专利名称：：一种能用于构建cDNA文库筛选的质粒载体的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法。
背景技术：
：目前对于新基因的发现和功能研究往往要经过几次的亚克隆，而对于一个cDNA文库来说，要研究其功能要将整个文库上百万个基因通过亚克隆转移到另一载体上研究功能，就会顾虑低拷贝基因被丢失等问题。而酵母双杂交是常用的筛选基因功能的方法之一，但是很难获得一个cDNA的定向克隆，因此，本发明在酵母双杂交质粒pGADT7的基础上进行改造，获得一个既可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建、测序又能用于酵母双杂交的筛选文库的质粒pGADT7M。
发明内容本发明的目的在提供一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，以解决
背景技术：
中的不足。—种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，主要包括以下步骤1、将空载体pDNR-LIB的一个单克隆质粒，用Ndel和Xhol双酶切后，回收短片段；2、将质粒pGADT7也用Ndel和Xhol双酶切后回收大片段；3、这两个片段通过T4DNA连接酶连接、转化和测序鉴定。这个质粒载体就改造成了酵母双杂交文库的载体，命名为pGADT7M，这个载体上就含有两个Sfil酶切位点，该载体是以pGADT7为基础改造的，具备pGADT7所具备的用于细菌中复制、酵母中复制和表达，和酵母双杂交等所具备的元件pUCori，Ampr，2iiori，LEU2，GAL4AD，PADH1，TADH1，SV40NLS，HATag等。有益效果本发明获得一个既可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建、测序又能用于酵母双杂交的筛选文库的质粒pGADT7M。图lpGADT7多克隆位点；图2pDNR-LIB多克隆位点；图3pGADT7M多克隆位点；图4部分重组子的菌落PCR结果图。具体实施例方式以下结合实施例对本发明所涉及一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法作进一步说明。实施例1:—种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法—、cDNA文库构建l总RNA的提取与检测在整个操作过程中戴手套；用新鲜的去离子水(Milli-Q-Grade)溶解RNA，不要用DEPC水，也不要使用灭菌过的水，灭菌时蒸气污染的水会干扰后续的PCR反应。(1)取50-100mg组织样品，用0.75mlTRIZOL豕丄S试剂匀桨，15-30。C静置5min。(2)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s后，15-3(TC静置2-15min。(3)4。C、12，000g离心15min，取上层水相。(4)加入O.5ml异丙醇，15-30。C静置10min后，4°C、12，OOOg离心10min，弃上清。(5)再加lml75%乙醇漂洗沉淀，5，OOOg离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。(6)取1iU进行1%甲醛变性胶电泳，1y1用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280nm波长上的光密度及初步估算RNA的纯度，-S(TC保存备用。对提取的RNA进行甲醛变性胶电泳。加样前，甲醛变性胶先预电泳5min，电压降为5v/cm;随后将样品加至凝胶孔，可用已知大小的RNA作分子量标准参照物，按3-4v/cm的电压进行电泳；紫外灯下观察电泳结果。2磁珠法分离mRNA(1)在RNase-free的Eppendorf管中加入0.11.Omg的总RNA和RNase-free水至终体积为500(2)65。C加热10min。(3)加入3ii1生物素标记的Oligo(dT)禾P13iil20XSSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷却至室温，一般需10min左右。(4)同时配0.5XSSC1.2ml和0.1XSSC1.4ml.(5)将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec)，小心去上清，切不可离心。用0.3ml0.5Xssc漂洗SA-PMPs，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。(6)将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.lml0.5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs应在30min内使用。(7)将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10min。(8)用磁性分离架捕获SA-PMPs，小心去上清，但不要弃去。用O.1XSSC，每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不搅动SA-PMPs.将SA-PMPs重新悬浮在0.lmlRNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。(9)用磁性分离架捕获SA-PMPs，将洗脱的mRNA吸入另一个新的E卯endorf管中。(10)将SA-PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脱，与(11)步洗脱液合并。(11)将得到的mRNA溶液取几微升进行凝胶电泳分析，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓縮(浓縮步骤见14-18)。(12)加0.1体积的3MNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-2(TC沉淀过夜。(13)4。C，13，000g离心60min。去上清，加入500ii170%乙醇混匀。(14)4°C，7，500g离心10min。(15)去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。(16)重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。注意事项所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行；如果totalRNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。3cDNA的合成按CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit说明书操作。其原理是利用真核生物mRNA5'端的甲基化G(m76)且5'三磷酸键连接的特殊的帽子结构和3'端的PolyA尾的特点设计锚定引物，分别进行第一链合成，引物延伸合成第二链，酶切消化和柱回收cDNA，从而实现富集全长cDNA的目的。l)cDNA第一链的合成在5ill反应体系中加入下列组分(于冰上操作)1yg芋螺毒腺mRNA，SMARTIVolig皿cleotide和CDSIII/3'PCR引物各1y1，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72。C温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。依次加入2iU5XFirstStrandBuffer、1ii120,1/L的DTT、1ii110,1/L的d證Mix禾口1ii1PowerScriptRT(CLONTECH)后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42。C反应lhr逆转录合成第一链，冰浴终止反应。加入1y1NaOH，68t:放置30min，冰上冷却，短暂离心，-2(TC保存。2)引物延伸法扩增cDNA第二链在lOOiil的反应体系中加入下列组分lliU第一链产物，10XAdvantage2PCRBufferlOii1，50XdNTPsMix2ii1，20iimol/L上下游锚定引物各2ii1，50XAdvantage2PolymeraseMix2和超纯水80补齐体积，然后将全部反应物混匀，放入预热至95。C的PCR仪，运行如下反应程序95。C变性lmin后，继续循环程序95。C15sec、68。C8min共3个循环，冷却至4t:后取5iUPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余PCR产物于-2(TC保存。3)蛋白酶K消化在50iU上一步的PCR产物(2-3iigdscDNA)中力口入2iU蛋白酶K(20iig/iU)灭活DNApolymerase，45。C温育20min，再经酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇(24:1)混合液各抽提一次，取上清，加入10iU的3M乙酸钠，1.3iU的糖原(20yg/yl)，260iil的室温放置的95%乙醇，室温14，OOOg离心20min，用80%乙醇洗涤沉淀，空气干燥，加入79iU去离子水充分溶解沉淀。4)Sfil酶切消化在100iil的酶切体系中加入下列组分79ill的dscDNA，10iU10XSfiIBuffer，liU100XBSA和10ii1SfiI内切酶。充分混匀，短暂离心。5(TC温育2hr后，加入2iU1%的二甲苯腈蓝(xylenecyanol)混匀。5)cDNA的分级分离柱回收将上一步酶切消化好的dscDNA上样到预处理好的CHR0MASPIN-400柱，分管收集5大小不一的dscDNA，每管1滴，当收集完16滴后，盖上柱子上盖；从每支收集管中取出5y1样品进行电泳检测，1%琼脂糖凝胶电泳确定符合要求的收集管号，集中后加入0.1倍体积的3MNaAc(pH4.8)、1.3yl的20mg/ml糖原及2.5倍体积的95%乙醇，-2(TC放置沉淀过夜；室温14，OOOg离心20min;吸去上清，沉淀用80%乙醇洗涤，室温14，OOOg离心5min，吸去上清，沉淀在空气中干燥10min左右；用7iU去离子水溶解干燥后的dscDNA，-2(TC保存备用，也可直接与载体连接。4dscDNA与载体的连接建立如下三个连接反应体系，同时设定对照反应体系，16t:连接16hr，以确定最佳连接比例。力B95iil灭菌的DEPC水到每个管中，加1.5iil甘糖原。吸打混匀。加入280y1冰冷的95%乙醇，混匀。-7(TC放置l-2hr。15，OOOg室温离心20min。小心移走上清，干燥沉淀。分别用5iUDEPC水溶解干燥的核酸沉淀。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5cDNA文库的转化1)电转化感受态细胞的制备(1)挑取单克隆菌落，投入盛有10mlLB液体培养基的三角瓶中(同时做培养基的空白对照)。37。C，220rpm，培养14-16个小时。(2)第二天，以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000mlLB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次0D，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。(3)将菌液在冰上预冷30min，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4。C，2500g离心10min。(4)弃上清，离心杯中加入少量去离子水，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4°C，4，OOOg离心10min。(5)弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000g，4°C，离心10min。(6)弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油，4。C，4，OOOg，离心10min。(7)弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ii1/管分装于1.5ml的离心管中，-80°〇冰箱中保存。(8)同时取100iil感受态加0.OlngpUC18直接电穿孔转化，检测转化效率。(9)次日观察转化子生长情况，并记录。2)电转化连接产物电转化DH5a感受态细胞每100y1菌液加入5y1连接产物或对照质粒溶液，混匀，转入电转化杯，冰浴不超过5min，用巻纸擦干外壁，马上置于BioRad电穿孔仪进行电击，电转化参数电压2.0kV;电流25iiF;电阻200Q;电击时间4.5ms。电击后立刻与800iU37t:预热的S0C培养基混合，用枪混匀，尽量吸出杯内菌液，装于干净无菌的离心管中。37°C、225rpm复苏细胞lhr，稀释103，104，105分别涂布于Cm+的LB平板上，37°C培养箱中倒置培养12-16hr，观察菌落生长情况，统计文库滴度。转化产物4t:存放备用。3)电击杯清洗流程用清水将电击杯稍冲一下。向电击杯中加入的75X酒精浸泡2hr。弃去酒精，再用蒸馏水冲洗23遍，然后用lml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯IO遍以上。加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。将清洗好的电击杯放入-20°〇冰箱内待用。注1.不同样品使用的电击杯应分开；2.每周用75%酒精浸泡30min。6质粒文库的扩增和保存将4。C存放转化率最高的一个电转产物涂布于105个15cm含Cm+的LB平板上，37t:培养箱中倒置培养12-16hr。留5个平板4t:存放测序，50个平板上的菌收集保存于-7(TC，另50个平板上的菌落用于碱裂解法提取质粒。7cDNA克隆PCR分析随机挑取单菌落，分别溶于灭菌的去离子水中。建立一个25iU的PCR反应体系含菌落水1ii1，10XPCRBuffer2.5iil，dNTPMix，5'，3'引物和Taq酶各0.5ii1，用去离子水补足25iU。扩增循环95。C变性4min后，94。C30sec，68。C2min25个循环，68。C5min。取5iU电泳。电泳片段>500的克隆于LB/Cm+中扩增培养，进行序列测定并保存一份于-70。C。随机挑取24个单克隆，利用载体多克隆位点两端的M13正向和反向引物进行PCR扩增鉴定，两引物之间约为280bp。PCR产物电泳表明，大小多在500bp以上，为重组子，文库重组率超过99%。考虑到毒素分子的长度较小(3-7kDa)，因此文库中所包含的cDNA插入序列也会相对较短。以上结果和分析可以显示该cDNA文库在文库重组子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。二、酵母双杂交1提取文库质粒首先扩增构建cDNA文库原始文库取30iiL加入到3mL的S0C液体中混匀，均匀的涂布在12cm的含CM+的LB平板上，每板150yL，37。C过夜，用3mL的S0C刮取每个平板上的菌落，收集所有的克隆后，部分用20%的甘油LB液体培养基-7(TC保种，取200mL用QIAGEN公司的大提质粒试剂盒提取质粒。2Bait质粒自主转录活性的测定酵母AH109菌株的Trpl、Leu2、Ura3以及His3基因被敲除，因此，该菌株不能在缺乏TRP、LEU、URA或HIS任意一种营养成分的合成培养基上生长。此外，该菌株中还含有3个报告基因，分别为受GAL1启动子控制的HIS3基因，受GAL2启动子控制的ADE2基因和受MEL1启动子控制的LacZ基因。经过测序鉴定，提取构建正确的Bait质粒，分别用醋酸锂方法转化到感受态酵母AH109细胞中。简化的醋酸锂转化酵母细胞的方法如下挑取直径为4-6mm的单克隆酵母至1.5mL的小离心管中，加50-100yL的1XTE，高速离心10-15s收集酵母细胞；然后加入1ygBait质粒、10mgcarrierDNA和PEG8000液体(800iiL50g/100mLPEG8000、200iiL1MpH7.5LiAc和100iiLDTT)，混匀后，45。C水浴45min，直接涂板在含X--gal的SD/-Trp平板上，3(TC培养4_6天，检测是否有自激活现象。由于pGBKT7质粒中含有Trpl基因，因此，经转化后含有Bait质粒的AH109细胞可以在SD/_Trp培养基上生长。3对毒腺酵母双杂交cDNA文库进行筛选本发明选择顺序转化的方法(即在已携带Bait的AH109酵母细胞中转入毒腺的酵母双杂交cDNA文库)来进行筛选，过程如下(1)将带有Bait的AH109酵母在SD/_Trp平板上划板，3-4天后，酵母长成直径为2-3mm菌斑。挑取2_3个菌斑放入lmLSD/_Trp培养液中，漩涡分散酵母细胞，然后转入50mLSD/-Trp培养液中；(2)250rpm、30。C摇菌16-18小时至稳定期(菌浓度0D600>1.5);(3)酵母转瓶至300mLSD/_trp培养液中，使0D6。。=0.2-0.3;(4)230-270rpm，30。C摇菌3小时左右，至0D600=0.4-0.6;(5)把酵母细胞倒入50mL离心管中，室温下lOOOg，离心5min;(6)弃上清，用40mL灭菌水悬浮细胞，并将细胞打散，室温下lOOOg，离心5min;(7)小心弃上清，用1.5mL新鲜配制的灭菌的1XTE/LiAc(TE:LiAc:ddH20=1:1:8)悬浮细胞，即含Bait质粒的酵母感受态细胞；(8)取出lmL酵母感受态细胞，加入50iig文库DNA，2mgHerringtestscarrierDNA，6mL灭菌PEG/LiAc混合液(PEG:LiAc:TE=1:1:8)混匀，30°C、200rpm、培养30min;(9)取出加入700iiLDMSO、混匀；42。C水浴15min，每隔3min上下颠倒EP管以防酵母沉淀，冰浴l-2min;(10)1000g室温下离心，弃上清、用lmL1XTE重悬细胞，取1iiL细胞用99iiL1乂1￡稀释后，涂在50/-1卬/-1^11板上，用来测定转化率；剩下的用0.99mL细胞用1XTE稀释后均在涂数个SD/-Trp/-Leu/-His板上。同时转化阳性对照pGADT7-T(0.1yg)+pGBKT7-53(0.1iig)+carrierDNA+感受态AH109酵母细胞(0.lmL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL);阴性对照pGADT7-T(0.1iig)+pGBKT7_lam(0.1iig)+carrierDNA+感受态AH109酵母细胞(0.lmL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL)，分别转化后涂在SD/-Trp/-Leu板上培养。酵母细胞中的HIS基因敲除后经常出现泄漏(Leakage)，这也是在双杂交技术应用过程中产生假阳性的原因之一。在SD/-Trp/-LeU/-His板上长出来的酵母仍然需要进行进一步严格的筛选。用灭菌滤纸影印在四缺板上SD/-HiS/-Trp/-Leu/Ade/X-gal继续培养。该培养基中缺失的营养成分ADE对于酵母细胞的生长状态具有显著的影响，如果细胞中的Ade2基因没有得到强表达，细胞即使能够存活，其生长速度也会显著降低，而且菌落将呈粉红色；而X--gal的存在，则是对LacZ基因表达效率的测定，LacZ表达效率越高，菌落所呈现的蓝色越深。在SD/-Trp/-Leu/-His板上长出来的酵母单克隆也可以用滤纸分析法进行进一步鉴定。溶液的的配置:Z-buffer(Na2HP04.7H2016.lg/L;NaH2P04.H205.50g/L;KCl0.75g/L;MgS04.7H200.246g/L)、Z-buffer/X-gal(Z-bufferlOOmL;P_巯基乙醇0.27mL;X-gal1.67mL)，具体操作步骤如下将滤纸剪成适当大小，挑取直径为2-5mm的新鲜酵母菌于滤纸上，放在液氮中浸泡lOs，注意含酵母细胞的滤纸面朝上；另一块同样大小的滤纸放入盛有Z-buffer/X-gal的培养皿中，将其浸湿；取出液氮中的滤纸，待恢复至室温后，覆盖在培养皿中另一块已浸湿的滤纸上，含酵母细胞的滤纸面朝上，避免产生气泡，使其与溶液充分接触；将培养皿盖上，放置于3(TC温育，并定期观察了蓝色克隆出现的时间。不同克隆显色的时间不同，一般是30分钟到8个小时，超过8个小时可视为假阳性。4蓝色酵母中质粒的提取(1)接种一个蓝色的单克隆至lmLSD/-trp-leu液体培养基中，转速为260rpm、30。C培养24h;(2)14000g、室温离心30s，彻底弃上清；(3)100iiL新配制3XSDS、0.2NNaOH(20%SDS15yL、2NNaOH10iiL、ddH2075iiL)，室温放置15min、反复颠倒混匀，加500yLpH7.5的TE、颠倒混匀，加60yL3MNaAC，颠倒混匀；(4)力口600uLphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1)、漩涡混匀2min，14000g2min取上清至一新Enppendorf管中；(5)重复(4)(6)加650iiL冰异丙醇、颠倒混匀，-2(TC放置20min;(7)14000g离心5min，弃上清，加100yL的70%的乙醇;(8)14000g离心5min，弃上清，重悬在10yL的TE(pH7.5)中，取lyL电转化，剩余的放-2(TC保存。5自激活实验酵母双杂交中假阳性出现还存在另外一种可能性如果cDNA文库基因编码的多肽或蛋白质片段具有与DNA结合的能力，那么该质粒所表达的AD/文库蛋白融合蛋白自身即可以激活AH109细胞中报告基因的表达，而无须依赖于文库蛋白与Bait蛋白之间的相互9作用。因此，对于筛选得到的文库质粒DNA有必要进行进一步的假阳性排除。将在蓝色酵母中提取的文库质粒DNA转入AH109中，涂在SD/-Leu平板上；3_4天后，克隆直径长至2_3mm时，挑单克隆做显色实验。将在蓝色酵母中提取的文库质粒DNA和Bait质粒共转入AH109酵母中，涂在SD/-Trp/-Leu平板上；3-4天后，克隆长至直径为2_3mm时，挑单克隆至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上划线，做显色实验。以顺序转化的方法，通过计算在SD/-Trp/-LeU板上长出的克隆数目，得出此方法的转化率为3.9X104cfu/yg，筛选的文库克隆数目有2.54X106个。在不加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，长出与pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆大约都有300个左右，这些阳性克隆继续影印在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上培养，结果仅仅长出与pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆各一个。而在加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，长出与pGBKT7DI11和pGBKT7DIV相互作用的克隆分别有50个和80个，在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上没有长出与pGBKT7DIII相互作用的阳性克隆，与pGBKT7DIV相互作用的克隆长出18个。滤纸分析方法鉴定相互作用的阳性克隆在8小时以内显蓝色。实施例2:—种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法—、cDNA文库构建1总RNA的提取与检测在整个操作过程中戴手套；用新鲜的去离子水(Milli-Q-Grade)溶解RNA，不要用DEPC水，也不要使用灭菌过的水，灭菌时蒸气污染的水会干扰后续的PCR反应。(1)取50-100mg组织样品，用0.75mlTRIZOL吐S试剂匀桨，15-30。C静置5min。(2)加入O.2mL氯仿，剧烈振荡15s后，15-3(TC静置2-15min。(3)4。C、12，000g离心15min，取上层水相。(4)加入O.5ml异丙醇，15-30。C静置10min后，4°C、12，OOOg离心10min，弃上清。(5)再加lml75X乙醇漂洗沉淀，5，000g离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。(6)取1iU进行1%甲醛变性胶电泳，1P1用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280nm波长上的光密度及初步估算RNA的纯度，-S(TC保存备用。对提取的RNA进行甲醛变性胶电泳。加样前，甲醛变性胶先预电泳5min，电压降为5v/cm;随后将样品加至凝胶孔，可用已知大小的RNA作分子量标准参照物，按3-4v/cm的电压进行电泳；紫外灯下观察电泳结果。2磁珠法分离mRNA(1)在RNase-free的Eppendorf管中加入0.11.Omg的总RNA和RNase-free水至终体积为500(2)65。C加热10min。(3)加入3iU生物素标记的01igo(dT)和13iU20XSSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷却至室温，一般需10min左右。(4)同时配0.5XSSC1.2ml和0.1XSSC1.4ml.(5)将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec)，小心去上清，切不可离心。用0.3ml0.5Xssc漂洗SA-PMPs，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。(6)将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.lml0.5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs应在30min内使用。(7)将(3)中的0ligo(dT)/mRNA退火反应物全部加人含漂洗好的SA-PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10min。(8)用磁性分离架捕获SA-PMPs，小心去上清，但不要弃去。用O.1XSSC，每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不搅动SA-PMPs.将SA-PMPs重新悬浮在0.lmlRNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。(9)用磁性分离架捕获SA-PMPs，将洗脱的mRNA吸入另一个新的E卯endorf管中。(10)将SA-PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脱，与(11)步洗脱液合并。(11)将得到的mRNA溶液取几微升进行凝胶电泳分析，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓縮(浓縮步骤见14-18)。(12)加0.1体积的3MNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-2(TC沉淀过夜。(13)4。C，13，000g离心60min。去上清，加入500ii170%乙醇混匀。(14)4°C，7，500g离心10min。(15)去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。(16)重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。注意事项所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行；如果totalRNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。3cDNA的合成按CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit说明书操作。其原理是利用真核生物mRNA5'端的甲基化G(m76)且5'三磷酸键连接的特殊的帽子结构和3'端的PolyA尾的特点设计锚定引物，分别进行第一链合成，引物延伸合成第二链，酶切消化和柱回收cDNA，从而实现富集全长cDNA的目的。l)cDNA第一链的合成在5ill反应体系中加入下列组分(于冰上操作)1yg芋螺毒腺mRNA，SMARTIVolig皿cleotide和CDSIII/3'PCR引物各1y1，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72。C温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。依次加入2iU5XFirstStrandBuffer、1ii120,1/L的DTT、1ii110,1/L的d證Mix禾口1ii1PowerScriptRT(CLONTECH)后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42。C反应lhr逆转录合成第一链，冰浴终止反应。加入1y1NaOH，68t:放置30min，冰上冷却，短暂离心，-2(TC保存。2)引物延伸法扩增cDNA第二链在lOOiil的反应体系中加入下列组分11y1第一链产物，10XAdvantage2PCRBufferlOii1，50XdNTPsMix2ii1，20iimol/L上下游锚定引物各2ii1，50XAdvantage2PolymeraseMix2iU和超纯水80iU补齐体积，然后将全部反应物混匀，放入预热至95°C的PCR仪，运行如下反应程序95。C变性lmin后，继续循环程序95。C15sec、68。C8min共3个循环，冷却至4t:后取5iaPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检领纟。剩余PCR产物于-2(TC保存。3)蛋白酶K消化在50iU上一步的PCR产物(2-3iigdscDNA)中加入2iU蛋白酶K(20yg/yl)灭活DNApolymerase，45。C温育20min，再经酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇(24:1)混合液各抽提一次，取上清，加入10iU的3M乙酸钠，1.3iU的糖原(20yg/yl)，260ii1的室温放置的95%7醇，室温14，000g离心20min，用80%乙醇洗涤沉淀，空气干燥，加入79iU去离子水充分溶解沉淀。4)Sfil酶切消化在100iil的酶切体系中加入下列组分79ii1的dscDNA，10ii1lOXSfiIBuffer，liU100XBSA和10ii1SfiI内切酶。充分混匀，短暂离心。5(TC温育2hr后，加入2iU1%的二甲苯腈蓝(xylenecyanol)混匀。5)cDNA的分级分离柱回收将上一步酶切消化好的dscDNA上样到预处理好的CHR0MASPIN-400柱，分管收集大小不一的dscDNA，每管1滴，当收集完16滴后，盖上柱子上盖；从每支收集管中取出5y1样品进行电泳检测，1%琼脂糖凝胶电泳确定符合要求的收集管号，集中后加入0.1倍体积的3MNaAc(pH4.8)、1.3yl的20mg/ml糖原及2.5倍体积的95%乙醇，-2(TC放置沉淀过夜；室温14，OOOg离心20min;吸去上清，沉淀用80%乙醇洗涤，室温14，OOOg离心5min，吸去上清，沉淀在空气中干燥10min左右；用7iU去离子水溶解干燥后的dscDNA，-2(TC保存备用，也可直接与载体连接。4dscDNA与载体的连接建立如下三个连接反应体系，同时设定对照反应体系，16t:连接16hr，以确定最佳连接比例。力B95iil灭菌的DEPC水到每个管中，加1.5iil甘糖原。吸打混匀。加入280y1冰冷的95%乙醇，混匀。-7(TC放置l-2hr。15，OOOg室温离心20min。小心移走上清，干燥沉淀。分别用5iUDEPC水溶解干燥的核酸沉淀。组分连接A(W)连接B(W)连接C(W)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5cDNA文库的转化1)电转化感受态细胞的制备(1)挑取单克隆菌落，投入盛有10mlLB液体培养基的三角瓶中(同时做培养基的空白对照)。37。C，220rpm，培养14-16个小时。(2)第二天，以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000mlLB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次0D，当0D值达到0.3-0.4时，停止培养。(3)将菌液在冰上预冷30min，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4t:，2500g离心10min。(4)弃上清，离心杯中加入少量去离子水，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4°C，4，OOOg离心10min。(5)弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000g，4°C，离心10min。(6)弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油，4。C，4，OOOg，离心10min。(7)弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ii1/管分装于1.5ml的离心管中，-80°〇冰箱中保存。(8)同时取100iil感受态加0.OlngpUC18直接电穿孔转化，检测转化效率。(9)次日观察转化子生长情况，并记录。2)电转化连接产物电转化DH5a感受态细胞每100y1菌液加入5y1连接产物或对照质粒溶液，混匀，转入电转化杯，冰浴不超过5min，用巻纸擦干外壁，马上置于BioRad电穿孔仪进行电击，电转化参数电压2.0kV;电流25iiF;电阻200Q;电击时间4.5ms。电击后立刻与800iU37t:预热的SOC培养基混合，用枪混匀，尽量吸出杯内菌液，装于干净无菌的离心管中。37°C、225rpm复苏细胞lhr，稀释103，104，105分别涂布于Cm+的LB平板上，37°C培养箱中倒置培养12-16hr，观察菌落生长情况，统计文库滴度。转化产物4t:存放备用。3)电击杯清洗流程用清水将电击杯稍冲一下。向电击杯中加入的75X酒精浸泡2hr。弃去酒精，再用蒸馏水冲洗23遍，然后用lml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯IO遍以上。加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。将清洗好的电击杯放入-20°〇冰箱内待用。注1.不同样品使用的电击杯应分开；2.每周用75%酒精浸泡30min。6质粒文库的扩增和保存将4t:存放转化率最高的一个电转产物涂布于105个15cm含Cm+的LB平板上，37t:培养箱中倒置培养12-16hr。留5个平板4t:存放测序，50个平板上的菌收集保存于-7(TC，另50个平板上的菌落用于碱裂解法提取质粒。7cDNA克隆PCR分析随机挑取单菌落，分别溶于灭菌的去离子水中。建立一个25iU的PCR反应体系含菌落水1ii1，10XPCRBuffer2.5iil，dNTPMix，5'，3'引物和Taq酶各0.5iil，用去离子水补足25ii1。扩增循环:95。C变性4min后，94。C30sec，68。C2min25个循环，68°C5min。取5iU电泳。电泳片段>500的克隆于LB/Cm+中扩增培养，进行序列测定并保存一份于-70。C。随机挑取24个单克隆，利用载体多克隆位点两端的M13正向和反向引物进行PCR扩增鉴定，两引物之间约为280bp。PCR产物电泳表明，大小多在500bp以上，为重组子，文库重组率超过99%。考虑到毒素分子的长度较小(3-7kDa)，因此文库中所包含的cDNA插入序列也会相对较短。以上结果和分析可以显示该cDNA文库在文库重组子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。二、酵母双杂交l提取文库质粒首先扩增构建cDNA文库原始文库取30iiL加入到3mL的SOC液体中混匀，均匀的涂布在12cm的含CM+的LB平板上，每板150yL，37。C过夜，用3mL的SOC刮取每个平板上的菌落，收集所有的克隆后，部分用20%的甘油LB液体培养基-7(TC保种，取200mL用QIAGEN公司的大提质粒试剂盒提取质粒。2Bait质粒自主转录活性的测定酵母AH109菌株的Trpl、Leu2、Ura3以及His3基因被敲除，因此，该菌株不能在缺乏TRP、LEU、URA或HIS任意一种营养成分的合成培养基上生长。此外，该菌株中还含有3个报告基因，分别为受GAL1启动子控制的HIS3基因，受GAL2启动子控制的ADE2基因和受MEL1启动子控制的LacZ基因。经过测序鉴定，提取构建正确的Bait质粒，分别用醋酸锂方法转化到感受态酵母AH109细胞中。简化的醋酸锂转化酵母细胞的方法如下挑取直14径为4-6mm的单克隆酵母至1.5mL的小离心管中，加50-100yL的1XTE，高速离心10_15s收集酵母细胞；然后加入1ygBait质粒、10mgcarrierDNA和PEG8000液体(800iiL50g/100mLPEG8000、200iiL1MpH7.5LiAc和100iiLDTT)，混匀后，45。C水浴45min，直接涂板在含X--gal的30/-1"平板上，301:培养4-6天，检测是否有自激活现象。由于pGBKT7质粒中含有Trpl基因，因此，经转化后含有Bait质粒的AH109细胞可以在SD/_Trp培养基上生长。3对毒腺酵母双杂交cDNA文库进行筛选本发明选择顺序转化的方法(即在已携带Bait的AH109酵母细胞中转入毒腺的酵母双杂交cDNA文库)来进行筛选，过程如下(1)将带有Bait的AH109酵母在SD/_Trp平板上划板，3_4天后，酵母长成直径为2-3mm菌斑。挑取2_3个菌斑放入ImLSD/_Trp培养液中，漩涡分散酵母细胞，然后转入50mLSD/-Trp培养液中；(2)250rpm、30。C摇菌16-18小时至稳定期(菌浓度0D6。。>1.5);(3)酵母转瓶至300mLSD/_trp培养液中，使0D6。。=0.2-0.3;(4)230-270rpm，30。C摇菌3小时左右，至0D6。。=0.4-0.6;(5)把酵母细胞倒入50mL离心管中，室温下1000g，离心5min;(6)弃上清，用40mL灭菌水悬浮细胞，并将细胞打散，室温下1000g，离心5min;(7)小心弃上清，用1.5mL新鲜配制的灭菌的1XTE/LiAc(TE:LiAc:ddH20=1:1:8)悬浮细胞，即含Bait质粒的酵母感受态细胞；(8)取出lmL酵母感受态细胞，加入50iig文库DNA，2mgHerringtestscarrierDNA，6mL灭菌PEG/LiAc混合液(PEG:LiAc:TE=1:1:8)混匀，30°C、200rpm、培养30min;(9)取出加入700iiLDMSO、混匀；42。C水浴15min，每隔3min上下颠倒EP管以防酵母沉淀，冰浴l-2min;(10)1000g室温下离心5min，弃上清、用ImL1XTE重悬细胞，取1yL细胞用99iiL1XTE稀释后，涂在SD/-Trp/-Leu板上，用来测定转化率；剩下的用0.99mL细胞用1XTE稀释后均在涂数个SD/-Trp/-Leu/-His板上。同时转化阳性对照pGADT7-T(0.1yg)+pGBKT7-53(0.1iig)+carrierDNA+感受态AH109酵母细胞(0.ImL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL);阴性对照pGADT7-T(0.1iig)+pGBKT7_lam(0.1iig)+carrierDNA+感受态AH109酵母细胞(0.lmL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL)，分别转化后涂在SD/-Trp/-Leu板上培养。酵母细胞中的HIS基因敲除后经常出现泄漏(Leakage)，这也是在双杂交技术应用过程中产生假阳性的原因之一。在SD/-Trp/-LeU/-His板上长出来的酵母仍然需要进行进一步严格的筛选。用灭菌滤纸影印在四缺板上SD/-HiS/-Trp/-Leu/Ade/X-gal继续培养。该培养基中缺失的营养成分ADE对于酵母细胞的生长状态具有显著的影响，如果细胞中的Ade2基因没有得到强表达，细胞即使能够存活，其生长速度也会显著降低，而且菌落将呈粉红色；而X--gal的存在，则是对LacZ基因表达效率的测定，LacZ表达效率越高，菌落所呈现的蓝色越深。在30/-1卬/-1^11/-附8板上长出来的酵母单克隆也可以用滤纸分析法进行进-步鉴定。溶液的的配置:Z-buffer(Na2HP04.7H2016.lg/L;NaH2P04.H205.50g/L;KC10.75g/15L;MgS04.7H200.246g/L)、Z-buffer/X-gal(Z-bufferl00mL;P_巯基乙醇0.27mL;X-gal1.67mL)，具体操作步骤如下将滤纸剪成适当大小，挑取直径为2-5mm的新鲜酵母菌于滤纸上，放在液氮中浸泡lOs，注意含酵母细胞的滤纸面朝上；另一块同样大小的滤纸放入盛有Z-buffer/X-gal的培养皿中，将其浸湿；取出液氮中的滤纸，待恢复至室温后，覆盖在培养皿中另一块已浸湿的滤纸上，含酵母细胞的滤纸面朝上，避免产生气泡，使其与溶液充分接触；将培养皿盖上，放置于3(TC温育，并定期观察了蓝色克隆出现的时间。不同克隆显色的时间不同，一般是30分钟到8个小时，超过8个小时可视为假阳性。4蓝色酵母中质粒的提取(1)接种一个新鲜蓝色的酵母菌单克隆至4.5mLSD/-trp-leu液体培养基中，转速为260rpm、30。C培养约48h;(2)14000g、室温离心5min，弃上清，残留液约50iiL;(3)力卩50iiLlyticas(母液5units/iiL)，漩涡混匀；(4)37°C、200-250rpm温育2h，加50yLSDS，漩涡混匀，放-2(TC冰箱反复冻融5次；(5)接细菌质粒抽提试剂盒的操作往下做，最后水洗60iiL，旋转浓縮至10iiL，取2yL电转化，剩余的放-2(rc保存。5自激活实验酵母双杂交中假阳性出现还存在另外一种可能性如果cDNA文库基因编码的多肽或蛋白质片段具有与DNA结合的能力，那么该质粒所表达的AD/文库蛋白融合蛋白自身即可以激活AH109细胞中报告基因的表达，而无须依赖于文库蛋白与Bait蛋白之间的相互作用。因此，对于筛选得到的文库质粒DNA有必要进行进一步的假阳性排除。将在蓝色酵母中提取的文库质粒DNA转入AH109中，涂在SD/-Leu平板上；3_4天后，克隆直径长至2-3mm时，挑单克隆做显色实验。将在蓝色酵母中提取的文库质粒DNA和Bait质粒共转入AH109酵母中，涂在SD/-Trp/-Leu平板上；3-4天后，克隆长至直径为2_3mm时，挑单克隆至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上划线，做显色实验。以顺序转化的方法，通过计算在SD/-Trp/-LeU板上长出的克隆数目，得出此方法的转化率为3.9X104cfu/yg，筛选的文库克隆数目有2.54X106个。在不加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，长出与pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆大约都有300个左右，这些阳性克隆继续影印在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上培养，结果仅仅长出与pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆各一个。而在加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，长出与pGBKT7DI11和pGBKT7DIV相互作用的克隆分别有50个和80个，在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上没有长出与pGBKT7DIII相互作用的阳性克隆，与pGBKT7DIV相互作用的克隆长出18个。滤纸分析方法鉴定相互作用的阳性克隆在8小时以内显蓝色。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。权利要求一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤(1)、将空载体pDNR-LIB的一个单克隆质粒，用NdeI和XhoI双酶切后，回收短片段；(2)、将质粒pGADT7也用NdeI和XhoI双酶切后回收大片段；(3)、这两个片段通过T4DNA连接酶连接、转化和测序鉴定，这个质粒载体就改造成了酵母双杂交文库的载体，为pGADT7M，这个载体上就含有两个SfiI酶切位点，以pGADT7为基础改造的，具备pGADT7所具备的用于细菌中复制、酵母中复制和表达，和酵母双杂交等所具备的元件pUCori，Ampr，2μori，LEU2，GAL4AD，PADH1，TADH1，SV40NLS，HATag。2.根据权利要求l所述的一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，其特征在于，构建全长cDNA文库，测序时可用T7通用测序引物。3.根据权利要求l所述的一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，其特征在于，用pGADT7M构建的全长cDNA文库质粒，可转化酵母，用于酵母双杂交。全文摘要本发明公开了一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，该方法制备的载体包含单酶切而产生两个不同粘末端的酶切位点SfiI，即可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建和测序；同时插入基因与GAL4的激活域融合，是一个酵母表达载体，可作为酵母双杂交的筛选文库。本发明获得一个既可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建、测序又能用于酵母双杂交的筛选文库的质粒pGADT7M。文档编号C12N1/19GK101775441SQ20101011698公开日2010年7月14日申请日期2010年3月3日优先权日2010年3月3日发明者佘玮,彭迎春申请人:彭迎春