，1％SDS。通过添加一升3M乙酸钾中和溶胞产物。渗滤之后，将4ml这种溶胞产物施加到5ml HiTrap-NHS柱上，所述柱根据实施例3中描述的方法与序列(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO1)的寡核苷酸偶联。如以上实施例描述的进行洗涤和洗脱。
实施例7这个实施例描述了带有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸的使用。使用的寡核苷酸的序列如下5′-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3′(SEQ ID NO19)这个寡核苷酸具有5’末端的NH2基团。MeC＝5-甲基胞嘧啶。这个寡核苷酸允许质粒pXL2563在实施例1的条件下用pH 5的结合缓冲液纯化(从而降低了质粒降解的风险)。
实施例8在以上实施例中，使用的寡核苷酸是在5’末端用胺基修饰的，所述胺基通过含有6个碳原子的臂NH2-(CH2)6与磷酸酯连接。在这个实施例中，胺基与5’末端的磷酸酯通过含有12个碳原子的臂NH2(CH2)12连接。寡核苷酸的偶联和过柱用缓冲液F2M NaCl，0.2M醋酸盐，pH 4.5，如实施例3中描述的进行。这个寡核苷酸使得具有更好的纯化产量成为可能获得了53％的产量，而使用含有6个碳原子的寡核苷酸，这个产量是相同条件下的产量的45％。
实施例9在实施例3描述的克隆策略之后，构建另外两个携带同型嘌呤-同型嘧啶序列的质粒含有序列(GGA)16，(SEQ ID NO20)的质粒pXL2725，和含有序列(GA)25(SEQ ID NO21)的质粒pXL2726。
质粒pXL2725和pXL2726，类似于质粒pXL2563，根据实施例3中描述的克隆策略构建，使用以下寡核苷酸对
59865′-GATCC(GA)25GGG-3′(SEQ ID NO22)59875′-AATTCCC(TC)25G-3′(SEQ ID NO23)59815′-GATCC(GGA)17GG-3′(SEQ ID NO24)59825′-AATT(CCT)17CCG-3′(SEQ ID NO25)寡核苷酸对5986和5987被用于通过将寡核苷酸克隆到pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的BamHI和EcoRI位点来构建质粒pXL2726，而寡核苷酸5981和5982被用于质粒pXL2725的构建。使用与构建质粒pXL2563相同的实验条件，仅仅改变寡核苷酸对。类似地，克隆序列通过在质粒上测序证实。这允许看出，质粒pXL2725具有相对于预期序列的修改不是序列GGA重复17次，而是存在GGAGA(GGA)15(SEQID NO26)。
实施例10与这些同型嘌呤序列形成三螺旋的寡核苷酸根据实施例1.1中描述的技术偶联到HiTrap柱，序列5′-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3′(SEQID NO27)的寡核苷酸被用于纯化质粒pXL2725，序列5′-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQ ID NO28)的寡核苷酸被用于纯化质粒pXL2726。
这样获得的两个柱允许根据实施例2中描述的技术纯化相应的质粒，使用以下缓冲液缓冲液F2M NaCl、0.2M醋酸盐，pH 4.5。
缓冲液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
对于pXL2725和pXL2726获得的产量分别是23％和31％。
实施例11这个实施例说明了存在于质粒中的特异性序列的长度对纯化产量的影响。
用于这些实验以表明本发明的组合物的活性的报告基因是编码萤光素酶(Luc)的基因。
质粒pXL2621含有含661-bp巨细胞病毒(CMV)启动子的盒，所述巨细胞病毒启动子是通过用限制性内切酶MluI和HindIII从pcDNA3(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中切出，在编码萤光素酶的基因的上游、在MluI和HindIII位点，克隆到载体pGL basic Vector(Promega Corp.Madison，WI)中。使用分子生物学的标准技术构建这个质粒。
按以下方式构建质粒pXL2727-1和pXL2727-2两微克质粒pXL2621用BamHI线性化；通过在65℃处理10分钟钝化酶；这时，如对于质粒pXL2563的构建所描述的那样杂交寡核苷酸6006和6008。
60065′-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3′(SEQ ID NO29)60085′-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3′(SEQ ID NO30)。
将这个杂交混合物克隆到质粒pXL2621的BamHI末端，在转化到DH5α中之后，重组的克隆通过PstI酶限制性分析鉴别，因为寡核苷酸导入了PstI位点。选择两个克隆，克隆的片段的核苷酸序列使用引物(6282，5′-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3′(SEQ ID NO31))作为测序反应引物来证实(Viera J.and J.Messing，1982.The pUC plasmids an M13mp7-derivedsystem for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universalprimers.Gene 19259-268)。
第一个克隆(pXL2727-1)含有重复10次的序列GGA。第二个(pXL2727-2)含有序列5′-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3′(SEQ ID NO32)。
使用如在实施例3中描述的一个柱，其与寡核苷酸5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO1)偶联。
质粒pXL2727-1携带序列GAA的14个重复。如上所述寡核苷酸仅含有相应杂交序列CTT的7个重复，因而可以在8个不同位置与质粒杂交。质粒pXL2727-2与此相反，具有与结合到柱上的寡核苷酸相同长度的杂交型序列(GAA)7(SEQ ID NO36)。这个寡核苷酸因而可以在pXL2727-2的仅一个位置上杂交。
实验与实施例4中描述的相同，使用以下缓冲液缓冲液F2M NaCl、0.2M醋酸盐，pH 4.5。
缓冲液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
纯化产量对于质粒pXL2727-1为29％，对于pXL2727-2为19％。
使用的细胞是NIH 3T3细胞，在实验前的当天以50,000细胞/孔接种到24孔培养平板中。质粒在150mM NaCl中稀释，并与lipofectantRPR115335混合。使用等于6的lipofectant正电荷/DNA负电荷比例。涡旋混合物，在室温放置10分钟，在无胎儿牛血清的培养基中稀释，然后以每培养孔1μg DNA的比例添加给细胞。在37℃2小时后，添加10％体积/体积的胎儿牛血清，在存在5％CO2的情况下、37℃保温细胞48小时。细胞用PBS洗涤两次，根据所描述的方案(Promega kit，Promega Corp.Madison，WI)在Lumat LB9501光度计(EG and G Berthold，Evry)上测定萤光素酶活性。如实施例8.2中所描述进行纯化的质粒pXL2727-1得到的转染产量两倍于使用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化的相同质粒所获得的产量。
实施例12以下实施例表现了使用三螺旋亲和层析纯化pCOR衍生的质粒。这种技术已经被证明去除核酸污染物(具有是宿主基因组DNA和RNA)至常规的层析方法未曾达到的低水平。
三联体亲合凝胶用Sephacryl S-1000 SF(Amersham-Pharmacia Biotech)作为层析基质来合成。首先用0.2M醋酸钠(pH 4.7)中的m-高碘酸钠(3mM，室温，1h)活化Sephacryl S-1000。如早先描述的用于偶联蛋白质的情况一样(Hornsey et al.，J.I mmunol.Methods，1986，93，83-88)，在存在抗坏血酸(5mM)的情况下通过还原胺化作用、通过寡核苷酸的5’-NH2末端部分将寡核苷酸偶联到所述活化的基质的醛基上。用于这些实验的同型嘧啶寡核苷酸(来自Eurogentec，HPLC纯化)具有与存在于pCOR质粒的复制起点(oriγ)中的短14-mer同型嘌呤序列(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO10)互补的序列(Soubrier et al.，Gene Therapy，1999，6，1482-1488)。如以上讨论的，同型吡啶寡核苷酸的序列是5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO11)。
对以下质粒进行层析pXL3296(无转基因的pCOR，2.0kpb)、pXL3179(pCOR-FGF，2.4kpb)、pXL3579(pCOR-VEGFB，2.5kbp)、pXL3678(pCOR-AFP，3.7kbp)、pXL3227(pCOR-lacZ 5.4kbp)和pXL3397(pCOR-B缺失的FVIII，6.6kbp)。所有这些质粒通过两个阴离子交换层析步骤从如实施例4中所描述获得的澄清溶胞产物中纯化。还研究了通过在CsCl中超速离心纯化的质粒pBKS+(pBluescript II KS+来自Stratagene)，所述质粒为一种ColE1衍生的质粒。使用的所有质粒都处于它们的超螺旋(＞95％)拓扑状态。
在每个质粒DNA纯化实验中，将在6ml 2M NaCl、0.2M乙酸钾(pH 5.0)中的300μg质粒DNA以30cm/h的流速加载到含有上述寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO11)的亲和柱上。在用5倍体积的相同缓冲液洗涤柱之后，用1M Tris/HCl、0.5mM EDTA(pH 9.0)洗脱结合的质粒，并通过UV(260nm)定量，用Millipore Gen-Pak柱进行离子交换层析(Marquetet al.，BioPharm，1995，8，26-37)。在收集的级分中回收的质粒pXL3296是207μg、pXL3179是196μg、pXL3579是192μg、pXL3678是139μg、pXL3227是97μg，pXL3397是79μg。
当pBKS在这个柱上层析时，未能检测到质粒结合(＜3μg)。这表明寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO11)与存在于pCOR(oriγ)中的互补14-mer序列5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(SEQ ID NO10)形成稳定的三联体结构，但不与存在于pBKS中的近相关(closely related)序列5′-AGAAAAAAAGGA-3′(SEQ ID NO8)形成所述三联体结构。这表明，单个非常见三联体(在这种情况下T*GC)的引入引起了三联体结构的完全的去稳定化。
作为对照，当pXL3179在严格相似的条件下合成但没有寡核苷酸的空白柱上进行层析时没有观察到质粒结合(＜1μg)。
通过在在此报告的条件下操作这种亲合纯化柱，对于pXL3296的制备物，宿主基因组DNA的污染水平从2.6％降低到0.07％。类似地，对于pXL3179的制备物，当通过相同的亲和柱层析样品时，宿主DNA的污染水平从0.5％降低到0.008％。
实施例13以下实施例表现了使用三螺旋亲和层析纯化ColE1衍生的质粒。这种技术已经被证明除去核酸污染物(具体是宿主基因组DNA和RNA)至常规的层析方法未曾达到的低水平。
通过如上述实施例所描述的将具有序列5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO9)的寡核苷酸偶联到高碘酸盐氧化的Sephacryl S-1000SF上，来合成三联体亲合凝胶。
质粒pXL3296(没有转基因的pCOR)和ColE1衍生的质粒pBKS，在如实施例9描述的条件下，在含有寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ IDNO9)的1-ml柱上进行层析。在收集的级分中回收的质粒pBKS是175μg，pXL3296＜1μg。这表明寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO9)与存在于pBKS中的互补12-mer序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO8)形成稳定的三联体结构，而不与存在于pCOR中的非常近相关的12-mer序列(5’-AGAAAAAAAAGA-3’)(SEQ ID NO34)形成所述三联体结构。这表明，单个非常见三联体(在这种情况下C*AT)的引入可能引起了三联体结构的完全去稳定化。
实施例14通过以下方法在无挡板的锥形烧瓶中生产种子培养物。将工作细胞库接种到含有M9modG5培养基的锥形烧瓶中，播种率0.2％v/v。菌株以220rpm在旋转震摇器中在37℃±1℃下培养约18±2小时直到葡萄糖耗尽。这产生200ml种子培养物。培养物的光密度预期是A600约2-3。
然后在第一发酵罐中产生预培养物。种子培养物无菌地转移到含有M9modG5培养基的预发酵罐中以确保0.2％(v/v)的播种率，在通风和搅动下培养。pO2维持在40％的饱和度以上。当在16小时后葡萄糖被消耗时，收获培养物。这产生约30升预培养物。培养物的光密度预期是A600约2-3。
然后在第二发酵罐中产生主要的培养物。将30升预培养物无菌地转移到装有270升灭菌的FmodG2培养基的发酵罐中以确保约10％(v/v)的播种率。以分批模式开始培养以建立某些生物量。在约4小时后一旦最初的糖耗尽就开始添加葡萄糖补料。控制通风、搅动、pO2(40％)、pH(6.9±0.1)、温度(37±1℃)、葡萄糖补料以维持比生长速率接近0.09h-1。在约35小时的补料后结束培养。这产生约400升培养物。培养物的光密度预期是的A600约100。
进行第一分离步骤，称为细胞收获。用圆盘层叠离心(disk stackcentrifuge)收获生物量。浓缩肉汤3至4倍以抵消消耗的培养基，连续地重悬浮在400升无菌的S1缓冲液中。这产生约500升的预调节的生物量。DCW＝25±5g/L。
进行第二分离步骤，称为浓缩步骤。在S1缓冲液中重悬浮/均化之后，再次用分离器处理细胞以产生浓缩的浆液。这产生约60-80升的洗涤的和浓缩的浆液。DCW＝150±30g/L；pDNA＝300±60mg/L。
然后进行冷冻步骤。将浆液无菌地分配到20-L FlexboyTM袋中(填充到容量的50％)，随后在进一步的下游处理之前在-20±5℃冷冻。这产生冷冻的生物量。pDNA＝300±60mg/L；超螺旋形式＞95％。
然后进行细胞解冻步骤。将冷冻袋加热到20℃，细胞浆液用100mMTris氢氯化物、10mM EDTA、20mM葡萄糖稀释到40g/L，pH 8.0，在细胞裂解前、在搅动下将悬浮液置于20±2℃1h。产生解冻的生物量浆液。pH＝8.0±0.2。
在这个步骤可以使用约20℃的温度。
然后进行碱裂解步骤。细胞裂解步骤包括将稀释的细胞悬液用0.2NNaOH-35mM SDS(溶液S2)通过管路混合器泵入，随后是在螺管中的连续接触步骤。连续接触步骤是为了确保完全的细胞裂解和基因组DNA以及蛋白质的变性。在收集到冷却的搅动容器中之前，裂解的细胞的溶液在管路中与冷却的3M乙酸钾-2N乙酸的溶液3(S3)混合。添加溶液S3引起基因组DNA、RNA、蛋白质和KDS的沉淀。
接下来进行溶胞产物过滤。中和的溶胞产物然后在不搅动的条件下、在5±3℃保温2到24h，通过3.5mm筛网(grid)过滤器过滤除去大部分沉淀的物质(絮状物阶段)，之后是深度过滤(depth filtration)作为抛光(polishing)过滤步骤。这产生澄清的溶胞产物，超螺旋质粒的浓度超过90％。
然后进行阴离子交换层析。澄清溶胞产物溶液用净化水稀释到目标传导率值50mS/cm，通过双层过滤器(3μm-0.8μm)过滤，加载到阴离子交换层析柱上。使用充满了11.0L FractogelTMAE HiCap(M)树脂(Merck；#1.10316.5000)的300-mm柱。将澄清溶胞产物加载到柱上，使用NaCl的分步梯度进行洗脱。结合到柱上的大部分污染物用NaCl溶液以约61mS/cm洗脱，DNA质粒用NaCl溶液以约72mS/cm洗脱。这产生具有高浓度质粒DNA的离子交换层析洗出物。
在这之后是三联体亲和层析。来自阴离子交换层析柱的洗出物用约0.5倍体积的含有4.8M NaCl的500mM醋酸钠溶液(pH 4.2)稀释，泵过用含有2M NaCl的50mM醋酸钠(pH 4.5)平衡的三联体亲和层析柱。柱的直径300mm，含有10.0L THAC SephacrylTMS-1000凝胶(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)。柱用含有1M NaCl的50mM醋酸钠溶液(pH 4.5)洗涤，NV1FGF用含有0.5mM EDTA的100mM Tris(pH 9.0)洗脱。这产生具有高浓度质粒DNA的三联体亲和层析洗出物。
之后进行疏水性相互作用层析步骤。亲和层析柱的洗出物用3.6倍体积的Tris中的3.8M硫酸铵溶液(pH 8.0)稀释。通过0.45μm过滤器过滤之后，滤出物以60cm/h加载到填满9.0L ToyopearlButyl-650S树脂(TosoH corp.，Grove City，OH)的疏水性相互作用柱(直径300mm)。柱用硫酸铵溶液以约240mS/cm洗涤，NV1FGF用硫酸铵以220mS/cm洗脱。这产生无松弛形式的HIC洗出物。
根据优选的实施方式，进行进一步的渗滤步骤。根据本领域已知的标准技术，在这个过程中适合使用标准的、商业上可获得的渗滤材料。优选的渗滤方法是根据质粒的大小使用具有30,000到500,000范围内的分子量截留值的超滤膜。这个渗滤步骤容许进行缓冲液交换和浓缩。步骤12的洗出物通过切向流动过滤(膜截留值，30kDa)浓缩3到4倍达到约2.5到3.0mg/mL的目标浓度，浓缩物通过以恒定体积利用10倍体积的盐水进行渗滤来进行缓冲液交换，用盐水调节到目标质粒浓度。根据浓缩物样品在260nm的吸光率计算NV1FGF浓度。通过0.2μm capsule过滤器过滤NV1FGF溶液，保存在2-8℃的冷藏室中的容器中直到进一步的处理。这产生了纯化的浓缩物，其中超螺旋质粒的质粒DNA浓度约70％、75％、80％、85％、90％、95％，优选99％。使用这个过程总的质粒回收为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和80％，平均回收率为60％。
实施例15包括离子交换层析步骤、三螺旋亲和层析步骤和疏水层析步骤的以上实施例的方法，产生比早先已知的方法更为纯的质粒DNA制备物。已经将这种新方法与早先已知的方法比较，这种新方法产生的pDNA制备物具有数量低得多的基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素。这在附图6中显示了。这些实验显示了与一些有效去除所有污染物的2步组合相比，AEC、THAC和HIC提供了令人惊讶的更高纯度的产量。就从其他生物材料和污染物，例如蛋白质和内毒素、RNA和基因组DNA，以及开放环形质粒中分离质粒DNA的效力而言，这些步骤的组合提供了明显的协同作用。此外，根据本发明的协同的步骤组合即AEC/THAC/HIC使得不仅获得了高度纯化的药学级别的质粒DNA，而且获得了高度纯化和完全超螺旋的，超过80％、85％、90％、95％和超过99％质粒DNA的组合物。
实施例16用于高度纯化的质粒DNA制备物的制备的上述实施例的方法包括离子交换层析步骤、三螺旋亲和层析步骤和疏水层析步骤，其与早先已知的方法进行比较。如附图4所示，根据本发明的方法令人惊讶地产生这样的pDNA制备物，其中有亚-ppm范围内的数量少得多的基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素。并且，如附图4所示，本发明的方法显示了获得的产品量(product quality)达到10g。
实施例17根据以下条件如实施例14描述的进行渗滤步骤使用用于步骤a和步骤b的缓冲液来确定最好的条件iii)第一次渗滤(步骤a)，相对于12.5到13.0倍体积的50mM Tris/HCl、150mM NaCl，pH 7.4(称为缓冲液I)，和iv)对以上步骤a)的滞留物进行第二次渗滤(步骤b)，相对于3.0到3.5倍体积的盐水赋形剂(150mM NaCl)。
根据本发明的这个选择性渗滤步骤有效地和广泛地除去硫酸铵和EDTA。并且，在这个渗滤步骤之后，获得了约150mM的适宜目标NaCl浓度和400μM和1mM之间的最终Tris浓度。在以下的表6中提供了质粒DNA制剂组合物的实例表6
实施例18根据实施例13，用实施例17中描述的渗滤处理步骤制备了质粒DNANV1FGF API(活性药物成分)的技术批次，称为LS06。首先在约2mgAPI/mL利用13倍体积的缓冲液I对洗出物进行渗滤，产生的滞留物用约3倍体积盐水赋形剂进行渗滤。然后用0.2μm过滤器对最终的滞留物进行过滤，调节到1mg/mL。最终的API(pH 7.24)保存在5℃、Duran玻璃瓶中直到生产DP时。
对保存在Duran玻璃瓶(API)以及8-mL小瓶中用于药物产品生产的样品进行稳定性研究。在+5℃90天后，所有样品的脱嘌呤作用和开-环化作用是几乎不可检测的(≤0.3％)。在+25℃、90天后，LS06样品的脱嘌呤作用和开-环化作用速率也是相当低的。从这项研究计算的脱嘌呤作用和开-环化作用速率是≤1％每月(附图8)。
这项研究表明，在本发明的制剂中质粒DNANV1FGF的稳定性分布型是非常稳定的，其中pH值维持在约7到7.5。虽然脱嘌呤作用速率和质粒断口速率通常在+25℃强烈加速，本申请人已经证明质粒DNA甚至在RT也长时间以非降解形式保持稳定。
本说明书应当被理解为考虑了说明书内引用的参考文献的教导。说明书中的实施方式提供了本发明实施方式的举例，而不应视为限制本发明的范围。技术人员可以容易地认识到，本发明包括许多其他的实施方式。在本文中引述的全部出版物和专利通过引用将它们完全地合并。如果通过引用合并的材料抵触本说明书或与本说明书不一致，本说明书将优先于任何这样的材料。在此对任何参考文献的引述不是认为这样的参考文献是相对于本发明的现有技术。
除非另有陈述，在说明书、包括权利要求书中使用的所有表示成分数量、反应条件等的数字，都被认为是在所有情况下用用语“约”所修饰的。因此，除非另有相反的陈述，数字参数是近似值，可以依据试图通过本发明获得的期望的性质而改变。不限制将等效物的原则应用到权利要求的范围，每个数字参数应被认为考虑了有义数字的数目和常见其它方法。
除非另有陈述，在一系列元素之前的用语“至少”被理解为涉及系列中的每个元素。本领域是技术人员将使用不超过常规实验而认识到、或能够确定对在此描述的本发明的具体实施方式
的许多同等物。这种同等物意图被以下的权利要求包括。
参考文献专利WO 98/00815(utilization of T[Tee]，Pasteur Mérieux Sérums et Vaccins[Sera and Vaccines])WO 96/02658，A.L.Lee et al.，A Method for Large Scale PlasmidPurification(1996).
WO 97/23601，N.C.Wan et al.，Method for Lysing Cells(1997).
WO 99/29832，D.S.McNeilly，Method for purifying plasmid DNA andplasmid DNA substantially free of genomic DNA(1999).
U.S.Patent No.6,214,568，D.S.McNeilly Method for purifying plasmidDNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA(2001).
出版物H.C.Birnboim and J.Doly，A rapid alkaline extraction procedure forscreening recombinant plasmid DNA Nucleic Acid Research7(6)1513-1523(1979).
D.Stephenson，F.Norman and R.H.Cu mming，Shear thickening of DNAin SDS lysates Bioseparation 3285-289(1993).
M.S.Levy，L.A.S.Ciccolini，S.S.S.Yim，J.T.Tsai，N.Titchener-Hooker，P.Ayazi Shamlou and P.Dunnill，The effects of material properties and fluid flowintensity on plasmid DNA recovery during cell lysis Chemical EngineeringScience 543171-3178(1999).
序列表<110>森特利昂公司(Gencell sAs)<120>药物级别质粒DNA的制备方法<130>GC03001-PCT<150>US 60/503,464<151>2003-09-17<150>US 60/563,008<151>2004-04-19<160>34<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>1gaggcttctt cttcttcttc ttctt25<210>2<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>2aagggaggga ggagaggaa19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>3aaggagagga gggagggaa19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>4ttggtgtggt gggtgggtt19
<210>5<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>5cttcccgaag ggagaaagg19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>6gaagggcttc cctctttcc19<210>7<211>13<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7gaaaaaggaa gag13<210>8<211>12<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8agaaaaaaag ga12<210>9<211>12<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>9tctttttttc ct12<210>10
<211>14<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>10aagaaaaaaa agaa14<210>11<211>14<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成核苷酸<400>11ttcttttttt tctt14<210>12<211>17<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>12aaaaaaggga ataaggg17<210>13<211>58<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>13gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg58<210>14<211>58<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>14aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg58<210>15<211>51<212>DNA<213>人工
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>15gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a51<210>16<211>17<212>DNA<213>人工<220>
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<223>合成的寡核苷酸<400>17ccgaattctg gggaccaaag cagtttc27<210>18<211>27<212>DNA<213>人工<220>
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<223>5-甲基胞嘧啶<400>19gaggcttctt cttcttcttc ttctt25<210>20<211>48<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>20ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga48<210>21<211>50<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>21gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga50<210>22<211>58<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>22gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg58<210>23<211>58<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>23aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg58<210>24<211>58<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>24gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg58<210>25<211>58<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>25
aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg58<210>26<211>50<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>26ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga50<210>27<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>27aatgcctcct cctcctcctc ctcct25<210>28<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>28agtgctctct ctctctctct ctctct26<210>29<211>66<212>DNA<213>人工<220>
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<223>合成的寡核苷酸<400>30
gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttcttcttcttct 60tcttca66<210>31<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>31acagtcataa gtgcggcgac g21<210>32<211>39<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>32gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa39<210>33<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>33gaagaagaag aagaagaaga a21<210>34<211>12<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>34agaaaaaaaa ga1权利要求
1.一种用于裂解细胞的装置(mechanism)，包括a)湍流设备，用以快速地混合细胞悬液与可裂解细胞的溶液；和b)层流设备，用以允许在基本上没有搅动的情况下保温(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物从湍流设备流动到层流设备中。
2.权利要求1的装置，另外包括用于添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的设备，其中在(b)中保温的混合物从所述层流设备流动到所述用于添加第二溶液的设备中。
3.利用根据权利要求2的装置从细胞分离质粒DNA的方法，包括a)在所述湍流设备中混合细胞与碱性裂解性溶液；和b)通过添加酸性溶液中和所述碱性裂解性溶液。3.连续碱性细胞裂解装置(device)，包括-第一混合器或注射器，能够按与所述细胞悬液相反的方向注射碱性流体；-小直径的第一管道，用以在混合物内产生湍流；-大直径的第二管道，用以在混合物内产生层流；-第二混合器或注射器，用于在一端注射中和溶液并在另一端收获混合物。
4.权利要求3的装置，其中选择所述管道和注射器的直径以控制湍流和层流中的所述混合物的流速。
5.权利要求3或4的连续碱性细胞裂解装置，进一步包括泵，用于注射或泵送所述细胞悬液从而以相反方向接触所述第一混合器。
6.权利要求3到5的任何一项的装置，其中所述第一混合器或注射器是管路(in-line)混合器或注射器。
7.权利要求3到6的任何一项的装置，其中所述第一混合器是T形管。
8.权利要求3到7的任何一项的装置，其中所述细胞悬液和碱性溶液的混合物以湍流的形式短时间流过所述第一管道。
9.权利要求3到8的任何一项的装置，其中所述第一管道具有低于1cm、优选在2和8mm之间、更优选约6mm的直径，以及1到10m、优选2到6m的长度。
10.权利要求3到9的任何一项的装置，其中所述混合物在1到10秒、优选2到5秒、更优选2.5秒的期间经历湍流。
11.权利要求3到10的任何一项的装置，其中所述第二管道是螺管(coiled tubing)，能够产生层流以容许所述碱性溶液和细胞悬液的连续接触，并确保完全的细胞裂解。
12.权利要求3到11的任何一项的装置，其中连续接触的持续时间为30秒到2分钟，优选1分钟到1分30秒，优选1分20秒。
13.权利要求3到12的任何一项的装置，其中所述第二管道具有低于1cm、优选为10到20mm、或12.5到19mm、更优选等于16mm的直径，以及5到30m、优选13到23m的长度。
14.权利要求3到13的任何一项的装置，其中所述第三管道具有低于1cm、优选2到10mm、更优选5到8mm的直径，以及1到10m且更优选2到4m的长度。
15.权利要求3到14的任何一项的装置，其中所述第二混合器或注射器是Y形的，并与所述裂解的细胞成直线以注射溶液，从而导致基因组DNA、RNA和蛋白质的沉淀。
16.权利要求3到15的任何一项的装置，其可操作地连接到用于发酵的槽。
17.裂解细胞的方法，包括使所述细胞流经(a)湍流设备，以快速地混合细胞悬液与可裂解细胞的溶液；和(b)层流设备，以允许在基本上没有搅动的条件下保温(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物从湍流设备流动到层流设备中。
18.权利要求17的方法，进一步包括(c)添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的设备，其中在(b)中保温的混合物从所述层流设备流动到所述用于添加第二溶液的设备中。
19.从含有质粒的细胞释放质粒的方法，包括a)使细胞流经湍流设备以快速地混合细胞悬液与可裂解细胞的溶液；(b)然后使所述细胞流经层流设备以允许在基本上没有搅动的条件下保温(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的细胞混合物从所述湍流设备流动到所述层流设备中，和(c)经由用于添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的设备接触细胞，其中在(b)中保温的细胞混合物从所述层流设备流动到所述用于添加第二溶液的设备中，质粒从细胞中释放。
20.权利要求17到19的任何一项的方法，其中所述裂解溶液是含有裂解试剂的溶液，所述裂解试剂选自碱、洗涤剂、有机溶剂、和酶或它们的混合物构成的组。
21.权利要求17到20的任何一项的方法，进一步包括a)阴离子交换层析，b)三联体亲和层析，和c)疏水性相互作用层析。
22.权利要求21的方法，其中所述阴离子交换层析、三联体亲和层析和疏水性相互作用层析按所述顺序进行。
23.权利要求21的方法，其中在溶胞产物过滤之前进行第一次层析。
24.权利要求21的方法，其中在絮凝物去除之前进行第一次层析。
25.制备高纯的质粒DNA的方法，包括组合的阴离子交换层析和三螺旋层析的步骤。
26.权利要求25的分离方法，其进一步包括组合的疏水性相互作用层析步骤。
27.权利要求17到26的任何一项的分离方法，其能够扩大到大规模生产。
28.制备高纯的质粒DNA的大规模方法，其中使含有质粒的宿主细胞流经湍流设备以快速地混合细胞悬液与可裂解细胞的溶液；(b)然后所述细胞流经层流设备以允许在基本上没有搅动的条件下保温在(a)中形成的混合物，其中所述在(a)中形成的细胞混合物随后从所述湍流设备流动到所述层流设备中，和(c)经由用于添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的设备进行接触，其中在(b)中保温的所述细胞混合物从所述层流设备流动到所述用于添加第二溶液的设备中，从所述细胞释放的质粒通过依次进行的阴离子交换层析、三联体亲和层析和疏水性相互作用层析而得以分离。
29.制备和纯化药学级别质粒DNA的方法，包括步骤a)制备含有质粒DNA的细胞，b)通过用连续碱性裂解的方法破坏细胞来制备含有质粒DNA的溶胞产物，c)通过用合适的试剂进行沉淀的浓缩步骤，d)阴离子交换层析步骤，e)三螺旋层析步骤，f)疏水性相互作用层析，和g)最终的渗滤和/或缓冲液交换步骤。
30.权利要求17到29的任何一项的方法，进一步包括在先的通过使所述溶液通过筛网过滤器以及通过深度过滤的絮凝物去除步骤。
31.权利要求17到30的任何一项的方法，进一步包括在最后的层析步骤之后的渗滤步骤。
32.权利要求31的分离方法，其中所述渗滤步骤用于达到合适的盐、缓冲液和目标pH值。
33.权利要求31或32的分离方法，其中所述渗滤步骤包括以下步骤从最后的层析步骤收获溶液；相对于Tris/NaCl缓冲液进行第一渗滤步骤；在适合于控制最终缓冲液浓度和适合于稳定最终质粒DNA制剂的pH值的条件下进行相对于盐水的第二渗滤步骤。
34.通过如权利要求17到33的任何一项所定义的方法获得的药物级别质粒DNA。
35.药物级别质粒DNA组合物，其包括亚-ppm(＜0.00001％)的gDNA、RNA和蛋白质污染物。
36.药物级别质粒DNA组合物，其基本上没有gDNA、RNA和蛋白质污染物。
37.药物级别质粒DNA组合物，其基本上没有细菌宿主染色体DNA。
38.药物级别质粒DNA组合物，其包含低于约0.01％、或低于约0.001％、低于约0.0001％、或优选的低于0.00008％的染色体DNA或基因组DNA。
39.药物级别质粒DNA组合物，其基本上没有RNA。
40.药物级别质粒DNA组合物，其包含低于约0.01％、或低于0.001％、优选低于0.0001％、或优选低于0.00002％的RNA污染物。
41.药物级别质粒DNA组合物，其基本上没有蛋白质污染物。
42.药物级别质粒DNA组合物，其含有低于约0.0001％，最优选低于0.00005％的蛋白质污染物。
43.基本上没有内毒素污染物的药物级别质粒DNA组合物。
44.包含低于0.1EU/mg内毒素的药物级别质粒DNA组合物。
45.包含优势型(predominant)超螺旋形式的药物级别质粒DNA组合物。
46.包含大约或超过99％的封闭环形质粒DNA的药物级别质粒DNA组合物。
47.稳定的质粒DNA制剂，包括质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在以维持所述制剂或组合物的pH值在7和7.5之间。
48.根据权利要求47的稳定的质粒DNA制剂，其中所述缓冲溶液包含(a)Tris或赖氨酸和选自强酸或弱酸的酸；(b)Hepes和强碱；或(c)磷酸盐缓冲液。
49.根据权利要求48的稳定的质粒DNA制剂，其中所述缓冲溶液包含Tris/HCl、赖氨酸/HCl、Tris/)顺丁烯二酸、Tris/苹果酸、Tris/乙酸、或Hepes/氢氧化钠。
50.稳定的质粒DNA制剂，其中所述缓冲液是Tris。
51.权利要求50的稳定的质粒DNA制剂，其中所述Tris缓冲液以低于1mM的浓度、优选250μM和1mM的浓度存在。
52.权利要求51的稳定的质粒DNA制剂，包含400μM Tris缓冲液。
53.稳定的质粒DNA制剂，包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂，其中所述缓冲溶液以低于1mM的浓度、优选250μM和1μM的浓度存在。
54.稳定的质粒DNA制剂，包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂，其中所述缓冲溶液以400μM的浓度存在。
55.包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂的组合物，其中所述缓冲溶液以足以在4℃到25℃使质粒DNA以稳定形式保存的浓度存在。
56.包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂的组合物，其中所述缓冲溶液以足以在4℃到25℃使质粒DNA以稳定形式保存延长的时期的浓度存在。
57.包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂的组合物，其中所述缓冲溶液以一定浓度存在，所述浓度足以在4℃到25℃使质粒DNA以稳定形式保存1个月、2个月、3个月、到6个月和达12月的期间。
58.根据权利要求57的质粒DNA组合物，其中所述盐水赋形剂是NaCl。
59.根据权利要求58的质粒DNA组合物，其中NaCl以100到200mM、优选约150mM的浓度存在。
60.根据权利要求59的质粒DNA组合物，其中保存在5℃或保存在室温的质粒DNA的脱嘌呤作用和开环作用的速率低于20％、15％、10％、5％或≤1％每月。
61.在组合物中保存质粒DNA的方法，包括制备纯化的质粒DNA的样品；和使所述纯化的质粒DNA的样品与盐水赋形剂和缓冲溶液组合，所述缓冲溶液维持产生的组合物的pH在7到7.5。
62.在达约20℃的温度在组合物中保存质粒DNA的方法，包括制备纯化的质粒DNA的样品；使所述纯化的质粒DNA的样品与盐水赋形剂和缓冲溶液组合，其中所述缓冲溶液以低于1mM的浓度、或250μM到1mM、优选400μM的浓度存在；和将所述质粒DNA组合物保存在达约20℃的温度。
63.根据权利要求62的方法，其中所述质粒DNA组合物保存在约4℃的温度。
64.根据权利要求62的方法，其中所述盐水赋形剂是NaCl。
65.根据权利要求64的方法，其中NaCl以100到200mM、和优选约150mM的浓度存在。
66.稳定的质粒DNA保存制剂，其通过在权利要求62到66的任何一项中定义的方法获得。
67.权利要求17到32的任何一项的方法，进一步包括无菌过滤除菌、配制和用纯化的质粒DNA填充小瓶的步骤。
68.含有纯化的质粒DNA的小瓶，其通过权利要求67的方法获得。
69.权利要求68的小瓶，其中所述纯化的质粒DNA是称为NV1FGF的质粒，其是携带编码FGFa基因的表达盒的pCOR质粒。
70.权利要求17到32的任何一项的方法，其中所述方法允许除去混杂物，例如蛋白质、变性的基因组DNA、RNA、蛋白质、寡核糖核苷酸、寡-脱氧核糖核苷酸、变性的质粒DNA和脂多糖。
71.根据权利要求17到32的任何一项的方法，其中层析步骤在固相支持物上进行，所述固相支持物是任何有机的、无机的或复合材料，其为多孔的、超多孔的或无孔的，适合于层析分离，所述材料是由聚(亚烷基二醇)(poly(alkene glycol)、烷烃(alkane)、烯烃(alkene)、炔烃(alkyne)、芳烃(arene)或赋予所述支持物疏水特性的其他分子衍生的。
72.根据权利要求17到32的任何一项的方法，其中所述疏水性相互作用层析在固定床中或在膨胀床中进行。
全文摘要
本发明提供了对细菌悬浮液的连续碱性裂解以收获pDNA的方法。进一步提供了可选择的额外的纯化步骤，包括溶胞产物过滤、阴离子交换层析、三联体亲和层析和疏水性相互作用层析。这些可选择的纯化步骤可以与连续裂解组合，以生产基本上没有gDNA、RNA、蛋白质、内毒素和其他污染物的高度纯化的pDNA产品。
文档编号A61K48/00GK1882682SQ200480033865
公开日2006年12月20日 申请日期2004年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者弗朗西斯·布兰奇, 米歇尔·库德, 尼古拉斯·梅斯特拉利, 戴维·盖拉克, 蒂里·吉尔明 申请人:森特利昂公司