体外复制的人线粒体dna质粒及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种体外复制的人线粒体DNA重组质粒，该重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基因；大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。其构建方法包括以下步骤：提取完整的人线粒体DNA；从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得人线粒体DNA重组质粒。本发明一方面可实现人线粒体在原核生物中的复制，另一方面由于插入的为非编码区，不会对人线粒体DNA的编码功能造成影响。
【专利说明】体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，并涉及真核生物的DNA在原核生物中的表达。更具体地，本发明涉及一种体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建方法，该质粒可实现人线粒体DNA (mt-DNA)的完整复制。
【背景技术】
[0002]线粒体是一个对环境变化十分敏感的细胞器。在许多疾病状态下，线粒体的结构和功能都会发生相应的改变，并成为疾病病理变化的一部分。另一方面，线粒体的异常也可能成为疾病发生的原因，这种以线粒体结构或功能异常为主要病因的一大类疾病称为线粒体病。
[0003]线粒体病中线粒体DNA (mt-DNA)的缺失、变异以及重复是致病的重要原因。线粒体基因组是一个环状双DNA，核酸序列和组成比较保守。人类的线粒体基因组由16569bp组成，其外环为重(H)链，内环为轻(L)链；除一段非编码区(D-1oop区)外均为编码区，共编码13个多肽、22个tRNA和2个rRNA。D-1oop区是一大小约为100bp的调控区，其包含有重链复制起始点、保守序列节段、轻链启动子、重链启动子及终止结合序列等，几乎所有与mt-DNA复制、转录和翻译相关的调控序列都位于该区。D-1oop区为非编码区，插入该区的外源基因不会对mt-DNA复制、转录和翻译相关的调控序列以及编码功能造成影响，也即不会影响到mt-DNA基因的功能。
[0004]通常情况下，基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。这就需要两方面的技术要求，一种是针对疾病制备某种外源基因(外源DNA)，其二则需要将这种外源DNA导入靶细胞中，替换异常DNA。随着基因治疗手段的发展，采用该方法治疗由于DNA缺失、变异或重复等导致的线粒体病也成为本领域的研究热点。但由于人线粒体DNA是典型的真核基因，现有技术中其功能性研究仍停留在真核水平，研究复杂程度较高，不利于实现简化的试验操作方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中人线粒体的功能性研究仍停留在真核水平而导致的研究复杂程度高的缺陷，提供人线粒体DNA重组质粒及其构建方法，通过该方法实现人线粒体DNA在原核生物内的体外复制，降低研究复杂度。
[0006]本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现:提供一种人线粒体DNA重组质粒，所述重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基因；所述大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。
[0007]在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述重组质粒还包含插入到人线粒体DNA的D-LOOP区、并连接在大肠杆菌复制子基因的C端的抗性筛选基因。
[0008]在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为Sal I位点、Bgl II位点和Not I位点的至少两个。[0009]在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含Ale I位点。
[0010]在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述抗性筛选基因为氨苄基因。
[0011]根据本发明的另一方面，提供一种人线粒体DNA重组质粒的构建方法，该方法包括以下步骤:
[0012]A、提取完整的人线粒体DNA ;
[0013]B、从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及
[0014]C、同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得所述人线粒体DNA重组质粒。
[0015]在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，所述步骤B包括: [0016]设计一对引物:
[0017]引物3:5’ -CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’ ；
[0018]引物4?，-Ckk ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC ATG AGT ATT CAACAT TTC CGT-3，；
[0019]基于PCR方法，使用引物I和引物2从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因。
[0020]在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，扩增出的所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含Ale I位点；扩增出的所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为Sal I位点、Bgl II位点和Not I位点的至少两个。
[0021]在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，所述步骤B包括:
[0022]设计一对引物:
[0023]引物3:5，-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’ ；
[0024]引物5?，-Ckk ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC AGA TCA AAG GATCTT CTT GAG-3’ ；
[0025]基于PCR方法，使用引物3和引物5从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因。
[0026]在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，在所述步骤C中，使用限制性内切酶Ale I同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后用T4连接酶连接在一起。
[0027]实施本发明可以获得以下有益效果:本发明在人线粒体DNA的非编码区D-LOOP区插入大肠杆菌复制子基因，一方面可实现人线粒体在原核生物(例如大肠杆菌)中的复制，通过体外复制的方法获得外源线粒体DNA，作为获取人线粒体DNA的源头；另一方面由于插入的为非编码区，因此不会对人线粒体DNA的编码功能造成影响。本发明的构建方法操作简单、便于实施，由于构建得到的重组质粒适用于原核表达体系，可进一步降低线粒体的研究复杂度。
[0028]优选地，本发明同时在人线粒体DNA中插入大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因。抗性筛选基因不仅可以起到初步筛选的作用，而且本发明在抗性筛选基因中引入了多克隆位点，便于后续通过酶切方式将线粒体中的基因片段克隆到该质粒中。【专利附图】
【附图说明】
[0029]以下将结合附图和具体实施例对发明做进一步详细说明。附图中:
[0030]图1是提取到的完整的人线粒体DNA的电泳图，其中标号I表示λ -Hind III DNAmarker,标号2表示完整的人线粒体DNA ；
[0031]图2是利用引物扩增后的人线粒体DNA片段的PCR鉴定示意图，其中标号I表示人线粒体DNA片段的PCR，标号3表示DL2000DNA marker ；
[0032]图3是从pUC19质粒中扩增得到的大肠杆菌复制子基因(oir)和氨苄基因(amp)的PCR鉴定示意图，其中I表示DL2000DNA marker，标号2和3分别表示大肠杆菌复制子基因(oir)和氨苄基因(amp)的PCR产物；
[0033]图4是本发明构建的人线粒体DNA重组质粒的PCR鉴定示意图，其中标号1、2和3分别表示人线粒体DNA重组质粒的PCR产物，标号4表示DL2000DNA marker ；以及
[0034]图5是本发明构建的人线粒体DNA重组质粒经酶切处理后的PCR鉴定示意图，其中标号I表不λ -Hind III DNA marker,标号2表不DL2000DNAmarker,标号3表不线粒体DNA重组质粒的酶切产物。
[0035]图6是从pUC19质粒中扩增得到的大肠杆菌复制子基因(Oir)PCR鉴定示意图，其中I表示DL2000DNA marker，标号2分别表示大肠杆菌复制子基因(oir) PCR产物；
[0036]图7是本发明构建的人线粒体DNA重组质粒经酶切处理后的PCR鉴定示意图，其中标号I表示DL2000DNA marker，标号2表示线粒体DNA重组质粒的酶切产物，标号3表不 λ -EcoR I +Hind III DNA marker ?
【具体实施方式】
[0037]为使本发明的目的、技术方案和效果更清楚明白，以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。应该理解的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不对本发明做任何限制。
[0038]本发明提供了一种在体外获得人线粒体DNA重组质粒的构建方法。获得的重组质粒能在大肠杆菌中复制，并可复制得到完整的人线粒体DNA，不仅可实现人线粒体DNA的体外量化制备，而且将其研究水平扩展到原核水平，降低了其研究复杂程度。具体构建过程包括提取完整的人线粒体DNA、通过引物设计获取后续插入线粒体DNA中的外源基因、以及构建包含以上基因的重组质粒。
[0039]一、提取完整的人线粒体DNA
[0040]完整的人线粒体DNA均可在美国国立生物信息中心(NCBI )、欧洲生物信息中;(ΕΒΙ)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(MGT)等数据库查询中得到。本发明中则按照线粒体DNA的提取方法，从人新鲜血液提取所需的人线粒体DNA，具体过程如下:
[0041 ] 取人新鲜血液，加入4倍体积的细胞裂解液，振荡混匀10分钟，4°C条件下3000rmp离心10分钟，取上清，4°C条件下15000rmp离心10分钟，去上清，所得沉淀使用线粒体DNA提取试剂盒提取线粒体DNA。提取得到的线粒体DNA经DNA电泳显示大小约为16Kb (图1所示)。对提取得到的线粒体DNA进行进一步鉴定，设计以下引物:
[0042]引物1:5，-TTA TGT AGC TTA CCT CCT CAA-3，；
[0043]引物2:5’ -TGT CAG TTC AGT CTT TTA ATC-3，；[0044]取提取得到的线粒体DNA为模板，以引物I和引物2为上下游引物进行PCR扩增，
反应体系如下:
【权利要求】
1.一种人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基因；所述大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。
2.根据权利要求1所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包含插入到人线粒体DNA的D-LOOP区、并连接在大肠杆菌复制子基因的C端的抗性筛选基因。
3.根据权利要求2所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为Sal I位点、Bgl II位点和Not I位点的至少两个。
4.根据权利要求2所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含Ale I位点。
5.根据权利要求2或3所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述抗性筛选基因为氨苄基因。
6.一种人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: A、提取完整的人线粒体DNA； B、从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及 C、同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得所述人线粒体DNA重组质粒。
7.根据权利要求6所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤B包括: 设计一对引物:
引物 3:5，-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3，；
引物4 ?，-Ckk ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC CAA AAG GCC AGC AAAAGG CCA-3’ ； 基于PCR方法，使用引物3和引物4从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因。
8.根据权利要求7所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，扩增出的所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含Ale I位点；扩增出的所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为Sal I位点、Bgl II位点和Not I位点的至少两个。
9.根据权利要求6所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤B包括: 设计一对引物:
引物 3:5，-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’ ；
引物5:5，-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC AGA TCA AAG GAT CTTCTT GAG-3’ ； 基于PCR方法，使用引物3和引物5从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因。
10.根据权利要求6所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，在所述步骤C中，使用限制性内切酶Ale I同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后用T4连接酶连接在一起。
【文档编号】C12N15/66GK104031929SQ201310128777
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年4月15日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】易俊波 申请人:深圳大学