专利名称：一种用于质粒分析的整体床的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种用于质粒分析的整体床的合成方法，属于生物分子分析和色谱分析技术 领域。
技术背景基因治疗和DNA疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病 的诊断和治疗方面的应用研究正日益引起越来越广泛的关注。目前质粒逐渐成为基因治疗的 最重要的基因传递系统，因此应用于基因治疗的药用质粒的大规模制备成为其基础。而药用 质粒的大规模制备过程的关键之一在于如何监测质粒纯度、监测质粒制备过程的性能，评价 最终产品质量以及产品的规格等，这对于过程开发、认证、产品批准非常重要。质粒分析方法主要包括紫外吸收光谱法、荧光光谱法、电泳法、色谱法等。近年来，色 谱法除了作为药用质粒大规模制备过程中重要的分离纯化技术之外，也逐渐成为制备过程中 不可缺少的高效分析方法。在质粒分析过程中存在反相色谱、疏水相互作用色谱、体积排阻 和离子交换色谱等多种模式。离子交换色谱既可以用于质粒和杂质的定量，也可用于质粒不 同拓扑形态的分析，在药用质粒分析中应用最为广泛。目前专门针对质粒分离分析开发的商业化离子交换色谱介质产品非常有限，而应用于质 粒分析过程的阴离子交换型色谱介质均为商业化产品，其中大多数是为蛋白质分离分析而开 发。目前药用质粒分离过程中过程流分析中所采用的离子交换色谱介质主要有多孔微球、灌 注色谱填料、非多孔色谱填料和薄壳色谱填料等，为提高传质性能而开发的各种新型色谱介 质是其中的主体。多孔微球包括琼脂糖基质的QSepharoseHP、聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基 质的PL—SAX和MonoQ;灌注色谱填料包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基质的Poros 20 PI和 Poros20QE;非多孔微球包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基质的MiniQ和聚甲基丙烯酸酯基质 的TSKDNA—NPR;薄壳型介质为DNAPac PA—100。应用于质粒分析的市售色谱柱骨架结构包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)、聚(甲基丙烯酸 縮水甘油酯一双甲基丙烯酸乙二醇酯)和琼脂糖。聚(苯乙烯一二乙烯基苯)为基质的微球 是目前应用于质粒分析的主要骨架材料，但是该类基质在质粒分析中存在易污染的问题，文 献"Kepka C, Rhodin J, Lemmens R， et al. Extraction of plasmid DNA from Escherichia coli cell lysate in a thermoseparating aqueous two-phase system. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 2004, 1024(1-2): 95-104."中指出即使是无孔的MiniQ也存在色谱柱污染后无法分析样品的问 题。文献"Prazeres D M, Schluep T, Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 1998,806(1): 31-45"指出与聚(苯乙烯一二乙烯基苯)骨架基质相比，琼脂糖亲水性提高，由疏水 相互作用引起的非特异性吸附会明显降低。因此，从骨架结构的角度来看，骨架为亲水性琼 脂糖或聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一双甲基丙烯酸乙二醇酯)的色谱介质更适合质粒的分析。应用于质粒分析的市售色谱柱按基质孔结构可以分为多孔和非多孔两类。目前采用的多 孔色谱分析材料均是针对蛋白质分离分析开发，因通常所需分离的蛋白的分子量为8千到20 万，而且通常为球形， 一般尺寸为几纳米到十几纳米。而因质粒的分子量高达数百到数千万， 而且通常为超螺旋结构，长度可达几百纳米，窄的部分可达十几纳米。文献"PrazeresDM, Schluep T, Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion陽exchange chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 1998， 806(1): 31-45"指出其与多孔材 料键合时主要发生在微球的外表面。因为仅是采用色谱材料的外表面，MiniQ和TSK虽然无孔， 但因粒径小，所以有效的外比表面积最高，而且它们属于非多孔材料，传质速度非常快，因 此，目前采用的多孔色谱分析材料非多孔材料MiniQ和TSKDNA—NPR从微观结构的角度看 具有比较突出的优势。考虑到色谱介质的骨架结构，MiniQ为聚(苯乙烯一二乙烯基苯)，而 TSKDNA—NPR为聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一双甲基丙烯酸乙二醇酯)，因此，TSKDNA 一NPR色谱柱无论从骨架结构还是孔结构均比较适合于质粒分析。但该介质由于是无孔微球， 色谱柱的制备和装填要求均非常高，而且色谱柱在使用过程中背压也非常高。因此开发针对 质粒分析的多孔介质或结构性介质，充分提高介质比表面积的利用率，是提高色谱介质对质 粒分析性能的关键。发明人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001, 912(1): 31-38"和"张敏莲，白姝，孙彦.聚(GMA-DVB-TAIC) 型连续床的制备及其对蛋白质的色谱分离性能.离子交换与吸附，2003， 16(3) : 199 206" 中曾针对蛋白质分离分析开发了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚异氰尿酸三 烯丙酯)型整体床，该类型的色谱介质具有良好的亲水性能。但由于该类色谱介质针对蛋白 分离分析开发，整体床中的孔径为l 2pm，虽然在蛋白分离中可以具有良好的传质性能，但 因质粒的长度可达几百纳米，窄的部分可达十几纳米，因此类型整体床在质粒分析中传质性 能差，易出现色谱柱堵塞，而无法应用于质粒的分析。 发明内容本发明针对目前质粒分析中存在的问题，本发明的目的是提供一种不易被污染、具有大 量质粒可以进入的孔道、传质速度快，背压低的用于质粒分析的整体床的合成方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于该方法按如下步骤进行1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中a. 所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05 0.2;b. 所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40 80%;c. 所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005 0.03;2) 将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床，聚合 温度控制在50 6(TC之间，反应时间为12 72小时；3) 聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4) 利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性，其中胺类修饰剂的体积含量为 25 75%，修饰温度控制在70 80。C之间，反应时间为12 24小时；5) 修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。 所述交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合物，两类交联剂的物质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和垸烃和芳烃中的至少一种；所述的引发剂采 用偶氮类物质；所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。所述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和双甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一种；所述含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。所述偶氮类物质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一 种。所述饱和烃采用正庚烷、正辛烷和正壬垸中的任一种；所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一种。所述醇类采用乙醇或甲醇；所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。所述胺类修 饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。本发明与现有技术中质粒色谱分析方法相比，具有以下优点及突出性效果采用本方法所合成的整体床在质粒分析中具有良好的耐污染能力，可以对于含有大量杂质的酶解的裂解 液进行多个批次的分析而分析柱性能无明显改变；整体床中具有的孔道直径可达十微米以上， 可以确保质粒的可接近性，传质速度快，背压低。该类整体床的质粒分析过程方便快捷，成 本低。
具体实施方式
本发明提供的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，该方法按如下步骤进行1) 将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致 孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中a. 所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05 0.2;b. 所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40 80%;c. 所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005 0.03;2) 将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床，聚合 温度控制在50 6(TC之间，反应时间为12 72小时；3) 聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4) 利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性，其中胺类修饰剂的体积含量为 25 75%，修饰温度控制在70 8(TC之间，反应时间为12 24小时；5) 修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。 所述交联剂釆用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合物，两类交联剂的物质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种；所述的引发剂采 用偶氮类物质；所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。所述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和双甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一种；所述含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。所述偶氮类物质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一 种。所述饱和烃采用正庚烷、正辛烷和正壬烷中的任一种；所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一种。所述醇类采用乙醇或甲醇；所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。所述胺类修 饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。利用合成的整体床进行质粒分析的过程如下采用水和缓冲液A (10mMTris-HCl， lmMEDTA， pH8.0)冲洗整体床。在质粒制备过程分析中，杂质含量最高的是裂解液，纯度 最高的是最终的质粒纯品，可以利用整体床对质粒纯品和裂解液进行分析，如果色谱柱可以 对两者有较好的分析性能，则其可以应用于质粒制备过程分析。分析质粒标样和酶解裂解液 时，所采用的溶液为缓冲液A，缓冲液B(缓冲液A+2MNaCl)。盐梯度为0-5min30-50%缓 冲液B;5-5.01min 50-30%缓冲液B; 5.01-15min 30%缓冲液B。裂解液采用RNase—DNase Free酶液处理，处理温度为35。C 40。C，恒温0.5~2h。将上述溶液加入到整体床中，在0.2 0.8 mol/L盐浓度下将RNA和蛋白等杂质从整体床中洗脱下来，然后在0.9 1.5 mol/L盐浓度 下将质粒组分洗脱下来，从而实现质粒的纯度和含量分析。下面通过几个具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例l:称取单体甲基丙烯酸縮水甘油酯、交联剂二乙烯基苯和三聚异腈尿酸三烯丙酯(1: 0.04:0.01 mol/mol/mol);致孔剂甲苯和正庚烷(致孔剂/反应混合物80 vol%，甲苯/正庚烷3: 2vol/vol);引发剂偶氮二异丁腈(引发齐U/单体0.005:1 mol/mo1)，混合均匀，装入一端密封 的50x4.6mm不锈钢管中，将另一端密封，于5(TC反应72小时。将整体床连接到泵上，乙醇 冲洗。然后利用二乙胺为修饰剂，溶剂采用乙醇，二乙胺的体积含量为25%，修饰反应控制 在8(TC，反应时间为12小时。反应结束后，采用乙醇冲洗整体床。本发明所合成的整体床 中75%以上的孔其孔径在十微米以上，整体床的修饰密度约为2.0mmol/g整体床。实施例2:称取单体甲基丙烯酸环氧乙酯、交联剂双甲基丙烯酸乙二醇酯和三乙烯基苯(1: 0.03:0.06 mol/mol/mol);致孔剂乙苯和正辛烷(致孔齐U/反应混合物75 vol%，乙苯/正辛烷1: 1 vol/vol); 引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0.01:1 mol/mo1)，混合均匀，装入一端密封的50><4.6mm 不锈钢管中，将另一端密封，于55'C反应36小时。将整体床连接到泵上，四氢呋喃冲洗。 然后利用二甲胺为修饰剂，溶剂采用四氢呋喃，二甲胺的体积含量为75%，修饰反应控制在 7(TC，反应时间为24小时。反应结束后，采用四氢呋喃冲洗整体床。本发明所合成的整体床 中75%以上的孔其孔径在十微米以上，整体床的修饰密度约为2.3mmol/g整体床。实施例3:称取单体丙烯酸縮水甘油酯、交联剂二乙烯基苯和三聚异腈尿酸三烯丙酯(1: 0.06:0.03 mol/mol/mol);致孔剂二甲苯(致孔剂/反应混合物60 vol%);引发剂偶氮二异庚腈(引发剂/ 单体0.02:1 mol/mo1)，混合均匀，装入一端密封的50x4.6mm不锈钢管中，将另一端密封， 于6(TC反应12小时。将整体床连接到泵上，甲醇冲洗。然后利用乙胺为修饰剂，溶剂采用 甲醇，乙胺的体积含量为30%，修饰反应控制在75C反应时间为18小时。反应结束后， 采用甲醇冲洗整体床。本发明所合成的整体床中75%以上的孔其孔径在十微米以上，整体床 的修饰密度约为2.1mmol/g整体床。实施例4:称取单体丙烯酸环氧乙酯、交联剂二乙烯基苯基甲烷和三甲基丙烯酸丙三醇酯(1: 0.04:0.16 mol/mol/mol);致孔剂正壬烷(致孔剂/反应混合物40 vol%);引发剂偶氮二异庚腈 (引发剂/单体0.03:1 mol/mo1)，混合均匀，装入一端密封的50x4.6mm不锈钢管中，将另一 端密封，于6(TC反应12小时。将整体床连接到泵上，二噁烷冲洗。然后利用乙二胺为修饰 剂，溶剂采用二噁烷，乙二胺的体积含量为50%，修饰反应控制在75t:，反应时间为12小 时。反应结束后，采用二噁烷冲洗整体床。本发明所合成的整体床中75%以上的孔其孔径在 十微米以上，整体床的修饰密度约为2.6mmol/g整体床。
权利要求
1.一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于该方法按如下步骤进行1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中a.所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05～0.2；b.所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40～80％；c.所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005～0.03；2)将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床，聚合温度控制在50～60℃之间，反应时间为12～72小时；3)聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4)利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性，其中胺类修饰剂的体积含量为25～75％，修饰温度控制在70～80℃之间，反应时间为12～24小时；5)修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。
2. 按照权利要求1所述的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于所述 交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合物，两类交联剂的物质的量的比为0,25 4;所述的致孔剂采用饱和垸烃和芳烃中的至少一种；所述的引发剂采用偶氮类物质；所述的有机溶剂为醇类或环醚类。
3. 按照权利要求2所述的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于所述 含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷或双甲基丙烯酸乙二醇酯；所述 含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯或三甲基丙烯酸丙三醇酯。
4. 按照权利要求2所述的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于所述 偶氮类物质采用偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。
5. 按照权利要求2所述的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于所述饱和烃采用正庚垸、正辛烷或正壬垸；所述芳烃采用甲苯、乙苯或二甲苯。
6. 按照权利要求2所述的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于所述 醇类采用乙醇或甲醇；所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。
7. 按照权利要求2所述的一种用于质粒分析的整体床的合成方法，其特征在于所述 胺类修饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。
全文摘要
一种用于质粒分析的整体床的合成方法，属于生物分子分析和色谱分析技术领域。该方法将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物；然后将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床；聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性；修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。采用本方法所合成的整体床在质粒分析中具有良好的耐污染能力、传质速度快、背压低、分析过程方便快捷、成本低。
文档编号G01N30/00GK101625347SQ20091009037
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者刘孟儒, 宪 孔, 张敏莲 申请人:清华大学