制备流感病毒的多质粒系统的制作方法

专利名称：制备流感病毒的多质粒系统的制作方法
交叉参照相关申请本申请要求下列申请的优先权和利益2002年4月26日提交的美国临时申请60/375,675号；2002年7月9日提交的60/394,983号；200年9月12日提交的60/410,576号；2002年10月18日提交的60/419,802号；2002年10月23日提交的60/420,708号；2003年3月24日提交的60/457,699号(代理人备案号26-000250US)；以及2003年4月10日提交的题为“制备流感病毒的多质粒系统”申请，其代理人备案号是26-000260US，每个申请的说明书都已完整纳入本文作为参考。
背景技术：
流感病毒由含分节的单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核及外面的脂蛋白包膜组成，其中脂蛋白包膜由基质蛋白连在一起。A型流感病毒和B型流感病毒都含有8节段的负极性单链RNA。A型流感病毒基因组至少编码11个多肽。节段1-3编码3个多肽，组成病毒RNA依赖的RNA聚合酶。节段1编码聚合酶复合物蛋白PB2。另外的聚合酶蛋白PB1和PA分别由节段2和节段3编码。另外，某些A型流感病毒株的节段1还编码一个小蛋白PB1-F2，是由PB1编码区内的另一个阅读框架产生的。节段4编码血凝素(HA)表面糖蛋白，参与细胞粘附以及使病毒在感染期内进入细胞。节段5编码核壳体核蛋白(NP)多肽，这是一种与病毒RNA相连的主要结构蛋白。节段6编码神经酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。节段7编码两种基质蛋白，被称为M1和M2，是由经不同方式剪接的mRNA翻译的。节段8编码NS1和NS2(NEP)，这是两种非结构蛋白，由经其他方式剪接的mRNA翻译的。
B型流感病毒的8个基因组节段编码11种蛋白。三个最大的基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。节段4编码HA蛋白。节段5编码NP。节段6编码NA蛋白和NB蛋白。NB和NA蛋白都是由双顺反子mRNA的重叠阅读框架翻译的。B型流感病毒的节段7也编码两种蛋白M1和BM2。最小的节段编码两种产物NS1是由全长RNA翻译的，NS2是由剪接的mRNA变体翻译的。
制备出能产生特异性抗流感病毒保护性免疫反应的疫苗已经超过50年。这些疫苗包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒活疫苗。这些类型的疫苗中任何一种的合适制剂都可以产生系统免疫反应，而减毒活疫苗还可以在呼吸道内刺激局部粘膜免疫。
FluMist是一种减毒活疫苗，可保护儿童和成人不患流感(Belshe等，(1998)，“冷适应的三价鼻内减毒活流感疫苗对儿童的效应”(The efficacy of liveattenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine inchildren)，N Engl J Med 3381405-12；Nichol等，(1999)，“鼻内减毒活流感疫苗对健康的、工作的成年人的效应随机对照临床试验”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adultsarandomized controlled trial)，JAMA 282137-44)。FLUMIST疫苗株含有来源于当前流行的野生型病毒株的HA和NA基因节段及来源于普通主供体病毒(common masterdonor virus)(MDV)的六个基因节段PB1、PB2、PA、NP、M和NS。FluMist的A型流感病毒株的MDV(MDV-A)是在连续降低温度的条件下在原代鸡肾组织培养物中通过野生型A/Ann Arbor/6/60病毒株(A/AA/6/60)的系列传代而得到的(Maassab(1967)“流感病毒在25℃时的适应和生长特性”(Adaptation and growth characteristicsof influenza virus at 25 degrees C)Nature 213612-4)。MDV-A可在25℃时有效复制(ca，冷适应)，但是其生长在38℃和39℃时受到抑制(ts，温敏)。另外，这种病毒在被感染的雪貂肺内不能复制(att，减毒的)。这种温敏表型相信是限制其在人呼吸道内最冷区域之外的部位复制而导致其毒性减弱的原因。动物模型试验和临床试验表明这种特性是相当稳定的。与通过化学诱变制备的流感病毒株的这种ts表型不同，MDV-A的ts特性通过在感染的仓鼠内传代或从儿童中分离出的经传代的分离株的这种特性不会还原(最近的综述，见Murphy & Coelingh(2002)“冷适应A型和B型流感减毒活疫苗的制备原理及其应用”(Principles underlying thedevelopment and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virusvaccines)Viral Immunol 15295-323)。
12株不同的6:2重排列病毒株给予超过20,000名成人和儿童进行临床试验，结果发现这些疫苗是减毒的、安全而有效的(Belshe等，(1998)“冷适应三价鼻内减毒活流感疫苗对儿童的效应”(The efficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)N Engl J Med 3381405-12；Boyce等，(2000)“加佐剂的和未加佐剂的亚单位流感疫苗通过鼻内给药在健康成年人体内的安全性和免疫原性“(Safety and immunogenicity ofadjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administeredintranasally to healthy adults)Vaccine 19217-26；Edwards等，(1994)“冷适应灭活疫苗预防A型流感的随机对照临床试验”(A randomized controlled trialof cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza Adisease)J Infect Dis 16968-76；Nichol等，(1999)“鼻内减毒活流感疫苗对健康的、工作的成年人的效应随机对照临床试验”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adultsarandomized controlled trial)JAMA 282137-44)。携带MDV-A的6个内部基因和野生型病毒的两个HA和NA基因节段的重排列病毒株(6:2重排列株)能始终保持ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)“利用雪貂评价冷重组流感病毒疫苗”(Evaluationof a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)J Infect Dis 146780-900)。
到目前为止，美国所有商业化的流感疫苗都能在含胚胎的鸡蛋内繁殖。虽然流感病毒在鸡蛋内生长良好，但是疫苗的制备就要依赖鸡蛋的供应。供应鸡蛋必须是有组织的，制备疫苗的病毒株要在下一次流感季节到来前几个月开始筛选，这就限制了这种方法的灵活性，常常会导致疫苗制备和分发的延迟或短缺。
最近几年已经开发出了在细胞培养物中制备流感病毒的系统(见，Furminger.“疫苗制备”(Vaccine Production)，Nicholson等(编)，《流感教科书》(Textbook ofInfluenza)，324-332页；Merten等，(1996)“在细胞培养物中生产病毒以制备疫苗”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)，Cohen & Shafferman(编)，《疫苗设计和制备的新策略》(Novel Strategies in Designand Production of Vaccines)，141-151页)。一般来说，这些方法都是利用选定的病毒株感染适宜的永生化宿主细胞。根据已建立的组织培养方法制备疫苗虽然不会出现利用鸡蛋制备疫苗时所遇到的许多困难，但是并不是所有的流感致病株都可以良好生长和制备。另外，许多具有期望特性的病毒株，如减毒性、温度敏感性和冷适应性，利用已建立的方法在组织培养物中无法成功繁殖，而这些特性都是制备减毒活疫苗所需要的。
利用重组DNA制备流感病毒可显著提高通过组织培养方法制备流感疫苗的灵活性和实用性。最近，有报道利用插入编码病毒基因组的cDNA的重组质粒制备病毒(见Neumann等，(1999)“完全利用克隆的cDNA制备A型流感病毒”(Generation ofinfluenza A virus entirely from cloned cDNAs).Proc Natl Acad Sci USA969345-9350；Fodo等，(1999)“从重组NDA中恢复A型流感病毒”(Rescue ofinfluenza A virus from recombinant DNA)，J.Virol 739679-9682；Hoffmann等，(2000)“利用8种质粒制备A型流感病毒的DNA转染系统”(A DNA transfectionsystem for generation of influenza A virus from eight plasmids)Proc Natl AcadSci USA 976108-6113；WO 01/83794)。通过这些系统可制备能表达任何选定病毒株的免疫原性HA和NA蛋白的重组病毒和重排列病毒。但是，与A型流感病毒不同的是，还没有报道描述利用纯质粒系统来制备B型流感病毒。
另外，现在还没有一个纯质粒系统可用于生产适于制备减毒活疫苗的减毒的、温度敏感的、冷适应的病毒株。本发明提供了一种8质粒系统用于从克隆的cDNA开始生产B型流感病毒；以及制备适用于疫苗制剂的A型和B型流感减毒活病毒的方法，如鼻内使用活病毒疫苗制剂，阅读本说明书后其他的许多优点就变得很清楚了。
发明概述本发明涉及在细胞培养物中制备流感病毒的多载体系统以及制备重组流感病毒和重排列病毒的方法，包括适宜作疫苗的减毒的(att)、冷适应的(ca)和/或温度敏感的(ts)流感病毒，其中包括流感减毒活疫苗，如那些适于以鼻内疫苗制剂的形式使用的疫苗。
本发明的第一个方面涉及在无辅助病毒的情况下在细胞培养物中制备重组B型流感病毒的载体和方法(即无辅助病毒细胞培养系统)。本发明的方法包括导入一组载体，这些载体中的每一个都可以将一部分B型流感病毒插入到一群能支持病毒复制的宿主细胞内。宿主细胞在适于病毒生长的条件下培养就可以获得流感病毒。在某些实施方式中，流感病毒是减毒的病毒、冷适应病毒和/或温度敏感性病毒。例如，在一个实施方式中，载体来源的重组B型流感病毒是减毒的、冷适应的、温度敏感的病毒，适于制备成减毒活疫苗鼻内制剂使用。在一个典型的实施方式中，病毒是通过导入一群插入B/Ann Arbor/1/66流感病毒基因组的全部或部分，即ca B/AnnArbor/1/66病毒基因组的载体而制备的。
例如，在某些实施方式中，B型流感病毒是经过人工改造的流感病毒，其中插入了一个或多个氨基酸取代，从而改变了流感病毒株ca B/Ann ARBOR/1/66的生物学特性。这种流感病毒包含突变，突变导致在位置PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34上一个或多个氨基酸改变，如PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)。任何突变(在一个或多个这种位置上)不论单独或者联合在一起都会导致温度敏感性、冷适应性或减毒性相对于野生型病毒增强，这些突变都是本发明的适宜突变。
在某些实施方式中，一组载体中插入了一种B型流感病毒株的至少6个内部基因组节段以及另一种流感病毒株的编码免疫原性流感病毒表面抗原的一个或多个基因组节段，这些载体被导入到一群宿主细胞内。例如，一种选定的减毒的、冷适应和/或温敏B型流感病毒株，即B/Ann Arbor/1/66的ca、att、ts株，或经人工改造的含有上述位置上一个或多个氨基酸改变的B型流感病毒株的至少6个内部基因组节段与另一种病毒株来源的编码免疫原性抗原的一个或多个节段一起导入到一群宿主细胞内。免疫原性表面抗原一般是指血凝素(HA)和/或神经酰胺酶(NA)抗原中的一种或两种。在某些实施方式中只导入一个编码免疫原性表面抗原的节段，此时选定病毒的其他7个互补片段也导入到宿主细胞内。
在某些实施方式中，插入B型流感病毒基因组节段的一群质粒被导入到一群宿主细胞内。例如，8个质粒用于将完整的B型流感病毒基因组导入到宿主细胞内，其中每个质粒所包含的基因组节段都不相同。另外，也可以用插入较小基因组序列的更多个质粒。
一般来说，本发明的质粒载体都是双向表达载体。本发明的双向表达载体一般都包含第一启动子和第二启动子，其中第一和第二启动子与同一双链cDNA的其中一条链连接，cDNA编码包含流感病毒基因组节段在内的病毒核酸。另外，双向表达载体还可以包含多聚腺苷酸信号和/或终止序列。例如，多聚腺苷酸信号和/或终止序列位于两个启动子之间的流感病毒基因组节段的两侧。本发明的一个优选多聚腺苷酸信号是SV40多聚腺苷酸信号。本发明的典型质粒载体是pAD3000，如图1所示。
载体导入到宿主细胞内，这种宿主细胞能支持流感病毒在载体启动子控制下的复制。宿主细胞的优选例子包括Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞。在与本文所描述的pAD3000质粒载体结合使用时，优选Vero细胞、293和COS细胞。在某些实施方式中，至少两种细胞系的混合物共培养组成了宿主细胞群，如COS和MDCK细胞的混合物或293T和MDCK细胞的混合物。
包含B型流感病毒载体的宿主细胞在适宜病毒复制和装配的条件下在培养物中生长。一般来说，包含本发明的B型流感病毒质粒的宿主细胞在37℃以下培养，优选35℃或以下。细胞一般在32℃到35℃之间的温度下培养。在某些实施方式中，细胞在约32℃到34℃之间的温度下培养，如在约33℃培养。在培养一段适宜的时间使病毒复制到高滴度后收获重组的和/或重排列的病毒。收获的病毒还可以经过灭活。
本发明还涉及具有很宽适用范围的在细胞培养物中制备重组流感病毒的方法，所述方法包括将一组插入流感病毒基因组的载体导入到一群能支持流感病毒复制的宿主细胞内，在低于或等于35℃的温度下培养细胞，然后收获流感病毒。
在某些实施方式中，插入流感病毒基因组节段的一群质粒被导入到一群宿主细胞内。在某些特定实施方式中，8个质粒用于将完整的B型流感病毒基因组导入到宿主细胞内，其中每个质粒所包含的基因组节段都不相同。一般来说，本发明的质粒载体都是双向表达载体。本发明的典型质粒载体是pAD3000，如图1所示。
在某些实施方式中，流感病毒是指B型流感病毒。在另外一些实施方式中，流感病毒是指A型流感病毒。在某些特定实施方式中，方法包括收获重组的和/或重排列的流感病毒，这些病毒给予受试者时，如通过鼻内给药给予受试者时可激发免疫反应。在某些实施方式中，病毒在给药前被灭活，在另一些实施方式中，给予的是减毒活病毒。按照本发明的方法制备的重组的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒也是本发明的一个特征。
在某些实施方式中，病毒包括减毒流感病毒、冷适应流感病毒、温敏流感病毒、或者具有这几种特征的任意组合的流感病毒。在一个实施方式中，流感病毒是指B/Ann Arbor/1/66流感病毒株，即冷适应的、温度敏感的减毒株B/Ann Arbor/1/66。在其他的实施方式中，流感病毒是指A/Ann Arbor/6/60流感病毒株，即冷适应、温度敏感的减毒株A/Ann Arbor/6/60。在另一个实施方式中，病毒是经人工改造的流感病毒，其中有一个或多个影响ca A/Ann Arbor/6/60或ca B/Ann Arbor/1/66病毒生物学特性的氨基酸改变，这种取代的氨基酸优选ca A/Ann Arbor/6/60或caB/Ann Arbor/1/66的独特氨基酸，对于A型流感病毒株来说有PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；对于B型流感病毒株来说有PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。同样，这些位置上能产生温度敏感性、冷适应性和/或减毒特性的其他种类的氨基酸取代也包含在本发明的病毒和方法范围内。
另外，重排列病毒还可以通过导入含选定病毒株的6个内部基因和编码选定致病株的表面抗原(HA和NA)的基因组节段的载体来制备，其中所选定的病毒株具有适于疫苗制备的特性。例如，HA节段优选自致病性的H1、H3或B株，这都可以通过疫苗制备的常规方法实现。同样，HA节段可以选自显性致病株如H2株(如H2N2)、H5株(如H5N1)或H7株(如H7N7)。另外，第一株的7个互补基因组节段可以和HA或NA编码节段一起导入。在某些实施方式中，B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60流感病毒株。
另外，本发明还涉及制备具有期望特性的新型流感病毒，如温度敏感性、减毒特性和/或冷适应性，这些特性与疫苗的制备有关，本发明还涉及制备含这些新型流感病毒的流感疫苗的方法。在某些实施方式中，新型流感病毒A株是通过引入突变制备的，这些突变导致在一个或多个特定位置上氨基酸的取代，本文已证实这些取代对于温敏表型是十分重要的，如PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34。例如，在核苷酸位点PB11195、PB11766、PB12005、PB2821和NP146上的突变，或者其他能导致特定氨基酸位置上发生氨基酸取代的核苷酸突变。任何突变(在一个或多个这种位置上)不论单独或者联合在一起都会导致温度敏感性、冷适应性或减毒性相对于野生型病毒增强，这些突变都是本发明的适宜突变。例如，优选PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)这些突变引入野生型流感病毒A株的基因组中，即PR8，以制备适于作为减毒活疫苗使用的温度敏感突变株。为了增加期望表型的稳定性，一般要引入一组突变。将所选择的突变引入到基因组后，突变的流感病毒基因组在适于病毒制备的条件下复制。例如，突变的流感病毒基因组可在鸡蛋内复制。另外，流感病毒基因组也可在细胞培养物中复制。在后一种情况下，病毒还可以在鸡蛋内进一步扩增以提高病毒的滴度。按照本发明的方法制备的温度敏感的、减毒的和/或冷适应病毒也是本发明的特征，包含这种病毒的疫苗也是如此。同样，含有在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上出现一个或多个突变的新型重组病毒核酸，即选自下列的突变PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；以及具有这种氨基酸取代的多肽也是本发明的特征。
而且，本文所描述的方法适用于制备具有温度敏感性、弱毒性和/或冷适应性的新型流感病毒B株，该方法是将一个或多个特异性突变引入到B型流感病毒基因组中。例如，将一个或多个导致在PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159或M1183位置上发生氨基酸取代的突变引入到B型流感病毒株中以制备温敏B型流感病毒基因组。氨基酸取代的例子包括PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。如上所示，包含这种病毒以及插入这些突变和氨基酸取代的核酸和多肽的疫苗都是本发明的特征。
相应的，不论其制备方法如何，插入本发明的突变的流感病毒都是本发明的特征。这就是说，本发明包含具有本发明的突变的流感病毒株，即在相对于野生型病毒株的下列一个或多个位置上发生氨基酸取代的任何A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或在相对于野生型病毒株的下列一个或多个位置上发生氨基酸取代的任何B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183；但是病毒株ca A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66不是本发明的特征。在某些优选的实施方式中，A型流感病毒含有一组突变，其中包括PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；B型流感病毒含有一组突变，其中包括PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
在一个实施方式中，一组含有流感病毒基因组的质粒载体被导入到宿主细胞内。例如，流感病毒基因组节段可以插入到至少8种质粒内。在一个优选实施方式中，流感病毒基因组节段被插入到8种质粒内。例如，这8种质粒的每个质粒都插入有不同的流感病毒基因组节段。
本发明的载体可以是双向表达载体。本发明的双向表达载体一般都包含第一启动子和第二启动子，其中第一启动子和第二启动子可操作连接到含有流感病毒基因组节段的同一双链病毒核酸的两条链上。另外，双向表达载体还可以包含多聚腺苷酸信号和/或终止序列。例如，多聚腺苷酸信号和/或终止序列位于两个启动子之间的流感病毒基因组节段的两侧。本发明的一个优选多聚腺苷酸信号是SV40多聚腺苷酸信号。本发明的典型质粒载体是pAD3000，如图1所示。
任何能支持流感病毒在载体启动子控制下复制的宿主细胞都包括在本发明的范围之内。宿主细胞的优选例子包括Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞。在与本文所描述的pAD3000质粒载体结合使用时，优选Vero细胞、293细胞和COS细胞。在某些实施方式中，至少两种细胞系的混合物共培养组成了宿主细胞群，如COS和MDCK细胞的混合物或293T和MDCK细胞的混合物。
本发明的一个特征是含有本发明质粒的宿主细胞在37℃以下培养，优选35℃或以下。细胞一般在32℃到35℃之间的温度下培养。在某些实施方式中，细胞在约32℃到34℃之间的温度下培养，如在约33℃培养。
本发明的另一个方面涉及从培养的Vero细胞内恢复重组的或重排列的A型流感病毒或B型流感病毒(即野生型A型流感病毒或流感病毒及其突变株)的新型方法。一组含流感病毒基因组的载体通过电穿孔导入到一群宿主细胞内。细胞在适于病毒复制的条件下生长，即冷适应的、减毒的、温度敏感的病毒株，Vero细胞在37℃以下培养，优选35℃或以下。细胞一般在32℃到35℃之间的温度下培养。在某些实施方式中，细胞在约32℃到34℃之间的温度下培养，如在约33℃培养。另外(如对于疫苗的制备来说)，Vero细胞在无血清无任何动物来源的产物的培养基中生长。
在上面所描述的方法中，病毒通过培养含流感病毒基因组质粒的宿主细胞而获得。在某些实施方式中，收获的病毒是重组病毒。在另外一些实施方式中，收获的病毒是具有多个亲本病毒株基因背景的重排列病毒。另外，收获的重组病毒或重排列病毒还可以在培养的细胞内或鸡蛋内进一步扩增。
另外，收获的病毒可以被灭活。在某些实施方式中，收获的病毒组成了流感疫苗。例如，收获的流感疫苗可以是具有来源于选定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA抗原的重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列病毒)。在某些优选的实施方式中，重排列流感病毒具有减毒的表型。另外，重排列病毒可以是冷适应和/或温敏B型流感病毒，即具有表17中一个或多个氨基酸取代的减毒的、冷适应和/或温敏B型流感病毒。这种流感病毒可用作减毒活疫苗以激发针对特定致病性流感病毒株的免疫反应。按照本发明的方法制备的流感病毒，如减毒的重排列病毒是本发明的一个特征。
在另一方面，本发明涉及制备重组流感病毒疫苗的方法，所述方法包括将一群含流感病毒基因组的载体导入到一群能支持流感病毒复制的宿主细胞内，在低于或等于35℃的温度下培养宿主细胞，以及收获能在给予受试者后激发免疫反应的流感病毒。本发明的疫苗可以是A型流感病毒株，也可以是B型流感病毒株。在某些实施方式中，流感疫苗病毒包括减毒的流感病毒、冷适应流感病毒或温敏流感病毒。在某些实施方式中，病毒具有这些特性的组合。在一个实施方式中，流感病毒包含A/AnnArbor/6/60流感病毒株。在另一个实施方式中，流感病毒包含B/Ann Arbor/1/66流感病毒株。另外，疫苗还包括人工改造的A型流感病毒或B型流感病毒，其中含有至少一个取代的氨基酸，这些取代的氨基酸能影响ca A/Ann Arbor/6/60或ca/B/AnnArbor/1/66的生物学特性，如这些病毒株的独特氨基酸。例如，本发明所包含的疫苗包括人工改造的重组的和重排列的A型流感病毒，这些病毒至少有一个位置发生突变，导致下列位置上发生氨基酸取代PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及人工改造的重组的和重排列的B型流感病毒，这些病毒至少有一个位置发生突变，导致下列位置上发生氨基酸取代PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183。
在某些实施方式中，病毒包括重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列株)，这些病毒含有来源于多个流感病毒株的基因组节段。例如，优选的重排列流感病毒疫苗包含来源于选定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA表面抗原以及来源于具有与疫苗制备有关的期望特性的病毒株的内部基因组节段。通常情况下在预测致病株(如上面所描述的)在局部或世界范围内流行的基础上优选HA和/或NA编码节段来源的流感病毒株。在某些情况下，含有内部基因组节段的病毒株是减毒的、冷适应和/或温敏流感病毒株，如A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有一个或多个取代的氨基酸从而具有所期望的表型的人工改造的流感病毒株，如包含至少一个突变从而导致在下列位置上发生氨基酸取代的A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及包含至少一个突变从而导致在下列位置上发生氨基酸取代的B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183。例如，优选的重排列病毒包含具有下列一个或多个氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N2655)和NP34(D34G)；以及包含具有下列一个或多个氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
如果需要，流感病毒可以在收获后被灭活。
通过本发明的方法制备的流感病毒疫苗，包括减毒活疫苗也是本发明的特征，在某些优选的实施方式中，流感病毒疫苗是重排列病毒疫苗。
本发明的另一个方面涉及双向表达质粒载体。本发明的双向表达载体含有位于第二启动子和多聚腺苷酸位点即SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子。在一个实施方式中，第一启动子和第二启动子的方向相反，位于至少一个克隆位点的两侧。本发明的典型载体是质粒pAD3000，如图1所示。
在某些实施方式中，流感病毒基因组至少一个节段被插入到克隆位点上，形成双链核酸。例如，本发明的载体包括一种质粒，该质粒中的第一启动子位于第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间，其中第一启动子和第二启动子方向相反，位于至少一个流感病毒基因组节段的两侧。
包含本发明的一个或多个表达载体的试剂盒也是本发明的一个特征。一般来说，试剂盒还包含一个或多个能支持流感病毒复制的细胞系，缓冲液、细胞培养基、说明书、包装材料和容器。在某些实施方式中，试剂盒含有一组表达载体，每种表达载体至少含有流感病毒基因组的一个节段。例如，试剂盒包含一组表达载体，每种表达载体含有一种选定病毒株的一个内部基因组节段，所选择的病毒株具有与疫苗制备或使用有关的特性，这也是本发明的特征。例如，选定的病毒株可以是减毒的、冷适应的和/或温度敏感的病毒株，如A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有期望特征的其他病毒株，如具有本文表17中所描述的一个或多个氨基酸取代的人工改造的病毒株。在一个实施方式中，试剂盒包含的表达载体含有编码突变的HA和/或NA抗原的核酸文库的成员。
能在低于或等于35℃的温度下增殖性生长的细胞培养物也是本发明的特征，这些细胞培养物至少包括一种细胞，该细胞包含一组含有流感病毒基因组的载体。组合物还可以包括细胞培养基。在某些实施方式中，一组载体包括双向表达载体，即含有插入到第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子。例如，第一启动子和第二启动子方向相反，位于流感病毒至少一个节段的两侧。本发明的细胞培养物可在低于或等于35℃的温度下培养，如约32℃到35℃之间，一般来说是在约32℃到34℃之间，如约33℃。
本发明还涉及细胞培养系统，该系统包括上述能增殖性生长的至少包含一种细胞的细胞培养物，其中细胞包含一组含有流感病毒基因组的载体；以及维持细胞培养物在低于或等于35℃下生长的调节剂。例如，调节剂优选能维持细胞在约32℃到35℃之间生长，一般来说是在约32℃到34℃之间，如约33℃。
本发明的另一个特征是人工改造的的重组流感病毒或重排列病毒，该病毒含有一个或多个能影响温敏流感病毒、冷适应性和/或减毒特性的取代的氨基酸。例如，在如下位置上出现氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及在下列位置上发生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183都是本发明的优选实施方式。典型的实施方式包括具有下列一个或多个如下取代的氨基酸的A型流感病毒PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；以及具有下列一个或多个氨基酸取代的B型流感病毒PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。在某些实施方式中，病毒包含一组突变，如在上述位置上的1、2、3、4、5、6、7、8或9个取代的氨基酸。相应的，在上述所有5个位置上，即PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)发生氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒；以及在上述8个或所有9个位置上，即PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)发生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒也都包括在本发明的范围之内。另外，病毒也可以含有上面未提到的一个或多个其他类型的取代的氨基酸。
在某些实施方式中，人工改造的流感病毒是温敏流感病毒、冷适应的和/或减毒的流感病毒。例如，与野生型的流感病毒相比，本发明的温敏流感病毒在39℃生长时一般会降低约2.0到5.0log10。例如，与野生型的流感病毒相比，在39℃时，温敏流感病毒病毒的生长至少约降低2.0log10、约3.0log10、4.0log10或4.5log10。一般来说，但也不一定，温敏流感病毒在33℃时保持最旺盛的生长特性。通过雪貂减毒试验发现，与野生型的流感病毒相比，本发明的减毒流感病毒一般会降低约2.0到5.0log10。例如，通过雪貂减毒试验证明，与野生型的流感病毒相比，本发明的减毒流感病毒的生长至少约降低2.0log10、通常降低约3.0log10，优选降低约4.0log10。
附图简述图1pAD3000质粒的说明图2感染细胞的显微图片图3通过质粒转染所得到的rMDV-A和6:2 H1N1重排列病毒的基因型分析图4制备B型流感病毒的8质粒系统的说明图5A和B.RT-PCR分析重组MDV-B病毒的特征；C和D.RT-PCR分析重组B/Yamanashi/166/98的特征图6GeneBank形式的pAD3000序列图7MDV-B和8种质粒的序列比对图8同时扩增B型流感病毒的HA和NA节段所得到的RT-PCR产物图9柱形图说明重组病毒和重排列病毒的相对滴度图10柱形图说明重排列病毒在允许温度和限制温度下的相对滴度(温敏流感病毒)图11图表说明插入与温敏流感病毒有关的特异性突变(敲入)的重排列病毒(左图)以及在允许温度和限制温度下的相对滴度(温敏流感病毒)(右图)。
图12利用微基因组分析确定ts突变。A.HEp-2细胞转染PB1、PB2、PA、NP以及pFlu-CAT，在33℃或39℃孵育18小时，细胞提取物用于分析CAT报告基因的表达。B.利用引物延伸试验分析CAT mRNA的表达图1

PA、NP和M1蛋白上具有野生型残基的三基因重组病毒图14表格说明单基因和双基因重组病毒的生长情况
图15表格说明非ts表型相应的核蛋白的氨基酸残基图16重组PR8突变株的简图。黑点表示PB1和/或PB2基因上引入的突变图17柱形图说明在33℃和39℃时的相对滴度图18PR8突变株在各种温度下噬菌斑形态的显微照片。MDCK细胞如所示的那样转染病毒并分别在33℃、37℃和39℃孵育3天。通过免疫染色观察噬菌斑并拍照。
图19允许温度及非允许温度下的蛋白合成。MDCK细胞如所示的那样转染病毒并分别在33℃或39℃孵育过夜。SDS-PAGE电泳分离放射性同位素标记的多肽并进行放射自显影。图中指示的是病毒蛋白HA、NP、M1和NS。
图20A.线图说明MDA-V和MDV-B在Per.C6细胞内与在MDCK细胞内复制的区别。B.线图说明MDV-A单基因重排列病毒在Per.C6细胞内的不同复制情况。
详细描述许多致病性流感病毒在组织培养物中的生长状态很差，适于制备减毒活疫苗(即温敏流感病毒、冷适应的和/或减毒的流感病毒)的病毒株还无法在培养的细胞内成功生长以制备商业用途的产品。本发明提供了一种多质粒系统，该系统可使那些在标准细胞培养条件下不能生长的流感病毒株生长和恢复。
在第一个方面，本发明的方法涉及在细胞培养物中完全由克隆的病毒DNA来制备重组B型流感病毒的载体和方法。在另一个方面，本发明的方法部分基于组织培养条件的改善，这种条件能够支持具有疫苗制备相关特性(即减弱的致病性、冷适应性、温敏流感病毒等)的病毒株(流感病毒A株和B株)在体外培养的细胞内生长。流感病毒可通过将一组携带克隆的病毒基因组节段的载体导入到宿主细胞内并在不超过35℃的温度下培养而制备。当转染含流感病毒基因组的载体时，适于作为疫苗的重组病毒可通过标准的纯化方法制备。利用本发明的载体系统和方法，可快速高效地在组织培养物中制备插入有6个具有期望特性的病毒株的内部基因节段和选定致病株的免疫原性HA和NA节段的重排列病毒。因此，本文所描述的系统和方法可用于在细胞培养物中快速制备重组的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒，包括适于作为疫苗的病毒，包括减毒活疫苗，如适于鼻内使用的疫苗。
一般来说，每个A亚型和B亚型选择一个主供体病毒(MDV)株。对于减毒活疫苗来说，主供体病毒一般根据其优良的特性来选择，如与疫苗制备有关的温敏流感病毒、冷适应性和/或减毒特性。例如，典型的主供体病毒分别包括A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66的这种温度敏感株、减毒株和冷适应株。本发明在下面说明了导致这些病毒株产生ca、ts和att表型的突变，并且提供了制备适于作为供体株制备重组疫苗和重排列疫苗的新型流感病毒株的方法。
例如，一个选定的主供体A型病毒(MDV-A)或主供体B型病毒(MDV-B)可从一组含病毒基因组的克隆的病毒cDNA开始制备。在一个典型的实施方式中，重组病毒是从8个克隆的病毒cDNA开始制备的。8个病毒cDNA代表选定的MDV-A的或MDV-B的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS序列，这些cDNA被克隆到双向表达载体如质粒(如pAD3000)内，这样病毒基因组RNA就可以在RNA聚合酶I(pol I)启动子的控制下从一条链上转录出来，病毒mRNA在RNA聚合酶II(pol II)启动子的控制下从另一条链上合成出来。另外，任何基因节段都可以经过修饰，其中包括HA节段(如去除多碱基裂解位点)。
然后将携带8个病毒cDNA的质粒转染到合适的宿主细胞，如Vero细胞、共培养的MDCK/293T或MDCK/COS7细胞内，随后就可以收获感染性重组MDV-A或MDV-B病毒。利用本文所描述的质粒和方法，本发明可通过共转染选定病毒(如MDV-A、MDV-B)的6个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和不同的相应类型流感病毒(A或B)来源的HA和NA用于制备6:2重排列流感病毒疫苗。例如，HA节段最好是选自致病性的H1、H3或B病毒株，这些在疫苗制备中都是常规的。同样，HA节段也可以选自与致病株有关联的病毒株，如H2株(H2N2)、H5株(H5N1)或H7株(H7N7)。含有MDV的7个基因组节段和选定病毒株的HA或NA基因的重排列病毒株(7:1重排列病毒)也可以制备。另外，该系统还可以用于确定表型特征的分子基础，如与疫苗制备相关的减毒特性(att)、冷适应性(ca)以及温敏(ts)流感病毒。
定义除非另外给出定义，所有的科学和技术术语都被理解为与其所用领域内的常用含义相同。为了本发明的目的特地对下列术语作出定义。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”以及“核酸序列”是指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，或其嵌合体或类似物。如本文所描述，该术语还可以包括具有天然核苷酸基本属性的天然核苷酸类似物的多聚物，该多聚物可以天然核苷酸相同的方式与单链核酸杂交。除非特别说明，本发明的特定核酸序列除了包含明确指出的序列外还包含互补序列。
术语“基因”是一个被广泛使用的概念，是指有生物功能的任何核酸序列。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需要的调节序列。术语“基因”适用于特殊的基因组序列，也适用于基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
基因也包括非表达的核酸节段，如形成其他蛋白的识别序列。非表达调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白如转录因子可与之结合，导致临近或附近序列的转录。“组织特异性”的启动子或增强子是指可在特定类型的组织或细胞内调节转录的启动子或增强子。
术语“载体”是指可用于在微生物、细胞或细胞组分之间繁殖和/或转移核酸的工具。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等，载体可自主复制或整合到宿主细胞的染色体内复制。载体还可以是裸RNA、裸DNA、位于同一条链内的由DNA和RNA组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽连接的DNA或RNA、脂质体连接的DNA等，这些载体不能自主复制。本发明最常用的载体是质粒。
“表达载体”是能启动表达以及能使其携带的核酸复制的载体，如质粒。一般来说，被表达的核酸连接有启动子和/或增强子，核酸的转录被启动子和/或增强子控制。
“双向表达载体”一般具有方向相反的两个启动子，核酸位于两个启动子之间，表达可在任一方向起始转录出RNA的正义链(+)或反义链(-)。另外，双向表达载体还可以是双义载体，病毒mRNA和病毒基因组RNA(作为cRNA)从同一条链上表达。
根据本发明，术语“游离的”是指不含在天然环境中与其伴随或相互作用的组分的生物材料，如核酸或蛋白质。游离的材料还可以包含天然环境中不存在的材料，如细胞。例如，如果材料存在于天然环境中，如细胞，但是该材料在细胞内所存在的位置(如基因组或基因元件)与天然环境中所处的位置是不同的。例如，天然核酸(如编码序列、启动子、增强子等)如果以非天然的方式被引入到基因组(即载体，如质粒或病毒载体，或者复制子)内该核酸所处的天然位点不同的位点上，则该核酸就成为游离的核酸。这种核酸也被称为“异源核酸”。
术语“重组子”是指经人工改造或人工合成的材料(如核酸或蛋白)。这种改变可在其天然环境或状态中进行，也可从其天然环境或状态中去除。当这个术语指病毒，如流感病毒时，病毒是重组病毒是指该病毒是通过重组核酸的表达而制备的。
术语“重排列的”指病毒时说明病毒包含来源于多个亲本病毒株或资源的基因元件和/或多肽元件。例如，7:1重排列病毒包括第一亲本病毒来源的7个基因组节段(或基因节段)和第二亲本病毒来源的一个互补病毒基因组节段，如编码血凝素或神经酰胺酶的基因组节段。6:2重排列病毒包括第一亲本病毒来源的6个基因组节段，最常用的是6个内部基因；以及另一个亲本病毒来源的两个互补片段，即血凝素和神经酰胺酶。
术语“导入的”用于异源或游离核酸时是指核酸掺入到真核细胞或原核细胞内，其中核酸插入到细胞的基因组(如染色体、座机里、质体或线粒体DNA)内，转化形成自主复制子或瞬时表达(如转染的mRAN)。该术语包括方法如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”。在本发明中，各种方法都可以用于将核酸导入到原核细胞内，如电穿孔、钙磷酸盐沉淀、脂质介导的转染(脂转染)等。
术语“宿主细胞”是指含有异源核酸，如载体，并支持核酸复制和/或表达的细胞，该细胞还可以产生一种或多种编码查努，包括多肽和/或病毒。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，也可以是真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖类动物细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞，其中包括人源细胞。本发明所用的典型宿主细胞包括Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、Per.C6细胞(人胚胎视黄醛细胞)、BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)、原代鸡肾细胞(PCK)、Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞、Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞(如COS1、COS7细胞)。术语宿主细胞包含细胞的混合物，如不同类型的细胞或细胞系的混合培养物。
术语“温度敏感的”、“冷适应”和“减毒的”是本领域所熟知的。例如，术语“温度敏感的”(“ts”)用于A型流感病毒株说明该病毒在39℃时的滴度相对于33℃来说下降100倍或更多，用于B型流感病毒株说明该病毒在37℃时的滴度相对于33℃来说下降100倍或更多。例如，术语“冷适应”(“ca”)是指病毒在25℃时的生长在其33℃时的生长的100倍以内。例如，术语“减毒的”(“att”)是指病毒可在雪貂的上呼吸道内复制但是在肺组织内检测不到，也不能引起动物出现感冒样的疾病。也可以理解为病毒具有中间表型，即病毒在39℃(对于A株病毒来说)或37℃(对于B株病毒来说)时滴度降低小于100倍，在25℃时的生长比其在33℃的生长高100倍以上(如200倍、500倍、1000倍、10000倍以内)，和/或其在雪貂肺内的生长弱于其在上呼吸道内的生长(即毒性部分降低)和/或在动物体内引起的感冒样疾病较轻，具有本文所描述的一个或多个氨基酸取代的病毒也是本发明所包括的有用病毒。生长是指病毒量的增加，通过测定滴度、噬菌斑大小或形态、颗粒密度或本领域技术人员所熟知的其他方法。
术语“人工改造的的”用于本文是指病毒、病毒核酸或病毒编码产物如多肽、疫苗含有至少一个通过重组方法引入的突变，如定向诱变、PCR突变等。术语“人工改造的的”用于含有一个或多个核苷酸突变和/或氨基酸取代的病毒(或病毒成分或产物)时是指编码病毒(或病毒成分或产物)的病毒基因组或基因组节段不是来源于天然资源，如天然产生的或通过非重组方法(如在25℃下累进传代)制备的以前已经存在的实验室病毒株，即野生型的或冷适应A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66S流感病毒株。
流感病毒流感病毒的基因组由线性(-)核糖核酸(RNA)链的8个节段组成，分别编码免疫原性的血凝素(HA)和神经酰胺酶(NA)蛋白；以及6个内部核心多肽核外壳核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、非结构蛋白(NS)、以及3个RNA多聚酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在复制期间，基因组病毒RNA在宿主细胞的核内转录成(+)链信使RNA和(-)链基因组cRNA。8个基因组节段都包装到核糖核蛋白复合体内，该复合体内除了RNA外还含有NP和多聚酶复合体(PB1、PB2和PA)。
在本发明中，8个节段中的每一个相应的病毒基因组RNA被插入到重组载体中进行操作和制备流感病毒。各种载体，包括病毒载体、质粒、粘粒、噬菌体以及人工染色体都可以用于本发明中。为了便于操作，病毒基因组节段一般插入到质粒载体内，载体中含有一个或多个能在细菌和真核细胞内发挥功能的复制起点，还可以含有筛选标记基因以便于筛选转染质粒序列的细胞。典型的载体是图1所示的pAD3000。
本发明最常用的质粒载体是双向表达载体，该载体可使插入的病毒基因组节段在任何一个方向上起始转录，合成出(+)链RNA和(-)链RNA。为了提高双向转录的效率，每个病毒基因组节段都插入到含有至少两个独立启动子的载体内，这样病毒基因组RNA的拷贝可被第一RNA聚合酶启动子(即Pol I)从一条链上转录出来，而病毒mRNA被第二RNA聚合酶启动子(即Pol II)合成。相应的，两个启动子以相反方向排列，位于至少一个克隆位点(即限制性内切酶识别序列)的两侧，优选独特的克隆位点来插入病毒基因组RNA片段。另外，“双义”载体也可以使用，其中(+)链mRNA和(-)病毒RNA(作为cRNA)从同一条链上表达。
表达载体需要表达的流感病毒基因组节段被连接到控制mRNA合成的适当转录控制序列(启动子)上。各种启动子都适用于流感病毒基因组节段在表达载体内的转录调节。在某些实施方式中，载体是质粒pAD3000，，所用的启动子为巨细胞病毒(CMV)DNA依赖的RNA聚合酶II(Pol II)启动子。如果需要，例如为了调节条件表达的需要，也可以用其他的启动子替换以诱导RNA在特定的条件下转录，或者在特定的组织或细胞内转录。许多病毒的启动子或哺乳动物如人的启动子都可以使用，可根据特定的用途来分离。例如，动物和人病毒基因组来源的启动子包括腺病毒(如腺病毒2)、乳头状瘤病毒、乙型肝炎宾度故、多瘤病毒和猿病毒40(SV40)来源的启动子以及各种逆转录病毒启动子。哺乳动物启动子包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。另外，噬菌体启动子也可以和同源的RNA聚合酶联合使用，如T7启动子。
转录还可以通过加入增强子序列来增强。增强子一般较短，约10-500bp，是一种顺式作用DNA元件，可与启动子一起增强转录。许多增强子序列已被从哺乳动物基因(血红蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中分离出来。增强子可被连接到载体内的异源编码序列的5’或3’位置，但是一般都插入到启动子的5’端。一般来说，所选择的启动子以及附加的转录增强序列能优化异源DNA在其所导入的宿主细胞内的表达(Scharf等，(1994)“热应激启动子和转录因子”(Heat stress promoters and transcription factors)Results Probl Cell Differ20125-62；Kriegler等，(1990)“增强子、启动子和剪接位点的装配以控制转移基因的表达”(Assembly of enhancers，promoters，and splice signals to controlexpression of transferred genes)Methods in Enzymol 185512-27)。另外，扩增子还可以含有核糖体结合位点或内部核糖体进入位点(IRES)以便于翻译的起始。
本发明的载体还优选包含转录终止以及稳定mRNA所需要的序列，如多聚腺苷酸位点或终止子序列。这种序列通常置于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区，有时也置于3’非翻译区。在一个实施方式中，即包含质粒pAD3000的实施方式中，多聚腺苷酸信号是由SV40多聚腺苷酸序列提供的。
另外，如上面所描述，表达载体还可以包含一个或多个筛选标记基因以提供筛选转化细胞所需要的表型性状，处理前面所列的基因外，标记物如二氢叶酸还原酶或新霉素耐药性都适于筛选真核细胞培养物。
含上述合适DNA序列以及合适启动子或控制序列的载体可用于转化允许蛋白表达的宿主细胞。虽然本发明的载体可在细菌中复制，但是大多数情况下这些载体是需要导入到哺乳动物细胞，如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞、COS细胞内以获得表达。
其他的表达元件在大对数情况下，编码流感病毒蛋白的基因组节段包括其表达，包括翻译成功能性病毒蛋白所需的任何附加序列，在其他情况下，编码病毒蛋白如HA或NA蛋白的小基因或其他人工构建体也可以使用。在这种情况下，通常需要包含特异性的起始信号以帮助异源编码序列有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子及其临近的序列。为了确保整个插入片段的翻译，起始密码子应插入到与病毒蛋白有关的正确阅读框架内。外援转录元件和起始密码子可以是各种来源的，可以是天然的，也可以是合成的。表达效率可以通过添加适于细胞系统的增强子来增强。
如果需要，编码附加表达元件如信号序列、分泌或局域化序列等的多核苷酸序列可以插入到载体内，通常与目的多核苷酸序列处于同一框架内以使表达的多肽靶向性地定位到期望的细胞腔隙、膜或细胞器内，或者分泌到细胞培养基中。这些序列是本领域技术人员所熟知的，包括分泌前导肽、细胞器靶向性序列(如细胞核定位序列、内质网滞留信号、线粒体转运虚礼)、膜定位/锚定序列(如停止运送序列、GPI锚定序列)等。
流感病毒疫苗流感病毒疫苗以前都是根据经验预测将要流行的病毒株，然后选择病毒株在含胚胎的鸡蛋内制备。最近，重排列病毒株已经被制备出来，这些病毒含有选定的血凝素和神经酰胺酶抗原，是已经被认可的减毒的、温敏流感病毒主病毒株。经过在鸡蛋内多次传代培养以后收获流感病毒，还可以选择利用甲醛和/或β-丙内酯灭活。但是，以这种方式制备流感疫苗有几个明显的缺点。从鸡蛋内剩余的污染物是具有高抗原活性的，是由于高热所产生的，常常会在使用后产生明显的副作用。更重要的是，设计需要制备的病毒株必需在下一个流行季节到来前几个月开始筛选和分配以便于有足够的时间来制备和灭活流感疫苗。在细胞培养物中制备重组和重排列疫苗的企图也受到了被批准可以制备疫苗的病毒株都不能在标准细胞培养条件下生长这一问题的阻碍。
本发明提供了在细胞培养物中制备重组和重排列病毒的载体系统和方法，这使根据一个或多个选定的抗原性病毒株来快速制备疫苗成为可能。特别是本发明提供的条件和病毒株可使病毒在细胞培养物中从多质粒系统中有效制备出来。另外，如果需要，病毒还可以在鸡蛋内进一步扩增。
例如，利用标准的细胞培养条件如在37℃使流感病毒B主病毒株B/AnnArbor/1/66生长是不可能的。在本发明的方法中，多质粒系统中的每一个质粒都含有一个流感病毒基因组的节段，这个系统被导入到适宜的细胞内，然后在低于或等于35℃的温度下培养细胞。一般来说，细胞培养物可在约32℃到35℃之间的温度下培养，优选约32℃到34℃之间，如约33℃。
通常细胞培养物都是在一个系统内培养，如细胞培养箱，控制湿度和CO2含量，利用温度调节装置是温度保持在一个恒定的范围内，如恒温器以确保温度不超过35℃。
重排列病毒可以通过导入一组载体很容易地获得，这些载体含有主流感病毒的基因组节段和来源于目的病毒株(即感兴趣的抗原性病毒株)的互补节段。一般来说，主病毒株的选择是基于其是否具有与疫苗使用有关的特性。例如，对于疫苗制备，即减毒活疫苗的制备来说，选择的主供体病毒要有减毒表型、冷适应性和/或温敏流感病毒。因此，流感病毒A株ca A/Ann Arbor/6/60；流感病毒B株ca B/AnnArbor/1/66；或其他具有期望表型特性即减毒特性、冷适应性和/或温敏流感病毒病毒株，如实施例4所描述的人工改造的流感病毒A株；或者表17所列的一个或多个取代的氨基酸的人工改造的流感病毒B株都优选为主供体病毒株。
在一个实施方式中，含有主流感病毒株6个内部基因(即PB1、PB2、PA、NP、M1、NS1和NS2)和抗原性病毒株，即经预测可能引起明显的局部或全球流感的病毒株来源的血凝素和神经酰胺酶片段的质粒被转染到合适的宿主细胞内。重排列病毒在适于有效生长的温度，即低于或等于35℃，如在约32℃到35℃之间，例如在约32℃到34℃之间，或约33℃下在细胞培养物中复制，然后收获重排列病毒。另外，收获的病毒还可以用变性剂如甲醛或β-丙内酯灭活。
减毒的、温度敏感的和冷适应的流感病毒疫苗在一个方面，本发明是基于确定导致优选的主供体病毒株产生ts表型的突变。为了确定单个核苷酸改变对于MDV病毒株基因组的功能重要性，分析了A/AA/6/60病毒系内高度相关的病毒株来源的重排列病毒的温敏流感病毒。两个亲本病毒的同基因特性可以使单核苷酸改变对ts表型的影响得以评价。相应的，MDV-A的ts表型在核苷酸水平上的基因基础被映射到PB1、PB2和NP内的特异性氨基酸上。
以前有研究人员试图利用共感染/重排列技术绘制ca A/AA/6/60的ts表型的基因基础以制备出A/AA/6/60和不相关的野生型病毒株之间的单基因和多基因重排列病毒。这些研究表明PB2和PB1与ts表型都有关系(Kendal等，(1978)“重组病毒在亚理想温度下的生化特性有迹象表明ts损伤存在于RNA节段1和3，RNA1编码病毒原转录酶”(Biochemical characteristics of recombinant viruses derivedat sub-optimal temperaturesevidence that ts lesions are present in RNAsegments 1 and 3，and that RNA 1 codes for the virion transcriptase enzyme)，734-743页，B.W.J.Mahy和R.D.Barry(编)，Negative Strand Viruses，AcademicPress；Kendal等，(1977)“野生型和冷突变(温敏流感病毒)流感病毒的比较研究重组的冷适应病毒H3N2的基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)的系谱学”(Comparativestudies of wild-type and cold mutant(temperature sensitive)influenzavirusesgenealogy of the matrix(M)and the non-structural(NS)proteins inrecombinant cold-adapted H3N2 viruses)，J Gen Virol37145-159；Kendal等，(1979)“野生型和冷突变(温敏流感病毒)流感病毒的比较研究在突变型A/AnnArbor/6/60与野生型H3N2病毒株重组的过程中病毒复制的温敏流感病毒与病毒原转录酶活性的温敏流感病毒是相互独立的”(Comparative studies of wild-type andcold-mutant(temperature sensitive)influenza virusesindependentsegregation of temperature-sensitivity of virus replication fromtemperature-sensitivity of virion transcriptase activity duringrecombination of mutant A/Ann Arbor/6/60 with wild-tyoe H3N2 strains)，J GenVirol，44443-4560；Snyder等，(1988)“4个病毒基因对活流感A/AnnArbor/6/60(H2N2)冷适应重排列病毒疫苗的减毒活性的贡献是独立的”(Four viralgenes independently contribute to attenuation of live influenza A/AnnArbor/6/60(H2N2)cold-adapted reassortant virus vaccines)，J Virol62488-95)。但是这些研究的结果被两株不同流感病毒A株来源的混合基因节段所导致的相互影响效应所混淆。通过A/AA/6/60和野生型基因节段而不是具有A/AA/6/60基因背景的表达ts表型的其他病毒株之间的改变可使相互作用减弱。相互影响效应也显示出可混淆M基因组节段与att表型之间相互关系的解释(Subbarao等，(1992)“流感病毒A/Ann Arbor/6/60冷适应病毒(H2N2)M基因所赋予的A/Korea/82(H3N3)重排列病毒的减毒表型来自于基因相互影响效应”(Theattenuation phenotype conferred by M gene of the influenza A/Ann Arbor/6/60cold-adapted virus(H2N2)on the A/Korea/82(H3N2)reassortant virus resultsfrom a gen constellation effect)，Virus Res，2537-50)。
在本发明中，导致氨基酸在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上发生取代的突变已被确定对于MDV-A株病毒的温敏表型是具有功能意义的。正如本领域技术人员所理解的，在PB11195、PB11766、PB12005、PB2821和NP146位置上发生的核苷酸突变可分别导致在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上发生氨基酸取代。因此，任何能导致在这些位置上发生氨基酸取代的核苷酸改变都是本发明的特征。典型的突变包括单个突变PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)，优选的是联合突变，结果导致病毒产生温敏表型。同样这些突变恢复到野生型ts表型就会消失，而将这些突变引入具有野生型基因背景的病毒中就可以使其具有ts表型。和病毒传代期间这些表型的稳定性一致的是，单个变化不能使病毒的温敏流感病毒回复到野生型病毒的水平。而且这些改变是在一起协调作用来完全表达ts表型的。这个发现可以使我们将其他温敏流感病毒A株改造成适于制备减毒活流感疫苗的主供体病毒。
同样，主供体病毒B株上每个氨基酸的改变都是与表17中所列的ts表型相关的。因此，本文所描述的方法适于通过在流感病毒B株基因组内引入一个或多个特异性突变来制备具有温敏表型、还可以具有减毒表型和/或冷适应表型的新型流感病毒B株。例如，将一个或多个能导致在下列位置上发生氨基酸取代的突变引入到流感病毒B株基因组中制备温敏B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183。典型的氨基酸取代包括PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
无论其制备方法如何，含有本发明的突变的流感病毒都是本发明的特征。也就是说本发明包括含有本发明的突变的流感病毒株，即在一个或多个下列位置上出现相对于野生型的氨基酸取代的任何A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或者在一个或多个下列位置上出现相对于野生型的氨基酸取代的任何B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183，但是病毒株ca A/AnnArbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66不是本发明的特征。在某些优选的实施方式中，A型流感病毒含有一组(即2个、3个、4个、5个或更多个)如下突变PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；B型流感病毒含有如下一组突变PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。例如，除了提供具有与疫苗制备有关的表型的病毒以外，含有一组突变，如1、2、3、4或5个选择的突变，的病毒还可用于研究其他突变对病毒表型的影响。在某些实施方式中，流感病毒含有至少一个其他的非野生型核苷酸(可能导致其他的氨基酸改变)，这个核苷酸还可能赋予病毒期望的表型或对已有的期望表型进一步作出贡献。
细胞培养病毒的增殖一般都是在培养宿主细胞的培养基中。适于流感病毒复制的宿主细胞包括Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、MDCK cells细胞和COS细胞，比如293T细胞、COS7细胞。通常用上述两种细胞系的共培养物，如MDCK细胞与293T细胞或COS细胞以1∶1的比例共培养以提高复制的效率。细胞一般在标准的商用培养基中培养，如添加血清(如10％胎牛血清)的Dulbecco改进的Eagle培养基，或无血清培养基，控制湿度和CO2的浓度以维持适宜的中性缓冲pH(即pH在7.0到7.2之间)。另外，培养基中还可以加入抗生素以防止细菌生长，如青霉素、链霉素等，还可以加入营养物质如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必须氨基酸、以及使细胞达到最佳生长状态的添加剂，如胰蛋白酶、β-巯基乙醇等。
培养哺乳动物细胞的方法已有很多报道，都是本领域技术人员所熟知的。通用的培养过程见下列文献的描述Freshney(1983)动物细胞的培养基本技术方法“(Culture of Animal CellsManual of Basic Technique)，Alan R.Liss，New York；Paul(1975)《细胞与组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第五版，Livingston，Edinburgh；Adams(1980)《生物化学与分子生物学实验室技术—生物化学家适用的细胞培养》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-CellCulture for Biochemists)，Work和Burdon(编)，Elsevier，Amsterdam。有关在体外制备流感病毒的特殊组织培养方法的其他细节描述见Merten等，(1996)“在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗的制备”(Production of influenza virus in cellcultures for vaccine preparation)，Cohen和Shafferman(编)，《设计和制备疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)，本文都已完整纳入作为参考。另外，对这些方法进行改动以适用于本发明也是很容易通过常规试验达到的。
用于制备流感病毒的细胞可在含血清的或无血清的培养基中培养。在某些情况下，如在制备纯化的病毒时，希望宿主细胞在无血清培养基中生长。细胞可以小规模培养，如在含25ml以下培养基的培养皿或培养瓶中培养，也可以在大培养瓶中，如在回旋瓶中振荡培养，或者在微载体微球(如DEAE-Dextran微载体微球，如Dormacell、Pfeifer & Langen；Superbead，Flow Laboratories；苯乙烯共聚物-三-甲胺微球，如Hillex，Solohill，Ann Arbor)表面利用培养瓶或反应器培养。微载体微球是一种微小的球(直径在100-200微米范围内)，为单位体积细胞培养物中的粘附细胞的生长提供了一个较大的表面积。例如，1升培养基可包含2千万以上的微载体微球，提供的生长表面超过8000mm2。对于商业用途的病毒制备，如疫苗制备来说，通常在生物反应器或发酵罐内培养细胞。生物反应器的体积小到1升以下，大到100升以上，如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)；来自B.Braun BiotechInternational(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany)的实验室和商用规模的生物反应器。
在本发明中不论培养体积的大小，培养温度维持在35℃或以下是十分重要的，这样可以确保利用本文所描述的多质粒系统有效收获重组病毒和/或重排列病毒。例如，细胞在约32℃到35℃之间的温度下培养，一般在约32℃到34℃之间，最常用的是约33℃。
通常情况下用调节器如恒温器或其他能探测及维持细胞培养系统温度装置来确保在病毒复制期间温度不超过35℃。
载体导入宿主细胞携带流感病毒基因组节段的载体按照本领域熟知的方法被导入(如转染)到宿主细胞内从而将异源核酸引入真核细胞内，这些方法包括钙磷酸盐共沉淀法、电穿孔、微注射、脂质体介导以及利用多胺转染试剂转染。例如，载体如质粒可以利用多胺转染试剂TransIT-LT1(Mirus)按照厂家的说明书导入到宿主细胞内，如COS细胞、293T细胞或者COS或293T细胞与MDCK细胞的混合物。约1μg载体导入到宿主细胞群内需要约2μl TransIT-LT1，稀释到160μl培养基中，优选无血清培养基，总体积为200μl。DNA转染试剂混合物在室温下孵育45分钟，然后加入800μl培养基。将转染混合物加入宿主细胞，然后按照上述方法培养。照此来计算，在细胞培养物中制备重组病毒或重排列病毒时，含有8个基因组节段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)的载体与约20μl TransIT-LT1混合并转染宿主细胞。另外，在转染前可用无血清培养基，如Opti-MEM I替换含血清的培养基，然后孵育4-6小时。
另外，也可以用电穿孔方法将含流感病毒基因组节段的载体导入到宿主细胞内。例如，含A型流感病毒或B型流感病毒的质粒载体优选利用电穿孔方法导入到Vero细胞内，过程如下收获5×106在添加10％胎牛血清(FBS)的改进的Eagle培养基(MEM)中生长的Vero细胞，重悬于0.4ml OptiMEM中，然后将细胞加入到电穿孔杯内。20μgDNA混合到25μl，然后加到含细胞的杯内，通过轻叩温和混匀。按照厂家的说明书(BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected)进行电穿孔，参数为300伏、950微法，持续时间28-33秒。通过温和敲打再混合细胞，电穿孔后约1-2分钟将0.7ml含10％FBS的MEM直接加入到小杯内。然后将细胞转移到标准6孔组织培养板的2个孔内，孔内含2ml MEM+10％FBS或无血清的OPTI-MEM。洗涤小杯以回收剩余的细胞，洗涤悬液分成两孔。终体积约为3.5。然后再适合病毒生长的条件下孵育细胞，即冷适应株在约33℃培养。
病毒一般从培养基中回收，感染(或转染)的细胞在培养基中生长。在浓缩流感病毒前一般要将粗分离的培养基澄清。常用的方法包括过滤、超滤、硫酸钡吸附和洗脱以及离心。例如，感染培养物中粗分离的培养基首先在1000-2000×g离心足够时间进行澄清以去掉细胞碎片和其他的大颗粒物质，如离心10到30分钟。另外，培养基还可以用0.8μm的醋酸纤维素滤器过滤以去除完整的细胞和其他大颗粒物质。另外，经澄清的培养基上清液还可以再离心以沉淀流感病毒，如15,000×g离心约3-5小时。将病毒团重悬浮到合适的缓冲液，如STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NACI；0.0001M EDTA)或pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中后，利用蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)密度梯度离心浓缩病毒。持续离心或分步骤离心都可以，如12％到60％之间的蔗糖梯度用4个12％步骤。梯度离心时要有足够的转速和时间以使病毒浓缩成可见的条带以便于回收病毒。另外，对于最大规模的商业用途来说，不用密度梯度离心而用持续模式的带状离心转子。下面文献中所描述的其他细节足以指导本领域的技术人员在组织培养物中制备流感病毒Furminger，“疫苗制备”(VaccineProduction)，Nicholson等(编)，《流感病毒教科书》(Textbook ofInfluenza)324-332页；Merten等，(1996)“在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗的制备”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation)，Cohen和Shafferman(编)，《设计和制备疫苗的新策略》(NovelStrategies in Design and Production of Vaccines)，141-151页；以及美国专利5,690,937号。如果需要，回收的病毒还可以用蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)作为稳定剂置于-80℃保存。
预防用疫苗的使用方法和组合物本发明的重组和重排列病毒可以混合在合适的载体或赋形剂内预防使用以刺激一个或多个流感病毒株特异性的免疫反应。载体或赋形剂通常都是药用载体或赋形剂，如无菌水、盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、甘油水溶液、乙醇、未感染的鸡蛋的尿囊液(即正常的尿囊液″NAF″)或溶液的混合物。这种溶液要按照本领域已知的方法制备以确保无菌、合适的pH、等渗性及稳定性。载体或赋形剂一般选择能使变态反应或其他不良反应最小的，并且适合特定的给药途径，如皮下注射、肌肉注射、鼻内给药等。
本发明的流感病毒一般都要给予足够的量以刺激一个或多个流感病毒株特异性的免疫反应。流感病毒的使用最好能激发保护性的免疫反应。激发抗一种或多种流感病毒株保护性免疫反应的剂量和方法是本领域技术人员所熟知的。例如，灭活的流感病毒的给药剂量约为1-1000HID50(人感染剂量)，即每个剂量内约含105-108pfu(噬菌斑形成单位)。另外，约10-50μg，如约15μg HA不添加佐剂给药，或者以更小的剂量添加佐剂给药。一般来说剂量在这个范围内可以根据年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间以及其他临床因素作出调整。预防性疫苗制剂可以用针头和注射器，或者无针注射装置皮下注射或肌肉注射系统给药。另外，疫苗制剂还可以利用滴剂、大颗粒气溶胶(大于10微米)鼻内给药，或者通过喷雾喷入上呼吸道。虽然上述给药途径都可以激发保护性的全身免疫反应，但是鼻内给药还有另外的优点，即可以在流感病毒进入部位激发粘膜免疫。对于鼻内给药来说，减毒活病毒疫苗通常是优选的，即减毒的、冷适应的和/或温敏流感病毒重组或重排列流感病毒。虽然利用单次剂量来刺激保护性免疫反应是优选的，但是通过相同的或不同的给药途径给予附加的剂量也可以达到预期的保护效果。
另外，通过体外或体内树突状细胞靶向性地与流感病毒相互作用也可以激发免疫反应。例如，增殖性的树突状细胞以足够的剂量和足够的时间与病毒接触可以使树突状细胞捕获流感病毒抗原。然后将细胞通过标准的静脉移植方法转移到被免疫的受试者内。
另外，保护性流感病毒或其亚单位的制剂还可以包含一种或多种佐剂以增强抗流感病毒抗原的免疫反应。适宜的佐剂包括皂甙、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、杆菌卡介苗(BCG)、小棒状杆菌以及合成的佐剂QS-21和MF59。
如果需要，预防性流感病毒疫苗还可以和一种或多种免疫刺激分子一同使用。免疫刺激分子包括各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，这些因子具有免疫刺激活性、免疫增强活性和原炎症因子活性，如白细胞机介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-12，IL-13)；生长因子(如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配基、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可以和流感病毒在同一种制剂内，也可以和流感病毒分别给药。蛋白质或编码蛋白质的表达载体可以使用以产出免疫刺激效应。
在另一个实施方式种，本发明的含流感病毒基因组节段的载体可用于将异源核酸导入到宿主菌或宿主细胞内，如哺乳动物细胞，其中包括来源于人的细胞，并且与上述合适的药用载体或赋形剂联合使用。异源核酸通常被插入到基因或基因节段，如节段7的M基因的非必需区。异源多核苷酸序列编码多肽或肽，或者RNA，如反义RNA或核酶。然后通过制备携带异源核酸的重组病毒将异源核酸引入宿主或宿主细胞内，病毒按照上面所描述的方法使用。
另外，本发明的含异源核酸的载体可通过共转染的方式导入到感染流感病毒的细胞内并在宿主细胞内表达。然后还可以将细胞回输到受体内，一般是回输到细胞的来源部位。在某些应用方面，细胞可通过已有的细胞转移或移植方法移植到感兴趣的组织、器官或系统位点(如上所述)上。例如，造血细胞系的干细胞，如骨髓、脐带血或外周血来源的造血干细胞可通过标准转移或输注技术转移到受体内。
另外，含异源核酸的病毒也可以转移到受体体内的细胞内。这种方法一般包括将载体颗粒注射给靶细胞群(血细胞、皮肤细胞、肝细胞、神经(包括脑)细胞、肾细胞、子宫细胞、肌肉细胞、肠细胞、颈细胞、阴道细胞、前列腺细胞等；以及各种细胞、组织、器官来源的肿瘤细胞)。可通过静脉注射病毒颗粒系统给药，也可以通过各种方法，如注射(利用针头或注射器)、无针疫苗转移、局部给药或推入组织、器官或皮肤部位将病毒颗粒直接转移到目的部位。例如，病毒载体颗粒可通过吸入、口服、静脉注射、皮下注射、真皮下注射、真皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、气管内注射、阴道或直肠注射，或者通过在手术过程中将病毒颗粒置于身体的腔隙或其他部位转移。
上述方法可通过将本发明的含异源多核苷酸的载体引入体外或体内的靶细胞群用于治疗性和/或预防性治疗疾病或失调，其中异源多核苷酸编码治疗性或预防性多肽(或肽)或RNA(入反义RNA或核酶)。编码目的多肽(或肽)或RNA的多核苷酸一般都连接有上面“表达载体”部分和“其他表达元件”部分所描述的适当调节序列。另外，一个载体或病毒可以插入多个异源编码序列。例如，除了编码治疗性或预防性活性多肽或RNA外，载体还可以含有其他治疗性或预防性多肽，如抗原、共刺激分子、细胞因子、抗生素等，和/或筛选标记等。
本发明的方法和载体可用于预防或治疗多种疾病，包括遗传疾病和获得性疾病，如以疫苗的形式预防或治疗由病毒、细菌等引起的疾病。
试剂盒为了便于使用本发明的载体和载体系统，任何载体，如含有流感病毒共有序列的质粒、含有突变的流感病毒多肽的质粒、流感病毒多肽文库质粒等，和用于包装和感染实验性或治疗性流感病毒的其他组分，如缓冲液、细胞、培养基都可以包装成试剂盒的形式。一般来说，除了上述组分外，试剂盒还包含其他材料，如使用本发明方法的说明书、包装材料以及容器。
病毒核酸和蛋白质的操作在本发明的范围内，流感病毒核酸和/或蛋白质可按照已知的分子生物学技术操作。许多这种方法，包括扩增、克隆、突变、转化等的详细过程见下列文献的描述Ausubel等，《当前的分子生物学操作技术》(2000年增补)(Current Protocolsin Molecular Biology(supplemented through 2000))John Wiley & Sons，NewYork(″Ausubel″)；Sambrook等，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989(″Sambrook″)；以及Berger和Kimmel《分子克隆技术指导，酶学方法》，152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(″Berger″)。
除了上述文献外，其他可用于扩增本发明的cDNA探针的体外扩增技术操作方法，如多聚酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Q-复制酶扩增以及其他RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)可见于下列文献的描述Mullis等，(1987)美国专利4,683,202号；《PCR技术一方法和应用指导》(PCR Protocols A Guide to Methods andApplications)(Innis等编)，Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(″Innis″)；Arnheim和Levinson(1990)C&EN 36；The Journal Of NIH Research(1991)381；Kwoh等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86，1173；Guatelli等，(1990)Proc NatlAcad Sci USA 871874；Lomell等，(1989)J Clin Chem 351826；Landegren等，(1988)Science 2411077；Van Brunt(1990)Biotechnology 8291；Wu和Wallace(1989)Gene 4560；Barringer等，(1990)Gene 89117以及Sooknanan和Malek，(1995)Biotechnology 13563。其他可用于克隆本发明的核酸的方法见于Wallace等，5,426,039号。通过PCR扩增大片段核酸的改进方法见综述Cheng等，(1994)Nature 369684及其参考文献。
本发明的某些多核苷酸，如寡核苷酸可利用各种固相技术合成，其中包括单核苷酸一和/或三核苷酸亚磷酰胺耦合化学。例如，核酸序列可通过将活化的单体或三体顺序添加到延伸的多核苷酸链上来合成，见Caruthers，M.H.等，(1992)Meth Enzymol2113。
除了合成所需要的序列以外，还可以从各个商家订购基本的核酸序列，如MidlandCertified Reagent Company(mcrc@oligos.com)，The Great American Gene Company(www.genco.com)，ExpressGen，Inc.(www.expressgen.com)，Operon Technologies，Inc.(www.operon.com)等。
另外，取代病毒多肽上的指定氨基酸可通过位点特异性突变来实现。例如，含有在功能上与表型特征，如减毒表型、冷适应性、温敏流感病毒相关的取代的氨基酸的病毒多肽可通过将特异性的突变引入编码多肽的病毒核酸片段上来制备。位点特异性突变的方法是本领域熟知的，见上述Ausubel、Sambrook和Berger的描述。许多位点特异性突变试剂盒都可以买到，如Chameleon定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla)，可按照厂家的操作说明书进行操作，将表6或表17中所描述的一个或多个氨基酸取代引入到编码流感病毒A或B多肽的基因组节段中。
实施例实施例1pAD3000的构建质粒pHW2000(Hoffmann等，(2000)“用于从8个质粒开始制备流感病毒A的DNA转染系统”(A DNA transfection system for generation of influenza A virus fromeight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA 976108-6113)经过改造，用猿病毒40(SV40)来源的多聚腺苷酸信号序列代替牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号。
SV40来源的序列用下列寡核苷酸通过Taq MasterMix(Qiagen)扩增，方向为5’到3’polyA.1AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(SEQ ID NO1)polyA.2TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(SEQ ID NO2)用质粒pSV2His作为模板。按照厂家的说明书用Topo TA cloningvector(Invitrogen)扩增出一个与预测一致的175bp产物，然后克隆到pcDNA3.1中。用EcoRV和BstEII将所需要的含SV40多聚腺苷酸信号的138bp的片段从所得到的质粒上切下，琼脂糖凝胶电泳分离，然后利用常规方法(见Ausubel，Berger，Sambrook)克隆到pHW2000的独特PvuII和BstEII位点上。所得到的质粒pAD3000(图1)经测序发现含有SV40多聚腺苷酸位点并且方向正确。pAD3000上的核苷酸295-423相对于SV40株777(AF332562)上的核苷酸2466-2594。
实施例2制备MDV-A的8质粒系统通常用冷适应性的A型流感病毒突变株A/AA/6/60作为主供体病毒制备鼻内给药的A型流感疫苗。这个病毒株在本发明中是典型的主供体病毒(MDV)。为了简化，本文将这个A/AA/6/60突变株命名为MDV-A。MDV-A病毒RNA用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)提取，8个相应的cDNA片段用表1所列引物通过RT-PCR扩增。
表1.用于克隆MDV-A8个节段的引物序列
除了编码HA和PB2的流感病毒基因组节段用含Aar I限制性内切酶识别位点的引物扩增以外，其余的6个基因都用含BsmB I限制性内切酶识别位点的引物扩增。Aar I和BsmB I cDNA片段都可以克隆到pAD3000载体的两个BsmB I位点之间。
序列分析表明所有克隆的cDNA片段都含有与MDV-A共有序列有关的突变，这些突变可能是在克隆的过程中引入的。每个基因节段中发现的突变总结在表2中。
表2.被引入到pAD3000的MDV-A克隆中的突变
所有的突变都可以用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)和表3中所列的合成寡核苷酸引物矫正回MDV-A共有序列。
表3.用于矫正MDV-A克隆中突变的引物
实施例3感染性重组MDV-A和重排列流感病毒的制备Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞和人COS7细胞用含10％胎牛血清(FBS)的改进的Eagle培养基(MEM)培养。人胚胎肾细胞(293T)用含5％FBS的Opti-MEM I(LifeTechnologies)培养。MDCK或者和COS7或者和293T细胞以1∶1的比例在6孔培养板内共培养，在细胞生长到约80％汇合时用于转染。293T和COS7细胞具有很高的转染效率，但是不允许流感病毒复制。与MDCK细胞共培养可确保重组病毒有效复制。在转染前用无血清培养基(Opti-MEM I)替换含血清的培养基，然后孵育4-6小时。质粒DNA的转染用TransIT-LT1(Mirus)，8种质粒DNA(PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)的每一种取1μg与20μl TransIT-LT1混合，然后稀释到160μl Opti-MEM I培养基中，总体积为200μl。DNA转染试剂混合物在室温下孵育45分钟，加入800μlOpti-MEM I培养基。然后将转染混合物加入到共培养的MDCK/293T或MDCK/COS7细胞细胞内。转染的细胞在35℃或33℃孵育6到24小时，如过夜，然后在每孔中加入1ml Opti-MEMI替换转染混合物。在35℃或33℃孵育24小时后，每孔中加入1ml含1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的Opti-MEM I，在孵育12小时。然后在汇合的MDCK细胞内扩增收获的病毒，或者直接在含胚胎的鸡蛋内扩增。在12孔培养板中分MDCK细胞用0.2ml转染混合物在室温下转染1小时，然后去掉转染混合物并用2ml含1μg/mlTPCK-胰蛋白酶的Opti-MEM I替换。细胞在35℃或33℃孵育3-4天。扩增出的病毒加入SPG稳定剂在-80℃保存，或者在MDCK细胞或含胚胎的鸡蛋内进行噬菌斑纯化和扩增。
MDA-A聚合物蛋白的功能性表达4种MDV-A聚合酶蛋白PB2、PB1、PA和NP的功能活性通过检测其复制编码EGFP报告基因的流感病毒微小基因组的能力来分析。一套含8个表达质粒的载体(见表4)(Hoffmann等，(2001)“用于回收A型流感病毒的8质粒回收系统；控制流感病毒的选择”(Eight plasmid rescue system for influenza A virus；Options for thecontrol of influenza)International Congress Series 12191007-1013)含有A/PR/8/34病毒株(H1N1)的cDNA以及携带编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP，pHW72-EGFP)的报告基因的流感病毒小基因组。
将MDV-A PB1、PB2、PA和NP，或PB1、PA、NP(PB2作为阴性对照)与表达流感A病毒EGFP小基因组的质粒(pHW72-EGFP)一起转染到共培养的MDCK/293T细胞内(Hoffmann等，(2000)“‘双义’方法制备A型流感病毒从一个模板内合成vRNA和mRNA”(″Ambisense″approach of the generation of influenza A virusvRNA andmRNA synthesis from one template)Virology 15267(2)310-7)。转染后48小时在相差显微镜或荧光显微镜下观察转染的细胞。另外，还可以用流式细胞仪检测EGFP的表达。
如图2所示，在转染MDV-A的PB2、PB1、PA和NP的细胞内可观察到绿色荧光，说明EGFP小基因组是表达的，而在只转染3个聚合物蛋白的细胞内观察不到荧光。这说明pAD3000内的MDV-A聚合酶蛋白是有功能的。
在其他的试验中，被命名为pFlu-CAT的含氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的小基因组用于检测聚合酶的活性。在这个试验中CAT在蛋白水平(如通过ELISA)或RNA水平的表达作为小基因组复制的指标。
通过单基因重排列试验分析MDV-A质粒通过MDV-A的单个基因节段与对照病毒株A/PR/8/34的其他7个互补节段共转染进行重排列试验，结果表明克隆到pAD3000内的8个MDV-A基因组节段都是有功能的。所有8个含单个基因组节段的质粒与对照病毒株的互补节段共转染都可以产生出具有感染性的重排列病毒，这些病毒可以在感染的MDCK细胞内引起细胞病理效应，说明所有这8个质粒都能编码具有功能的MDV-A蛋白。
表4.7+1重排列病毒通过质粒恢复
为了进一步确定A型流感病毒的包装限制，将NS节段分为两个基因节段一个编码NS1基因组节段，另一个编码NS2基因组节段。将含有A型流感病毒9个基因组节段的9个质粒转染到上述MDCK/COS细胞内，在用MDCK细胞测定滴度前先用含胚胎的鸡蛋扩增收获的病毒。结果看到9质粒系统所产生的噬菌斑比上述的8质粒系统小。RT-PCR分析表明只有NS2节段存在于病毒颗粒内，而NS1基因没有被包装进去。
MDV-A和6:2重排列病毒的收获根据上面描述的方法，用8个MDV-A质粒(重组病毒)或用含6个MDV-A内部基因以及A/PR/8/34来源的HA和NA基因的质粒(6:2重排列病毒)转染后3天，收集培养物上清用于转染新的MDCK细胞，转染的细胞在1μg/ml TPCK-胰蛋白酶存在的条件下在33℃孵育3天。利用显微镜观察重组病毒的胞浆效应。病毒血凝素的表达用标准的血细胞凝集试验(HA)进行分析。HA分析是通过50μl系列倍比稀释的培养上清与50μl 1％鸡红细胞在96孔板内混合而进行的。转染的8 MDV-A质粒来源的扩增病毒以及6:2重排列病毒所检测到的HA滴度约为1:254-1:1024。利用E.Hoffman博士惠赠的8A/PR/8/34质粒进行的转染反应作为阳性对照。这3个转染反应所制备的感染性流感病毒列在表5中。
表5.用于恢复A/PR/8/34、MDV-A和6:2重排列病毒的质粒
利用RT-PCR测定回收的病毒的基因型。用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)从感染细胞培养上清中分离病毒RNA，用每个MDV-A基因节段的特异性引物以及H1和N1特异性引物通过RT-PCR扩增8个流感病毒的节段。如图3所示，rMDV-A所含有的PB2、PB1、NP、PA、M和NS是MDV-A特异性的，HA和NA是H2和N2亚型特异性的。6:2重排列病毒含有MDV-A来源的6个内部基因和A/PR/8/34(H1N1)来源的HA和NA。这说明用转染质粒制备的病毒具有正确的基因型。
用MDCK细胞做噬菌斑形成试验分析回收病毒的滴度，噬菌斑是否是流感病毒所形成的通过抗MDV-A的鸡血清进行免疫染色来确定。在12孔板内MDCK细胞生长到100％汇合时用100μl 10倍系列稀释的病毒感染，在室温下温和摇动1小时。去掉接种物，细胞用含0.8％琼脂糖和1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的1×L15覆盖。培养板放到35℃或33℃孵育3天，然后用100％甲醇固定，用含5％牛奶的PBS封闭，与1∶2000稀释的鸡抗MDV-A抗血清孵育1小时，然后再与HRP连接的兔抗鸡IgG孵育1小时。加入HRP底物溶液(DAKO)就可以看到噬菌斑。所有回收的病毒免疫染色都呈阳性。
实施例4绘制MDV-A的ca、ts、att表型的基因基础MDV-A流感病毒疫苗株具有几种与疫苗制备有关的表型，即减毒活疫苗冷适应性(ca)、温敏流感病毒(ts)和减毒特性(att)。MDV-A株与非ts毒性野生型A/AA/6/60株的序列比较表明两个病毒株之间有17nt的差异(表6)。通过与GeneBank数据库中的所有A型流感病毒相比发现MDV-A序列内的几个变化都是这个病毒株所独有的，说明这些取代的氨基酸中的一个或多个是与att、ca及ts表型相关的。在PB2821位置上发生的单个氨基酸改变是唯一一个以前已报道的决定MDV-A ts表型的核苷酸位置(Subbarao等，(1995)“在A型流感转染体病毒的PB2基因上引入温敏流感病毒错义突变可影响温敏流感病毒和减毒活性的升高并使人工改造的A型流感病毒活疫苗的设计更合理”(Addition of Temperature-Sensitive Missense Mutations into thePB2 Gene of Influenza A Transfectant Viruses Can Effect an Increase inTemperature Sensitivity and Attenuation and Permits the Rational Design ofa Genetically Engineered Live Influenza A Virus Vaccine)J.Virol.695969-5977)。
为了精确定位涉及MDV-A表型的最小取代，将MDV-A上与野生型A/AA/6/60不同核苷酸逐个改变成野生型A/AA/6/60的核苷酸(即″反转″)。然后将每个反转的基因节段与MDV-A的其他片段一起导入到宿主细胞以恢复单基因重排列病毒。另外，反转基因节段和相应的MDV-A片段还可以和其他野生型病毒株，如A/PR/8/34一起转染以评价每个基因节段对病毒表型的贡献。利用上述重组MDV-A质粒系统进行位点特异性突变以进一步改变6个内部基因制备出非ts重排列病毒。共有15核苷酸取代突变倍引入到6个MDV-A质粒中，代表表6中所列的重组野生型A/AA/6/60基因组(rWt，Flu064)。Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞和COS-7细胞按上述方法培养和转染。回收的病毒在MDCK细胞内传代一次，然后在含胚胎的鸡蛋尿囊腔内扩增。在MDCK和鸡蛋内的转染和病毒扩增在33℃进行，这个温度对于ca和wt病毒来说都可以将温度筛选压力降到最低。通过测定从病毒RNA中扩增出的cDNA片段的序列来确定病毒的基因型。
表6.“野生型”A/AA/6/60和MDV-A的序列比较
加粗的数字代表rMDV-A和rWt之间的区别。
加粗的单词(15)代表rmdv-a和rwt之间的变化。
表型特征用本领域熟知的方法确定，如Parkin的美国专利6,322,967号所描述的，该专利的名称为“流感病毒的重组色氨酸突变株”(″Recombinant tryptophan浮液提供了作为首次剂量的极少的接种物。尽管如此，当通过饲喂的第二个剂量来加强时，这些鸡产生反应，说明通过IN路径小剂量足以使鸡接受LT抗原。
表3
表3A显示血清学反应。无论该剂量是在0，7或14日龄提供，检测血清学反应的最早时间为21日龄。在第3、7和11组中，第三个剂量是在28日龄时提供，但不是产生可检测的滴度所需要的。在21日龄检测的反应持续到42日龄，与肉用仔鸡的上市日龄(35-65天)相吻合。
当仅给予鸡两个剂量时，观察到最佳的血清学反应，在两种情况下，首次接种在1日龄，而第二次接种在7日龄。由于通常在入孵前的第三天或者在孵化第1天通过鸡蛋进行接种，在1日龄时使鸡接触到抗原可以应用于肉用仔鸡工业生产的免疫接种实践中。
为了系统地详细地分析MDV-A ts表型的基因基础，将几个比较相近的非ts、非att野生型A/AA/6/60株的序列与具有17-48nt差异的ca A/AA/6/60，包括高度相关的分离株wt A/AA/6/60 E10SE2的序列进行比较。E10SE2和MDV-A之间共有19nt的差异(表6)。E10SE2在雪貂中是非ts(表7)和非att的。为了制备重组非ts病毒，通过位点特异性突变在MDV-A质粒中引入15-19个突变，代表10个氨基酸的改变。MDV-A和E10SE2之间不同的4个核苷酸位置PB2-1182、1212、PB1-123和NP-1550不在MDV-A序列上改变，因为这些核苷酸也存在于A/AA/6/60的其他非ts分离株，因此这些位置上的核苷酸对于ts的表达可能不产生影响(Herlocher等，(1996)“A/AA/6/60流感病毒的序列比较影响减毒表型的突变“(Sequence comparisons ofA/AA/6/60 influenza virusmutations which may contribute toattenuation).Virus Research 4211-25)。编码15个核苷酸改变的重组病毒(rWt，Flu064)得自转染8种质粒，pWt-PB2、pWT-PB1、pWt-PA、pWt-NP、pWt-M、pWt-NS、pMDV-HA和pMDV-NA的共培养的COS-7/MDCK细胞。序列分析表明rWt含有预先设计的基因改变，在39℃时是非ts表型的，与生物学方法制备的野生型A/AA/6/60一致。这些结果证明ts表型是由于这15nt核苷酸的改变。
6个内部基因节段对病毒ts表型的贡献每个野生型基因节段对MDV-A ts表型的影响通过制备重组的单基因重排列病毒来评价(表7)。野生型PB2引入rMDV-A导致病毒只在38℃时呈非温敏表型，但是，在39℃时依然保持温敏表型。通过在MDCK细胞内进行噬菌斑形成试验发现病毒滴度在38℃和39℃时分别降低0.6log10和2.7log10(与33℃相比)。含野生型PB1基因节段的重排列病毒是非温敏流感病毒，其在38℃和39℃时都可以形成噬菌斑。但是这个重组病毒形成的噬菌斑的大小受增加的温度的影响，与rWt相比在39℃时明显缩小。野生型NP基因引入rMDV-A也可导致病毒在38℃时呈非温敏表型，但是与野生型PB2重组病毒相比，这个含野生型NP基因节段的病毒在39℃时不能形成噬菌斑。将野生型PA、M或NS基因节段单独引入rMDV-A不能改变其温敏表型，说明这3个基因节段对于维持这个表型的作用很小。
由于在MDV-A背景上单独表达野生型PB1、PB2或NP都不能产生明显的噬菌斑，噬菌斑的大小无法达到非野生型rWt的程度，因此将这些基因节段以各种组合的方式导入到MDV-A中。野生型PB1和野生型PB2联合导入可导致病毒在38℃和39℃时呈非温敏表型(表7)。尽管噬菌斑的大小比任何一种单基因重排列病毒形成的噬菌斑要大，但是却比rWt形成的噬菌斑明显要小。因此，当野生型PB2、PB1或NP基因节段单独导入时只能部分反转温敏表型，而将这3个野生型基因节段联合在一起导入时却能将其温敏表型完全反转成与rWt一样的非温敏表型。
为了确定这3个基组节段是否能将MDV-A的温敏表型传递给rWt，将MDV-A来源的6个内部基因分别或联合导入到rWt中。将PB1、PB2或NP单独引入rWt可导致病毒滴度在38℃时降低，在39℃时降低更多，但是这些单基因重排列病毒都不是和rMDV-A一样限制在高温度(图10)。MDV-A来源的PA、M和NS基因节段不能影响rWt的非温敏表型。与前面的结果相一致，将MDV-A PB1和PB2两个基因导入到rWt背景中可大大增加病毒在38℃的温敏表型，但是完全反转病毒的温敏表型需要再加上NP基因。因此，MDV-A来源的PB1、PB2和NP基因节段在赋予完全的温敏表型中是同样重要的。
绘制决定MDV-A温敏表型的基因位点rWt的PB1、PB2和NP和rMDV-A的PB1、PB2和NP之间的特殊差异全部列出以确定哪些改变在温敏表型中发挥显著作用。rMDV-A的NP基因与rWt的NP基因之间的差别只在146位上(G34D，表6)。rMDV-A的PB2基因与rWt的PB2基因之间的差别在3个位点上，但是只有nt821的改变可导致氨基酸的变化(N265S，表6)，因此推断这个位点代表PB2基因节段上的温度敏感位点。rMDV-A的PB1基因与rWt的PB1基因之间的差别在6个位置上，其中有4个编码氨基酸的改变(表6)。每个野生型氨基酸残基分别替换到rMDV-A的PB1基因节段上以评价其对ts表型的影响。1395G(Glu-457)和2005G(Ala)不影响DV-A的温敏表型。1195A(Lys-391)和1766A(Glu-581)可导致在38℃时稳定敏感表型轻微下降，但是在39℃时没有作用(表8)。这些数据说明1195A和1766A可能是PB1基因节段上的温度敏感位点。但是，1195A和1766A联合起来却不能产生出与野生型PB1一致的温敏表型(表6)。将2005G而不是1395A加到PB1-1195A/1766A上还可以进一步降低病毒在39℃时的温敏表型，说明2005A对于MDV-A PB1片段的温敏表型的表达也有影响。
表8绘图描述PB1中决定ts表型的残基具有野生型序列的病毒 33℃38℃ 33℃/38℃39℃ 33℃/39℃log10PFU/mLrMDV-A8.676.00 2.67 ＜4.0＞4.67rWt 9.049.01 0.03 9.03 0.01PB1-1195A 8.066.68 1.38 ＜4.0＞4.06PB1-1395G 8.725.88 2.85 ＜4.0＞4.72PB1-1766A 8.076.70 1.37 ＜4.0＞4.07PB1-2005G 8.766.31 2.45 ＜4.0＞4.76PB1-1195A1766A8.657.60 1.05 5.98*2.68PB1-1195A1395G1766A 8.848.13 0.71 6.38*2.46PB1-1195A1766A2005G 8.798.12 0.66 7.14*1.64PB1/PB2/NP8.268.63 0.12 8.59 0.16PB2/NP8.818.21 0.59 7.56*1.25PB1-1195A/PB2/NP 8.868.81 0.05 7.60*1.26PB1-1766A/PB2/NP 9.338.84 0.50 8.71*0.62PB1-1766A2005G/PB2/NP 8.308.22 0.08 8.11*0.18PB1-1766A1395G/PB2/NP 8.888.85 0.03 8.39*0.49PB1-1195A1766A/PB2/NP 8.458.48 0.06 8.10 0.35*表示与rWt相比噬菌斑减小下划线表示在10-4倍稀释时没有检测到噬菌斑将单位点突变的PB1和野生型PB2和NP一起导入到rMDV-A中。野生型PB2/NP和rMDV-A重排列病毒在38℃时是非温敏流感病毒，在39℃时滴度下降1.25log10，但是其形成的噬菌斑与rWt相比明显减小。加上PB1-1195A或1766A不能显著改变野生型PB2/NP重排列病毒的表型。只有PB1-1195A和1766A联合与野生型PB2和NP一起才能导致病毒具有与野生型PB1/PB2/NP和rMDV-A重排列病毒相同的非温敏表型(表8)。将PB1-1395G或2005G引入野生型PB1-1766/PB2/NP也不能使病毒转变成rWt的非温敏表型。因此，这些数据说明分布在PB1、PB2和NP基因上的4个氨基酸能完全反转MDV-A的稳定敏感表型。
MDV-A和重排列病毒的宿主细胞限制性MDV-A病毒和具有一个或多个MDV-A来源节段的重排列病毒除了具有温敏流感病毒和减毒表型以外，MDV-A病毒还具有宿主细胞限制性，因为该病毒在Per.C6细胞内的生长水平要低于在MDCK细胞内的生长水平。与在MDCK细胞内相比，MDV-A和具有MDV-A来源的PB1和PB2节段的重排列病毒在Per.C6细胞内的生长水平显著降低，如图20A和20B所示。
温度敏感的减毒病毒株的改造为了确定MDV-A的PB1、PB2和NP基因节段上的5个氨基酸是否能修复MDV-A的温敏表型和减毒表型，将PB1-391E、581G、661T、PB2-265S、NP-34G引入到野生型病毒株(A/PR/8/34；″PR8″)中，结果发现病毒的滴度在38℃时下降1.9log10，在39℃时下降4.6log10，与rMDV-A的结果非常相似(图11)。
ca A/AA/6/60(MDV-A)和A/PR/8/34的PB1、PB2和NP基因的序列比较发现MDV-A的PB1和PB2基因上的4个取代的氨基酸是独有的。NP34在MDV-A和PR8之间是保守，因此，通过位点特异性突变将MDV-A的PB1基因上的3个温度敏感位点PB1391(K391E)、PB1581(E581G)和PB1661(A661T)引入到A/PR/8/34上，将PB2265(N265S)引入到A/PR/8/34的PB2上。引入到PB1和PB2上的突变通过序列分析确证。用于突变反应的引物对列在表9中。这些病毒在图16中用示意图标出。。
表9.用于将ts突变引入PR8 PB1基因和PB2基因中的引物HJ240 PR8-PB1A1195G 5’GAAAGAAGATTGAAGAAATCCGACCGCTC(SEQ ID NO79)HJ241 PR8-PB1A1195G.as5’GAGCGGTCGGATTTCTTCAATCTTCTTTC(SEQ ID NO80)HJ242 PR8-PB1A1766G 5’GAAATAAAGAAACTGTGGGGGCAAACCCGTTCC(SEQ ID NO81)HJ243 PR8-PB1A1766G.as5’GGAACGGGTTTGCCCCCACAGTTTCTTTATTTC(SEQ ID NO82)HJ244 PR8-PB1G2005A 5’GTATGATGCTGTTACAACAACACACTCC(SEQ ID NO83)HJ245 PR8-PB1G2005.as 5’GGAGTGTGTTGTTGTAACAGCATCATAC(SEQ ID NO84)HJ246 PR8-PB2A821G5’ATTTGCTGCTAGGAGCATAGTGAGAAGAGC(SEQ ID NO85)HJ247 PR8-PB2A821G.as 5’GCTCTTCTCACTATGCTCCTAGCAGCAAT(SEQ ID NO86)为了检测引入到PR8的PB1和PB2上的温度敏感突变是否能在体外导致温敏表型，进行小基因组分析。流感病毒小基因组报告子被称为pFlu-CAT，含有反义CAT基因，该基因位于pol I启动子的控制之下。CAT蛋白的表达依赖于流感病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白的表达。
简言之，HEp-2细胞用1μg PB1、PB2、PA、NP和pFlu-CAT小基因组通过lipofectamine 2000(Invitrogen)分别转染。在33℃或39℃孵育过夜(大约18小时)后，用CAT ELISA试剂盒(Roche Bioscience)分析细胞提取物中CAT蛋白的表达。CAT mRNA的表达通过因为延伸分析检测。转染后48小时，用TRIzolreagent(Invitrogen)提取细胞总RNA，1/3 RNA与过量的DNA引物(5’-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG)和T4多核苷酸激酶在6μl水内混合，其中引物在5’末端用[r-32P]-ATP标记。在95℃变性3分钟后，在反应缓冲液中加入50U反转录酶(Invitrogen)进行引物延伸，其中缓冲液中含0.5mM dNTP反应在42℃进行1小时。转录产物在含8M尿素的6％聚丙稀酰胺凝胶上进行电泳分析，缓冲液为TBE，然后进行放射自显影。
如图12A和12B所示，携带3个取代的氨基酸(PR8-3s)PB1391(K391E)、PB1581(E581G)和PB1661(A661T)的PB1基因其活性在33℃时比PR8对照降低。这个突变株在39℃时的CAT蛋白表达下降更明显(图12A)，说明具有3个引入的MDV-A温度敏感位点的PB1基因在体外试验中的复制是温敏流感病毒。将PB2265(N265S)引入PR8却对其在允许温度(33℃)和非允许温度(39℃)下的活性影响很小。PB1-3s和PB2-1s结合却可以使蛋白活性显著降低(PR8-4s)，甚至比MDV-A的温敏流感病毒更强。正如所预期的，在转染MDV-A来源的PB1、PB2、PA和NP基因的细胞内，其在39℃时的活性比野生型A/AA/6/60(wt A/AA)低很多(15％)。
PR8突变病毒按照上面描述的方法制备和回收。简言之，共培养的COS7和MDCK细胞用编码PR8来源的PR8 HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因的8个质粒转染。为了制备含4个温度敏感位点的病毒(PR8-4s)，使用含在PB1的nt1195(K391E)、nt1766(E581G)和nt2005(A661T)位置上出现3个改变的PB1-3s和在PB2的821(N265S)位置上含有一个改变的PB1-1s。另外，在PB1上有3个突变的PR8(PR8-3s)或在PB2上有1个突变的PR(PR8-1s)也分别回收。这些病毒用示意图在图16中标出。所有4个重组突变PR8病毒在鸡蛋内都以很高的滴度生长，达到9.0log10pfu/ml或更高，如表10所示。
为了检测感染细胞内病毒蛋白的合成情况，MDCK细胞用m.o.i为5的病毒感染，在转染后7小时用35S-Trans标记1小时。标记的细胞裂解物用含SDS的1.5％的聚丙稀酰胺凝胶进行电泳并进行放射自显影。用蛋白印迹试验分析蛋白的合成。在转染后8小时收获病毒感染细胞，在4-15％的梯度凝胶中电泳。用抗M1抗体或抗MDV-A的鸡多克隆抗体标记，然后用HRP标记的二抗孵育。用化学发光检测系统(Invitrogen)检测抗体结合的蛋白带，然后暴露于X射线胶片。
如图19所示，在33℃时所有的细胞都具有相似的蛋白合成水平，但是在39℃时PR8-1s感染细胞内的蛋白合成水平轻微降低，而PR8-3s和PR8-4s感染细胞内的蛋白合成水平明显下降。蛋白印迹试验也说明蛋白合成水平下降的次序为PR8-4s＞PR8-3s＞PR8-1s。因此，温度敏感突变株复制水平的降低可能是其在非允许稳定下复制减弱的结果。
通过噬菌斑形成试验分别在33℃、37℃、38℃和39℃时利用MDCK细胞测定PR8突变病毒的温敏流感病毒。收获的兵卒在含胚胎的鸡蛋内扩增，然后按上述方法导入到细胞内。病毒感染细胞在设定的温度下培养3天后，用抗MDV的鸡多克隆抗体对单层细胞进行免疫染色，计数噬菌斑形成的数目。比较每个温度下所得到的噬菌斑数目以评价每种病毒的温敏表型。关闭温度定为最低温度，与33℃相比其滴度降低100倍或更多。
如图10和图17所示，虽然病毒的滴度有稍许减少，但是所有的突变株在33℃时都能高效复制。在38℃时，所有突变株的滴度都显著下降。在39℃时，PB1基因上具有3个温度敏感位点的病毒(PR8-3s和PR8-4s)滴度下降超过4.0log10。PR8-1s在39℃时也是温敏流感病毒。PR8-4s的温敏表型与MDV-A非常相似，与在33℃时相比在39℃时滴度下降4.6log10。虽然所有3个PR8突变株在37℃时的滴度降低都不超过2.0log10，但是其噬菌斑形态与其在33℃时明显不同。如图18所示，每个突变株在33℃的噬菌斑大小只比PR8缩小一点。PR8-3s在37℃时形成的噬菌斑明显缩小，PR8-4s形成的噬菌斑更小。PR8-1s在37℃时形成的噬菌斑看不出明显缩小。在39℃时，PR8-3s和PR8-4s只能形成几个针尖大小的噬菌斑。PR8-1s所形成的噬菌斑大小大约为野生型PR8的30％。
表10.具有引入的ts位点的PR8的温敏流感病毒病毒滴度(log10pfu/ml)病毒 33℃37℃38℃39℃MDV-A 8.6 7.0 6.4 4*Wt A/AA8.7 8.7 8.9 8.3PR89.6 9.5 9.5 9PB8-1s 9.4 8.9 7.7 7.4PB8-3s 9.2 8.8 7.8 5.2PB8-4s 9.5 7.8 7.1 4.4在稀释10,000倍时检测不到病毒认为病毒滴度为4.0在雪貂中测定突变的PR8病毒的减毒活性。简言之，9-10周龄的雄性雪貂用于评价病毒在动物宿主呼吸道内的复制情况。雪貂分别饲养，鼻内接种8.5log10pfu的病毒。感染3天后用盐酸氯胺酮麻醉动物，取其肺和鼻甲(NT)。肺组织匀浆物系列稀释后在含10天胚胎的鸡蛋内测定病毒的滴度。肺内的病毒滴度(log10pfu/ml)用Karber方法计算。NT内的病毒复制情况通过噬菌斑形成试验进行分析，表示为log10pfu/ml。
病毒在肺和鼻甲内的复制水平通过EID50或噬菌斑形成试验进行检测(表11)。感染3天后，PR8在肺组织内复制到5.9log10pfu/ml的水平。但是PR8-1s在雪貂肺内的复制水平降低3.0log10pfu/ml，而PR8-3s的复制很少。在两个感染PR8-4s的组内都没有检测到PR8-4s的复制。通过EID50试验所能检测到的下限是1.5log10，因此PR8-4s的滴度被指定为log10EID50。作为对照，MDV-A在雪貂肺内不能复制，野生型A/AA/6/60的滴度为4.4log10。病毒在鼻甲(NT)内的复制通过在MDCK细胞内进行噬菌斑形成试验进行分析。PR8在鼻内的复制滴度达到6.6log10pfu/g。PR8-1s和PR8-3s的滴度只有轻微的降低。PR8-4s(A)的滴度降低2.2log10，而PR8-4s(B)的滴度降低4.3log10，该病毒在PB1基因上有改变(E390G)。PR8-4s(B)的复制水平显著降低是与其在37℃时的温敏流感病毒一致的。本文用8.5log10pfu的感染剂量代替7.0log10的剂量，而后者在评价MDV-A来源的流感病毒疫苗的减毒表型时是常用的。这个结果说明含4个MDV-A来源的温度敏感位点的PR8在雪貂的下呼吸道内的复制活性是降低的。
表11.PR8突变株在雪貂中的复制
a)未检测到病毒认为滴度是1.5log10EID50/gb)病毒还含有另外的改变PB1-1193(E390G)在温度敏感和减毒试验中，PR8突变病毒具有与MDV-A十分相似的温敏表型和减毒表型。这些数据说明浆MDV-A的独特的取代的氨基酸引入不同的流感病毒株中可使病毒具有预期的温敏流感病毒和减毒表型以便于制备减毒活疫苗。另外，温度敏感的减毒的PR-8病毒以高滴度生长，因此适于作为主供体病毒制备减毒活流感疫苗或灭活的流感疫苗。这些结果说明5个MDV-A突变PB1-391E、PB1-581G、PB1-661T、PB2-265S和NP-34G可赋予任何流感病毒株以温敏表型和减毒表型。同样，适于制备疫苗的新型温度敏感的减毒的B株也可以通过将MDV-B的突变引入到流感病毒B株内来制备。除了制备减毒活疫苗以外，将这些突变引入到供体病毒株内还可以用于制备安全的灭活疫苗。
实施例5制备MDV-B的8质粒系统冷适应流感病毒突变株B/Ann Arbor/1/66(ca/Master Ann Arbor/1/66 P1 Aviron10/2/97)是一种典型的B型流感病毒主供体株(MDV-B)，利用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从100μl感染该病毒的含胚胎的鸡蛋尿囊液中提取病毒RNA，提取的RNA溶解到40μl水中。利用一步RT-PCR试剂盒(One Step RT-PCR kit)(Qiagen，Valencia，CA)按照说明书RT-PCR扩增基因组节段，每个反应用1μl提取的RNA。RT反应在50℃进行50分钟，然后在94℃进行15分钟。PCR反应进行25个循环，每个循环包括94℃1分钟、54℃1分钟、72℃3分钟。利用含BsmB I位点的节段特异性引物扩增P基因，结果可得到两个片段(表12)。
表12.扩增流感病毒ca B/Ann Arbor/1/66的8个病毒RNA所用的RT-PCR引物
与流感病毒序列互补的序列用黑体字标出。5’-末端具有限制性内切酶BsmB I(Bm)或Bsa I(Ba)的识别序列。
质粒的克隆分离PCR片段，用BsmBI(NP用BsaI)消化，然后插入到上述pAD3000(pHW2000的衍生物，可转录反义vRNA和正义mRNA)的BsmBI位点内。每种质粒取2到4个克隆测序，根据直接测序的RT-PCR片段与MDV-B的共有序列比较。具有核苷酸改变从而导致与共有序列不一致的氨基酸改变的质粒通过质粒的克隆或利用Quikchange试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行修复。所得到的B/Ann Arbor/1/66质粒命名为pAB121-PB1、pAB122-PB2、pAB123-PA、pAB124-HA、pAB125NP、pAB126-NA、pAB127-M和、pAB128-NS。利用这个双向转录系统，所有的病毒RNA和蛋白都可以在细胞内制备，结果节得到了感染性的B型流感病毒(图4)。
值得注意的是，与共有序列相比较，pAB121-PB1和pAB124-HA含有2个沉默的核苷酸取代，pAB128-NS有1个沉默的核苷酸取代(表13)。这些核苷酸变化不产生氨基酸的改变，也不参与影响病毒的生长和回收。这些沉默的取代被保留有利于重组病毒的基因型分型。
表13.代表B/Ann Arbor/1/66(MDV-B)8个片段的质粒组
为了构建在PA、NP和M1基因上有核苷酸取代的质粒，以质粒pAB123-PA、pAB125-NP、pAB127-M为模板，利用Quikchange试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)突变核苷酸。另外，用含有期望的突变的引物通过PCR方法扩增两个片段，然后用BsmBI消化，然后通过3片段连接反应插入到pAD3000-BsmBI内。得到的质粒测序以确保cDNA不含不需要的突变。
利用含有AmpliTaq DNA聚合酶FS的Rhodamine或dRhodamine染色-终止子循环测序预备反应试剂盒(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc，Foster City，CA)测定模板DNA的序列。样品通过电泳分开，在PE/ABI 373型、373 Stretch型或377型DNA测序仪上分析。
在另一个试验中，扩增流感病毒株B/Yamanshi/166/98来源的病毒RNA，克隆到pAD3000中，方法与上面描述的相似，只是反应过程为25个循环，每个循环包括94℃30秒、54℃30秒、72℃3分钟。用同样的引物扩增B/Yamanashi/166/98病毒株的节段，只是扩增NP和NA节段的引物如下MDV-B 5′BsmBI-NPTATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG(SEQ ID NO75)；MDV-B3’BsmBI-NPATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC(SEQ ID NO76)；Bm-NAb-1TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA(SEQ IDNO77)；Bm-NAb-1557RATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT(SEQID NO78)。B/Yamanashi/166/98质粒被命名为pAB251-PB1、pAB252-PB2、pAB253-PA、pAB254-HA、pAB255-NP、pAB256-NA、pAB257-M和pAB258-NS。在PA中所鉴定出的3个沉默核苷酸差异有利于重组的和重排列的B/Yamanashi/166/98病毒的基因型分型。
实施例6感染性重组流感病毒B和重排列流感病毒的制备为了克服流感病毒在无辅助病毒的细胞培养系统内难以生长的困难，本发明提供了制备重组的和重排列的B株流感病毒的新型载体和方法。用于回收B型流感病毒的载体系统是以制备A型流感病毒的方法为基础开发分(Hoffmann等，(2000)“从8个质粒开始制备A型流感病毒的DNA转染系统”(A DNA transfection system forgeneration of influenza A virus from eight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA976108-6113；Hoffmann & Webster(2000)“从8个质粒开始制备A型流感病毒的单方向RNA聚合酶I-聚合酶II转录系统”(unidirectional RNA polymeraseI-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virusfrom eight plasmids)J Gen Virol 812843-7)。293T或COS-7细胞(具有高转染效率和pol I活性的灵长类细胞)与MDCK(允许流感病毒复制)细胞共培养，293T细胞用含5％FBS的OptiMEM I-AB培养基培养，COS-7细胞用含10％FBS的DMEM I-AB培养基培养。MDCK细胞用添加10％FBS、抗生素和antimycotic试剂的1×MEM培养。在用病毒基因组载体转染前，细胞用5ml PBS或不含FBS的培养基洗涤一次。10ml胰蛋白酶-EDTA加到75cm2培养瓶的汇合细胞上(MDCK细胞孵育20-45分钟，293T细胞孵育1分钟)。将细胞离心，然后重悬到10ml OptiMEM I-AB内。然后每种细胞悬液取1ml稀释到18ml OptiMEM I-AB中，混匀。细胞分别加到6孔板内，每孔3ml。6-24小时后，每种质粒取1μg加到含OptiMEM I-AB的1.5ml Eppendorf管内(xμl质粒+xμl OptiMEM I-AB+xμl TransIT-LT1＝200μl)；每μg质粒DNA用2 1 TransIT-LT1。混合物在室温下孵育45分钟。然后加入800μl OptiMEM I-AB。去掉培养基后将转染混合物加到细胞上(t＝0)，33℃孵育6-15小时。然后从细胞上缓慢去掉转染混合物，加入1ml OptiMEM I-AB，细胞在33℃孵育24小时。转染后48小时，将1ml含1μg/mlTPCK-胰蛋白酶的OptiMEM I-AB加到细胞上。转染后96小时，将1ml含1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的OptiMEM I-AB加到细胞上。
转染后4天到7天之间吸取1ml细胞培养物上清，通过HA试验或噬菌斑形成试验监测。简言之，将1ml上清加到离心管内，5000rpm离心5分钟。将900μl上清转移到新管中，进行系列稀释，加到MDCK细胞上，每孔500μl(如在12孔板内)。上清与细胞孵育1小时后去掉，用含1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的感染培养基(1×MEM)替换。然后进行HA分析或噬菌斑形成试验。例如，对于噬菌斑形成试验来说，上清在MDCK细胞上进行滴度测定，细胞在33℃用0.8％的琼脂糖覆盖3天。对于感染鸡蛋来说，感染细胞的上清在转染后6天或7天收获，将100μl用Opti-MEM I稀释的上清注射到含11天胚胎的鸡蛋内，33℃培养。接种后3天通过MDCK细胞的TCID50试验来确定病毒的滴度。
为了制备MDV-B，共培养的293T-MDCK或COS-7-MDCK细胞用1μg质粒感染。在感染后5-7天检测时，共培养的MDCK细胞出现细胞病变效应(CPE)，说明感染性的MDV-B病毒从克隆的cDNA中产生出来。转染7个质粒的细胞没有观察到CPE(表14)。为了确定DNA转染系统用于病毒制备的效率，转染7天后细胞上清用MDCK细胞测定滴度，病毒的滴度通过噬菌斑形成试验测定。共培养的293T-MDCK上清的滴度为5.0×106pfu/ml，COS7-MDCK细胞上清的滴度为7.6×106pfu/ml。
表14.利用8个质粒制备感染性B型流感病毒
瞬时共培养的293T-MDCK(1，2)或COS7-MDCK细胞(3，4)用7种或8种质粒转染。转染后7天监测共培养的MDCK细胞上的细胞病变效应(CPE)。在转染后7天将转染细胞的上清滴到MDCK细胞上。pfu/ml数据代表多次(如3次或4次)转染试验的平均值。
用B/Yamanashi/166/98质粒载体进行的转染试验得到了相似的结果。这些结果表明转染系统能够从8个质粒开始扩增制备B型流感病毒。
重组B型流感病毒的基因分型在MDCK细胞内经过连续传代以后，感染细胞的上清通过RT-PCR扩增以确定是否制备出了病毒。利用节段特异性引物RT-PCR扩增所有的8个节段(表12)。如图5A所示，所有节段都扩增出了PCR产物。直接测序PB1、HA和NS的PCR产物发现所分析的4个核苷酸与质粒pAB121-PB1、pAB124-HA和pAB128-NS上所见到的一致。这些结果证实了所得到的病毒是从所设计的质粒中制备的，排出了任何可能的亲本病毒的实验室污染(除了阴性对照之外)9图5B)。
同样，用B/Yamanashi/166/98质粒载体转染后回收病毒，扩增包含PA节段核苷酸1280-1290在内的区域。序列测定表明回收的病毒与质粒来源的重组病毒B/Yamanashi/166/98一致(图5C和5D)。
rMDV-B的表型分型MDV-B病毒具有两个特征性的表型温敏流感病毒(ts)和冷适应性(ca)。病毒在37℃时与33℃时相比差2log(或更高)被定义为具有温敏表型，病毒在25℃时与33℃时相比生长水平差异小于2log被定义为具有冷适应表型。原代鸡肾(PCK)细胞用亲本MDV-B病毒或质粒来源的病毒转染以确定病毒在3种温度下的生长情况。
用6孔板内汇合的MDCK细胞(ECACC)进行噬菌斑形成试验。病毒稀释液在33℃孵育30-60分钟。细胞用0.8％琼脂糖覆盖。感染的细胞在33℃或37℃孵育。感染后3天，细胞用0.1％结晶紫溶液染色，计数噬菌斑形成的数目。
通过病毒样品在25℃、33℃和37℃下进行TCID50滴定来分析温度敏感-冷适应表型。TCID50滴度的测定是通过检测流感病毒在不同的温度(25℃、33℃、37℃)下在96孔板内的原代鸡肾单层细胞内的细胞病变效应(CPE)来进行的。该分析结果不依赖噬菌斑的形态，噬菌斑的形态随温度和病毒株的不同而不同，该结果只依赖流感病毒复制的稳定性和和所引起的CPE效应。用胰酶消化原代组织，将原代鸡肾(PCK)细胞悬浮到含5％FCS的MEM(Earl’s)培养基中制成细胞悬液。将PCK细胞接种到96孔培养板中培养48小时以制备汇合率＞90％的单层细胞。48小时后，单层PCK细胞用无血清的含5Mm L-谷氨酰胺、抗生素、非必需氨基酸的MEM培养基(被称为表型分析培养基(PAM))洗涤1小时。然后将10倍系列稀释的病毒样品加到含PAM的96孔板内。每个稀释度的病毒样品设6个复孔用稀释的病毒感染。作为对照的未感染细胞每个样品也设6个复孔。每个样品取2-4个孔测定病毒的滴度。每个试验中都包括在25℃、33℃和37℃下具有预定滴度的表型对照病毒。为了确定病毒样品的温敏表型，培养板在5％CO2培养箱中分别在33℃和37度培养6天。为了确定冷适应表型特征，培养板在25℃孵育10天。用Karber方法计算病毒的滴度，用log10TCID50滴度平均值(n＝4)/ml+标准差表示。在图1-3中出现的病毒滴度的标准差在0.1到0.3之间。病毒在33℃和37℃时的滴度差异用于确定温敏表型，病毒在25℃和33℃时的滴度差异用于确定冷适应表型。
质粒来源的重组MDV-B(recMDV-B)病毒如预期的那样在细胞培养物中表达两个特征性表型—冷适应性和温敏流感病毒。病毒能在25℃时有效复制，也就是说用PCK细胞分析时病毒在25℃和在33℃的滴度差异低于或等于2log10即认为该病毒具有冷适应表型。亲本MDV-B和recMDV-B都具有冷适应表型；在25℃和33℃时的滴度差异分别为0.3和0.4log10(表15)。温敏表型也是通过测定不同温度下在PCK细胞内的滴度而确定的；但是，对于温敏表型来说，在37℃的滴度应该比33℃的滴度的2log10或更多。亲本MDV-B和recMDV-B在33℃和37℃时的滴度差异分别为3.4和3.7log10(表15)。因此，质粒来源的重组MDV-B表达冷适应表型和温敏表型。
表15.用质粒制备的MDV-B和rMDV-B的表型分析
原代鸡肾细胞用亲本MDV-B病毒和质粒来源的重组病毒(recMDV-B)感染。在3种不同的温度下测定病毒的滴度。
实施例7重排列病毒B/Yamanashi/166/98的制备扩增能代表主要B型流感病毒谱系的几个不同病毒株的HA和NA节段，然后按照上述方法克隆到pAD3000中。优化引物的组合以同时RT-PCR扩增HA和NA节段。通过比较代表节段4(HA)和节段6(NB/NA)非编码区的病毒RNA末端序列发现B型流感病毒的HA和NA基因之间5’末端的20核苷酸和3’末端的15个核苷酸是一致的。RT-PCR所用的引物对为(下划线部分是B型流感病毒特异性的)Bm-NAb-1TAT TCGTCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA(SEQ ID NO79)；Bm-NAb-1557RATA TCG TCT CGTATTAGT AGT AAC AAG AGC ATT TT(SEQ ID NO80)，这对引物用于同时扩增各种流感病毒B株的HA和NA基因(图8)。分离B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001和B/Hong Kong/330/2001的HA和NA PCR节段，用BsmBI消化后插入到pAD3000内。结果表明利用这些引物可有效扩增含几种不同野生型病毒来源的流感病毒B HA和NA基因的质粒，这几种野生型病毒代表了B型流感病毒的主要谱系。RT-PCR产物用于测序和/或克隆到表达质粒内。
为了证明利用B/Yamanashi/166/98(一种B/Yamagata/16/88样病毒)能有效表达各种B型流感病毒谱系来源的抗原，制备含B/Yamanashi/166/98的PB1、PB2、PA、NP、M、NS和代表Victoria及Yamagata谱系的HA和NA的重排列病毒(6+2重排列病毒)。按照上述方法，用代表B/Yamanashi/166/98的6个质粒和含B/Victoria/2/87谱系的两个病毒株B/Hong Kong/330/2001和B/Hawaii/10/2001，以及B/Yamagata/16/88谱系的一个病毒株B/Victoria/504/2000的HA和NA节段cDNA的质粒转染瞬时共培养的COS7-MDCK细胞。转染后6到7天在新鲜的MDCK细胞上滴定上清液。所有6+2重排列病毒的滴度都在4-9×106pfu/ml之间(表16)。这些数据说明B/Yamanashi/166/98的6个内部基因与两种B型流感病毒株的HA和NA基因能有效形成感染性病毒。
转染后6或7天滴定COS7-MDCK细胞的上清液，利用MDCK细胞进行噬菌斑形成试验来确定病毒的滴度。
表16用于制备B/Yamanashi/166/98和6+2重排列病毒的质粒
野生型B/Yamanashi/166/98在鸡蛋内复制可得到相对较高的滴度。利用试验来确定这种特性是否是该病毒6个“内部”基因的固有表型。为了评价这种特性，将在鸡蛋内只能中等程度复制的野生型B/Victoria/504/2000的产量与表达B/Victoria/504/2000HA和NA的6+2重排列病毒的产量做了比较。除了野生型和重组的B/Yamanashi/166/98以外，所有这些病毒都接种到含3天或4天胚胎的鸡蛋内，接种量为100或1000pfu。感染后3天，从鸡蛋内收获尿囊液，用MDCK细胞测定TCID50滴度。结果发现6+2重排列病毒在尿囊液中的量与野生型的或重组的B/Yamanashi/166/98病毒株相似(图9)。B/Victoria/504/2000和6+2重组病毒的滴度差异约为1.6log10TCID50(0.7-2.5log10TCID50/ml，95％CI)。通过3个不同的试验证明B/Victoria/504/2000和6+2重组病毒之间存在显著性差异(P＜0.001)。这些结果证明在鸡蛋内很难复制的病毒株正常表达的HA和NA可以使B/Yamanashi/166/98在鸡蛋内生长。
实施例8ca B/Ann Arbor//1/66的冷适应表型的分子基础MDV-B病毒(ca B/Ann Arbor/1/66)在人体内的毒性是减弱的，在雪貂内也具有减毒表型，在细胞培养物内具有冷适应表型和温敏表型。利用BLAST搜索算法比较MDV-B内部基因所推算出的氨基酸序列与Los Alamos流感病毒数据库(网址flu.lanl.gov)的序列。鉴定出8个MDV-B所独有的不存在于任何其他病毒株中的氨基酸(表17)。编码PB1、BM2、NS1和NS2的基因组节段没有独特的取代残基。PA和M1蛋白有2个、NP蛋白有4个独特的取代的氨基酸(表17)。在PB2 630位置上发现有一个取代的氨基酸(另一个病毒株B/Harbin/7/94(AF170572)在630位置上也有一个精氨酸残基)。
这些结果说明基因节段PB2、PA、NP和M1可能参与MDV-B减毒表型的形成。在一个与上述MDV-A相似的方式中，8质粒系统用于制备重组和重组分类病毒(单基因和/或双基因重排列病毒，即7:1或6:2重排列病毒)，制备方法是以不依赖辅助病毒的方式将相关的质粒按照上述MDV-A相似的方式共转染到培养的细胞内。例如，B/Lee/40来源的6个内部基因与MDV-B来源的HA和NA片段一起转染以制备6+2重排列病毒。
表17.B/Ann Arbor/1/66的独特取代的氨基酸
8个ca B/Ann Arbor蛋白的推算出的氨基酸序列用于BLAST搜索。MDV-B和排列序列之间不相同的氨基酸在表中列出。密码子上有下划线的核苷酸代表被取代的位置。
为了确定这8个独特的氨基酸差异对MDV-B的表型特征是否存在影响，构建出了一个重组病毒，其中所有8个核苷酸位置编码反应野生型流感病毒基因背景互补的氨基酸。一组质粒被构建出来，其中PA、NP和M1基因上的8个残基通过位点特异性突变加以改变使其编码野生型的氨基酸(如表17所示)。具有所有8个核苷酸改变的重组病毒被命名为rec53-MDV-B，是通过构建的质粒共转染COS7-MDCK细胞共培养物而获得的，细胞在33℃培养以确保在转染后7天能在上清液中得到高滴度的病毒。转染细胞的上清液利用噬菌斑形成试验在MDCK细胞和PCK细胞内滴定，测定其在33℃和37℃时的滴度。
如图13所示，在两个不同的独立试验中，recMDV-B在MDCK细胞和PCK细胞内都能表达温敏表型。三基因重排列病毒rec53-MDV-B含有决定非温敏表型的所有8个氨基酸改变，其在PCK细胞内33℃和37℃的滴度差异只有0.7log10。这个滴度低于定义温敏表型所需要的2log10的差异，也比recMDV-B所观察到的3log10的差异要小的多。这些结果说明PA、NP和M1内的8个氨基酸改变足以产生携带同源和异源糖蛋白的非温敏流感病毒野生型样病毒。
随后研究了每个基因节段对温敏表型的贡献。利用DNA共转染技术制备在野生型氨基酸补体中具有PA、NP或M基因节段的质粒来源的重组病毒。在MDCK细胞和PCK细胞内37℃时所有单基因重组病毒的生长都受到限制(图14)，说明单个基因节段的改变不能反转温敏表型。另外，携带NP和M或PA和M基因节段的重组病毒也保留着温敏表型。而含有PA和NP基因节段的重组病毒在37℃和33℃时的滴度差异低于或等于2.0log10，与rec53-MDV-B相似。这些结果说明NP和PA基因是影响温敏表型的主要基因。
为了确定NP蛋白上的4个氨基酸和PA蛋白上的2个氨基酸是否都对非温敏表型产生影响，制备出了具有NP和PA基因突变的三基因和双基因重组病毒(图15)。两种氨基酸取代，A114→V114和H410→P410产生非温敏表型。在核蛋白中具有单氨基酸取代H410→P410的病毒在MDCK细胞和PCK细胞内具有非温敏表型。另一方面，单氨基酸取代A55→T55的病毒具有温敏表型。这些结果说明NP上的P410参与病毒在37℃时的有效生长。这些结果表明PA和NP的6个氨基酸中有4个残基对非温敏表型起作用。
根据以前的试验结果，温敏表型和减毒表型是高度相关的。以前的研究证实在感染ca B/Ann Arbor/1/66的雪貂的肺组织内检测不到病毒，而鼻内感染后在肺组织内可检测到非减毒的B型流感病毒。为了确定完全相同的突变是否是温敏表型和减毒表型的基础，进行了下面的试验。
转染后获得的重组病毒在含胚胎的鸡蛋内传代以制备病毒原种。9周龄的雪貂鼻内接种病毒，每个鼻孔0.5ml，滴度为5.5、6.0或7.0log10pfu/ml。感染3天后处死雪貂，如上所述检测非组织和鼻甲。
雪貂(每组4只动物)鼻内感染recMDV-B或rec53-MDV-B。感染病毒后3天取其鼻甲和肺组织，检测是否存在病毒。在感染7.0log10pfu rec MDV-B的雪貂肺组织内检测不到病毒。感染7.0log10pfu rec53-MDV-B的4只动物中有3只动物可在肺组织内检测到病毒(该组中的一只动物检测不到的原因不清楚)。感染低剂量(5.5log10pfu)rec53-MDV-B的4只雪貂中有2只在肺组织内分离出了病毒。因此，PA、NP和M1蛋白上8个独特氨基酸的改变足以使减毒表型转变成非减毒表型。
由于细胞培养试验的结果表明对温敏表型起主要作用，因此在第二个试验中雪貂用6log pfu的rec53-MDV-B(PA、NP、M)、rec62-MDV-B(PA)、NP rec71-MDV-B(NP)感染。感染rec53-MDV-B的4只动物中有2只在肺内检测到病毒。感染单基因和双基因重排列病毒的雪貂在肺组织内都没有检测到病毒。因此，除了PA和NP蛋白上的氨基酸以外，M1蛋白对于减毒表型也很重要。具有野生型PA和NP的病毒在雪貂肺内不能复制，说明参与减毒表型的一组突变对温敏表型也有影响。
因此，B/Ann Arbor/1/66的温敏表型最多是由3个基因决定的。将PA、NP和M1蛋白上的8个氨基酸改变成野生型残基可使重组病毒在37℃时具有复制能力。同样，含有MDV-B的6个内部基因和B/Hong Kong/330/01的HA和NA节段的6+2重组病毒具有温敏表型，而三基因重组病毒是非温敏流感病毒。
与上面有关A型流感病毒株的描述一样，上述残基的替换，如PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)赋予病毒以温敏表型和减毒表型。相应的，具有一个或多个这种取代的氨基酸的人工改造的B型流感病毒株具有温敏表型和减毒表型，适于作为主供体病毒制备流感病毒减毒活疫苗。
实施例9通过电穿孔转导Vero细胞从8质粒系统制备流感病毒以前已有报道证明可从Vero细胞内恢复重组的A型流感病毒(Fodor等，(1999)“利用重组DNA恢复A型流感病毒”(Rescue of influenza A virus from recombinantDNA).J.Virol.739679-82；Hoffmann等，(2002)“快速制备流感病毒疫苗的8质粒系统”(Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virusvaccine)Vaccine 203165-3170)。报道的方法需要脂质体试剂，并且只报道了一株具有高效复制能力的A型流感病毒实验室株(A/WSN/33和A/PR/8/34)，因此其在制备适于疫苗制备的减毒活病毒的应用中受到限制。本发明提供了利用电穿孔技术从Vero细胞恢复重组流感病毒的新型方法。这些方法适于制备A型和B型流感病毒株，可用于从Vero细胞内恢复冷适应、温度敏感的减毒病毒，其中Vero细胞在无血清培养基中生长以便于制备出适于鼻内使用的减毒活疫苗，即鼻内疫苗制剂。除了能用于不同的病毒株以外，电穿孔技术除了需要用于细胞生长的培养基外不需要添加其他的试剂，因此降低了污染的风险。该方法在用无血清培养的Vero细胞制备重组和重排列病毒时特别有效，如无病原体适于疫苗制备的Vero细胞。这个特点使电穿孔技术成为将DNA导入细胞底物内的适宜商业方法。
电穿孔技术与其他各种将DNA导入Vero细胞的方法作了比较，其中包括利用脂质体试剂转染、钙磷酸盐沉淀法以及细胞微注射法。尽管利用脂质体试剂恢复A型流感病毒有时可获得成功，但是只有电穿孔技术可以从Vero细胞内恢复B型流感病毒和A型流感病毒。
在电穿孔前1天，分散达到90-100％汇合的Vero细胞，以每个T225培养瓶9×106细胞的密度接种，培养基为添加青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的MEM(MEM，10％FBS)。在第二天，细胞用胰酶消化，重悬到含50ml磷酸盐缓冲液(PBS)的T225培养瓶中。然后将细胞离心并重新悬浮到含0.5ml OptiMEM I的T225培养瓶中。另外，订购的含非人或动物来源组分的OptiMEM培养基也可以使用。细胞进行1∶40稀释，在血细胞计数器上计数，确定细胞的密度，5×106细胞加入到0.4cm的电穿孔杯内，终体积为0.4ml OptiMEM I。由8种含MDV-A或MDV-B基因组的质粒等摩尔混合的20μg DNA体积不超过25μl，然后加到含细胞的杯内。通过轻叩温和混匀，在BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plusconnected(BioRad，Hercules，CA)上进行电穿孔，参数为300伏、950微法，持续时间28-33秒。
通过温和敲打再混合细胞，电穿孔后约1-2分钟将0.7ml含10％FBS的MEM用1ml移液管加入到小杯内。细胞用移液管上下吹打数次温和混合，然后将细胞转移到标准6孔组织培养板的2个孔内，孔内含2ml MEM+10％FBS。用1ml MEM+10％FBS洗涤小杯，洗涤悬液分到两孔内，终体积约为每孔3.5ml。
在另一个试验中，能在无血清培养基，即OptiPro(SFM)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长的Vero细胞按照上述方法进行电穿孔，区别在于上述方法是在OptiMEM I中进行，细胞用OptiPro(SFM)稀释，该培养基就是培养细胞用于恢复病毒的培养基。
电穿孔的细胞在适于作为冷适应主供体病毒株被导入的病毒复制和恢复的条件下培养，如33℃。在第二天(即电穿孔后约19小时)，去掉培养基，细胞用OptiMEM或OptiPro(SFM)洗涤，每孔3ml。然后每孔中加入1ml含青霉素/链霉素的OptiMEM I或OptiPro(SFM)，通过每天替换培养基来收集上清液。上清液储存在-80℃的SPG中。病毒的制备一般在电穿孔后2到3天达到最高峰。
表18通过不同的转染方法在不同类型的细胞内用8个质粒恢复MDV病毒株的结果
实施例10用于基因转移的流感病毒载体系统本发明的载体也可作为基因转移系统用于基因治疗。在这种用途中，需要制备表达外援蛋白的重组流感病毒，如A型重组流感病毒或B型重组流感病毒。例如，由于B型流感病毒的7个节段不是彼此连接的，因此很容易插入插入异源核酸序列。mRNA含有两个顺反子，具有编码M1和BM2蛋白的两个开放阅读框架。BM2或M1的开放阅读框架可被异源目的序列所替换，如编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因。利用本发明的质粒载体系统，将编码M1-EGFP和BM2开发阅读框架的cDNA克隆到两个不同的质粒中。开放阅读框架两侧为节段7的非编码区，该区含有复制和转录所需要的信号。另外，还可以构建如下两个质粒一个含M1的ORF，另一个含EGFP-BM2。将得到的9个质粒共转染可制备出含异源基因序列的B型重组流感病毒。同样，EGFP可从流感病毒A的NS1节段表达。
典型的“绿色”流感病毒B可用于标准化的病毒分析，如微中和试验。质粒技术和蛋白表达的简单检测相结合(EGFP发出的荧光可用显微镜观察，如图2所示)可优化蛋白的表达。
为了能清楚地理解本发明，在前面对本发明的某些细节进行了描述，但是本领域的技术人员通过阅读本说明书，可以在不偏离本发明的真实范围的情况下对本发明的形式和细节作出各种修改。例如，上面所描述的所有技术和装置都可以以各种组合的方式应用。本申请所引用的所有出版物、专利、专利申请或其他文献都已完整纳入本文作为参考，其目的与出版物、专利、专利申请或其他文献被单个纳入作为参考的目的是一样的。
权利要求
1.一种在细胞培养物中制备流感病毒的方法，所述方法包括i)将一组含流感病毒基因组的载体导入到一群宿主细胞内，该宿主细胞群能够支持流感病毒的复制；ii)在低于或等于35℃的温度下培养该群宿主细胞；以及iii)回收一组流感病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒含有至少一种减毒的流感病毒，冷适应流感病毒和温敏流感病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒具有下列一种或多种表型特征减毒特性，温度敏感性及冷适应性。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒适于以鼻内疫苗制剂的形式使用。
5.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入至少含下列之一的一群载体a)含有至少一个取代的氨基酸的流感病毒A/Ann Arbor/6/60或人工改造的A型流感病毒，该取代的氨基酸可影响A/Ann Arbor/6/60的生物学特性；以及b)含有至少一个取代的氨基酸的流感病毒B/Ann Arbor/1/66或人工改造的B型流感病毒，该取代的氨基酸可影响B/Ann Arbor/1/66的生物学特性。
6.如权利要求5所述的方法，所述方法包括导入至少含下列之一的一群载体a)含有至少一个取代的氨基酸的人工改造的A型流感病毒，所述取代的氨基酸与流感病毒A/Ann Arbor/6/60的独特氨基酸一致；以及b)含有至少一个取代的氨基酸的人工改造的B型流感病毒，其中的取代的氨基酸与流感病毒B/Ann Arbor/1/66的独特氨基酸一致。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述流感病毒含有至少一个a)至少含有下列取代的氨基酸之一的A型流感病毒株PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及b)至少含有下列取代的氨基酸之一的B型流感病毒株PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述流感病毒含有至少一个a)至少含有下列取代的氨基酸之一的A型流感病毒株PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；以及b)至少含有下列取代的氨基酸之一的B型流感病毒株PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述流感病毒含有一组取代的氨基酸。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述一组取代的氨基酸包含2、3、4、5、6、7、8或9个取代的氨基酸。
11.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组含B型流感病毒的载体。
12.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组含A型流感病毒的载体。
13.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组含下列基因组节段的载体(a)第一流感病毒株的至少6个内部基因组节段；以及(b)至少一个编码第二流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因组节段。
14.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组含下列基因组节段的载体(a)第一流感病毒株的至少6个内部基因组节段，该病毒株是减毒的、冷适应的和/或温度敏感的；以及(b)至少一个编码第二流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因组节段。
15.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组含下列基因组节段的载体(a)第一流感病毒株的至少6个内部基因组节段，该病毒株是减毒的、冷适应的和温度敏感的；以及(b)至少一个编码第二流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因组节段。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组含下列基因组节段的载体(a)流感病毒株B/Ann Arbor/1/66、A/Ann Arbor/6/60或包含至少一个取代的氨基酸的人工改造的流感病毒的至少6个内部基因组节段，该取代的氨基酸与流感病毒B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60的独特氨基酸一致；以及(b)至少一个编码不同流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因组节段。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法包括导入一组含下列基因组节段的载体(a)流感病毒株B/Ann Arbor/1/66、A/Ann Arbor/6/60或包含至少一个取代的氨基酸的人工改造的流感病毒的6个内部基因组节段，该取代的氨基酸与流感病毒B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60的独特氨基酸一致；以及(b)编码B/AnnArbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60之外的流感病毒株HA和NA抗原的两个基因组节段。
18.如权利要求16所述的方法，所述方法包括导入一组含下列基因组节段的载体(a)流感病毒株B/Ann Arbor/1/66、A/Ann Arbor/6/60或包含至少一个取代的氨基酸的人工改造的流感病毒的7个内部基因组节段，该取代的氨基酸与流感病毒B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60的独特氨基酸一致；或(b)编码B/AnnArbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60之外的流感病毒株HA抗原或NA抗原的基因组节段。
19.如权利要求1所述的方法，所述方法包括导入一组质粒载体。
20.如权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞群包含Vero细胞、Per.C6细胞、MDCK细胞、293T细胞或COS细胞中的一种或多种。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述细胞群包含由MDCK细胞、293T细胞和COS细胞中至少两种所组成的混合物。
22.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在约32℃到35℃之间的温度下培养宿主细胞群。
23.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在约32℃到34℃之间的温度下培养宿主细胞群。
24.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在约33℃培养宿主细胞群。
25.如权利要求1所述的方法，所述方法包括回收重组流感病毒。
26.如权利要求1所述的方法，所述方法包括回收重排列流感病毒。
27.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括灭活流感病毒。
28.用权利要求1所述方法制备的流感病毒。
29.一种在细胞培养物中制备B型流感病毒的方法，所述方法包括i)将一组含B型流感病毒基因组的载体导入到一群宿主细胞内，该宿主细胞群能够支持流感病毒的复制；ii)在允许病毒复制的条件下培养该群宿主细胞；以及iii)回收一组B型流感病毒。
30.如权利要求29所述的方法，所述方法包括在细胞培养物中制备B型流感病毒的无辅助病毒方法，该方法为在无辅助病毒存在的条件下将一组含B型流感病毒基因组的载体导入到一群宿主细胞内。
31.如权利要求29所述的方法，所述方法包括在低于或等于35℃的温度下培养宿主细胞群。
32.如权利要求29所述的方法，所述方法包括在32℃到35℃之间的温度下培养宿主细胞群。
33.如权利要求29所述的方法，所述方法包括在32℃到34℃之间的温度下培养宿主细胞群。
34.如权利要求29所述的方法，所述方法包括在约33℃培养宿主细胞群。
35.如权利要求29所述的方法，所述方法包括回收重组流感病毒。
36.如权利要求29所述的方法，所述方法包括回收重排列流感病毒。
37.用权利要求29所述方法制备的流感病毒。
38.在细胞培养物内制备流感病毒的方法，所述方法包括i)通过电穿孔将一组含流感病毒基因组的载体导入一群Vero细胞；ii)在允许病毒复制的条件下培养Vero细胞群；以及iii)回收流感病毒群。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述流感病毒具有下列一种或多种表型特征减毒特性，温度敏感性及冷适应性。
40.如权利要求38所述的方法，其中，所述流感病毒包括减毒的、冷适应的、温度敏感的流感病毒。
41.如权利要求38所述的方法，其中，所述流感病毒适于以鼻内疫苗制剂的形式使用。
42.如权利要求38所述的方法，所述方法包括导入一组含B型流感病毒的载体。
43.如权利要求38所述的方法，所述方法包括导入一组含A型流感病毒的载体。
44.如权利要求38所述的方法，所述方法包括在低于或等于35℃的温度下培养宿主细胞群。
45.如权利要求38所述的方法，所述方法包括在无血清培养基中培养Vero细胞。
46.一种制备重组流感病毒疫苗的方法，所述方法包括i)将一组含流感病毒基因组的载体导入到一群宿主细胞内，该宿主细胞群能够支持流感病毒的复制；ii)在低于或等于35℃的温度下培养宿主细胞；以及iii)回收在给予受试者后能激发免疫反应的流感病毒。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述流感病毒至少具有下列一种表型特征温度敏感性、冷适应性及减毒特性。
48.如权利要求46所述的方法，所述方法包括导入一组含B型流感病毒的载体。
49.如权利要求46所述的方法，所述方法包括导入一组含A型流感病毒的载体。
50.如权利要求46所述的方法，所述重组流感病毒疫苗含有重排列流感病毒。
51.如权利要求46所述的方法，其中，所述流感病毒疫苗包含流感病毒减毒活疫苗。
52.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括灭活流感病毒。
53.用权利要求46所述方法制备的流感病毒疫苗。
54.一种双向表达载体，该载体含有携带第一启动子的质粒，其中第一启动子位于第二启动子和双向多聚腺苷酸位点之间。
55.如权利要求54所述的载体，其中，所述第一和第二启动子方向相反，位于至少一个克隆位点两侧。
56.如权利要求54所述的载体，其中，所述双向多聚腺苷酸位点包括SV40多聚腺苷酸位点。
57.如权利要求54所述的载体，包括pAD3000。
58.如权利要求54所述的载体，该载体还含有一个双链核酸，该核酸包含至少一个插入到克隆位点内的流感病毒基因组节段。
59.如权利要求1所述的载体，其中，所述第一启动子和第二启动子可操作连接到同一双链病毒核酸的两条链上，该病毒核酸含有流感病毒基因组节段。
60.如权利要求54所述的双向表达载体，该载体包含携带位于第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子的质粒，其中，所述第一和第二启动子方向相反，位于至少一个流感病毒基因组节段两侧。
61.一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求54所述的一种或多种表达载体，以及一种或多种下列组分细胞、缓冲液、细胞培养基、说明书、包装材料和容器。
62.如权利要求61所述的试剂盒，所述试剂盒包含一组表达载体，其中每个表达载体含有至少一个流感病毒基因组节段。
63.如权利要求62所述的试剂盒，所述试剂盒包含携带第一流感病毒株至少6个内部基因组节段的一组表达载体，所述流感病毒株至少具有下列一种表型特征温度敏感性、冷适应性及减毒特性。
64.如权利要求62所述的试剂盒，其中，所述表达载体含有编码突变的HA和/或NA抗原的核酸文库。
65.一种组合物，所述组合物包括含有至少一种细胞的能在低于或等于35℃的温度下增殖性生长的细胞培养物，其中至少有一种细胞含有一组载体，该组载体含有流感病毒基因组。
66.如权利要求65所述的组合物，该组合物还含有细胞培养基。
67.如权利要求65所述的组合物，其中，该组载体包括双向表达载体。
68.如权利要求67所述的组合物，所述双向表达载体携带位于第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子的质粒；其中，所述第一和第二启动子方向相反，位于至少一个流感病毒节段两侧。
69.一种细胞培养系统，该系统包括含有至少一种细胞的增殖性生长的细胞培养物，其中至少有一种细胞含有一组载体，该组载体含有流感病毒基因组；以及能在低于或等于35℃的温度下培养细胞培养物的调节剂。
70.如权利要求69所述的细胞培养系统，该系统还包括细胞培养基。
71.如权利要求69所述的细胞培养系统，其中，这组载体包括双向表达载体。
72.如权利要求69所述的细胞培养系统，所述双向表达载体携带位于第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子的质粒；其中第一和第二启动子方向相反，位于至少一个流感病毒基因组节段两侧。
73.人工改造的重组或重排列流感病毒，该病毒包含在选自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上有一个或多个氨基酸取代的A型流感病毒株；或在选自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的位置上有一个或多个氨基酸取代的B型流感病毒株。
74.如权利要求73所述的流感病毒，其中，所述A型流感病毒含有一个或多个选自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的氨基酸取代；或其中所述B型流感病毒含有一个或多个选自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的氨基酸取代。
75.如权利要求73所述的A型流感病毒，该病毒包含一组选自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的氨基酸取代。
76.如权利要求73所述的A型流感病毒，该病毒包含一组由PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)构成的氨基酸取代。
77.如权利要求73所述的B型流感病毒，该病毒包含一组选自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的氨基酸取代。
78.如权利要求73所述的B型流感病毒，该病毒包含一组由PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)构成的氨基酸取代。
79.如权利要求73所述的A型流感病毒，该病毒包含A型流感病毒株PR8。
80.如权利要求73所述的流感病毒，其中，所述流感病毒具有下列一种或多种表型特征温度敏感性、冷适应性及减毒特性。
81.如权利要求73所述的流感病毒，该病毒还含有至少一种其他非野生型氨基酸。
82.如权利要求73所述的流感病毒，其中，所述流感病毒在雪貂减毒试验中复制至少下降3.0个log50。
83.如权利要求73所述的流感病毒，其中，所述流感病毒在雪貂减毒试验中无法检测到其复制。
84.一种制备温敏(ts)流感病毒的方法，所述方法包括(a)在A型流感病毒基因组中引入至少一个能在选自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上导致氨基酸取代的突变，或在B型流感病毒基因组中引入至少一个能在选自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的位置上导致氨基酸取代的突变；以及(b)在能制造病毒的条件下复制突变的流感病毒基因组。
85.如权利要求84所述的方法，其中，所述A型流感病毒基因组包含PR8基因组。
86.如权利要求84所述的方法，所述方法包括引入至少一个编码下列取代的氨基酸的突变到A型流感病毒基因组中PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；或者引入至少一个编码下列取代的氨基酸的突变到B型流感病毒基因组中PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
87.如权利要求84所述的方法，所述方法包括引入一组编码下列取代的氨基酸的突变到A型流感病毒基因组中PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；或者引入一组编码下列取代的氨基酸的突变到B型流感病毒基因组中PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
88.如权利要求84所述的方法，所述方法包括引入能导致下列一组氨基酸取代的突变到A型流感病毒基因组中PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；或者引入能导致下列一组氨基酸取代的突变到B型流感病毒基因组中PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
89.如权利要求84所述的方法，所述方法包括在鸡蛋内复制突变的流感病毒基因组。
90.如权利要求84所述的方法，所述方法包括在细胞培养物内复制突变的A型流感病毒基因组。
91.如权利要求90所述的方法，该方法还包括在鸡蛋内扩增病毒。
92.如权利要求90所述的方法，所述方法包括在低于或等于35℃的温度下培养细胞。
93.如权利要求90所述的方法，其中，所述细胞培养物含有Vero细胞、MDCK细胞、293T细胞和COS细胞中的一种或多种。
94.一种制备流感病毒减毒活疫苗的方法，所述方法包括(a)引入至少一个能导致下列氨基酸取代的突变到A型流感病毒基因组中PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；或者引入至少一个能导致下列氨基酸取代的突变到B型流感病毒基因组中PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183；(b)在能制造病毒的条件下复制突变的流感病毒基因组；以及(c)回收流感病毒。
95.如权利要求94所述的方法，其中，所述流感病毒含有编码至少来源于第二病毒株的HA和NA抗原的基因组节段。
96.如权利要求95所述的方法，其中，所述HA和NA抗原能激发抗至少一种流感病毒株的保护性免疫反应。
97.一种人工改造的重组或重排列的温敏(ts)A型流感病毒，该病毒含有至少一个选自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的引入的氨基酸取代。
98.如权利要求97所述的温敏A型流感病毒，该病毒含有至少一个选自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的引入的氨基酸取代。
99.如权利要求97所述的温敏A型流感病毒，该病毒含有一组选自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的引入的氨基酸取代。
100.如权利要求97所述的温敏A型流感病毒，该病毒含有一组由PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D346)构成的引入的氨基酸取代。
101.如权利要求97所述的温敏A型流感病毒，其中，所述温敏A型流感病毒与野生型A型流感病毒相比在39℃时其生长下降约在2.0到5.0log10之间。
102.如权利要求101所述的温敏A型流感病毒，其中，所述温敏A型流感病毒与野生型A型流感病毒相比在39℃时其生长分别下降至少约2.0log10，至少约3.0log10，至少约4.0log10以及至少约4.5log10。
103.如权利要求97所述的温敏A型流感病毒，其中，所述A型流感病毒与野生型A型流感病毒相比在雪貂减毒试验中其生长下降约在2.0到5.0log10之间。
104.如权利要求103所述的温敏A型流感病毒，其中，所述A型流感病毒在雪貂减毒试验中其生长分别下降至少约2.0log10，至少约3.0log10以及至少约4.0log10。
105.如权利要求97所述的重排列的温敏A型流感病毒，该病毒含有一个或多个编码至少一个来源于第二A型流感病毒株的HA或NA抗原的基因组节段。
106.一种重组或重排列的A型流感病毒疫苗，该疫苗含有包含一组选自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的引入的氨基酸取代的A型流感病毒或A型流感病毒蛋白。
107.一种重组或分离的核酸，其含有编码A型流感病毒多肽的多核苷酸序列，所述A型流感病毒多肽在选自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上有一个或多个引入的氨基酸取代。
108.一种重组或分离的A型流感病毒多肽，其在选自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上包含一个或多个氨基酸取代。
109.一种人工改造的重组或重排列的温敏(ts)B型流感病毒，该病毒含有至少一个选自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
110.如权利要求109所述的温敏B型流感病毒，该病毒含有至少一个选自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
111.如权利要求109所述的温敏B型流感病毒，该病毒含有一组选自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
112.如权利要求109所述的温敏B型流感病毒，该病毒含有一组由PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)构成的引入的氨基酸取代。
113.如权利要求109所述的温敏B型流感病毒，其中，所述温敏A型流感病毒与野生型B型流感病毒相比在39℃时其生长下降约在2.0到5.0log10之间。
114.如权利要求113所述的温敏B型流感病毒，其中，所述温敏B型流感病毒在39℃时其生长分别下降至少约2.0log10，至少约3.0log10，至少约4.0log10以及至少约4.5log10。
115.如权利要求109所述的温敏B型流感病毒，其中，所述B型流感病毒与野生型B型流感病毒相比在雪貂减毒试验中其生长下降约在2.0到5.0log10之间。
116.如权利要求117所述的温敏B型流感病毒，其中，所述B型流感病毒在雪貂减毒试验中其生长分别下降至少约2.0log10，至少约3.0log10以及至少约4.0log10。
117.如权利要求109所述的重排列的温敏B型流感病毒，该病毒含有一个或多个编码至少一个来源于第二B型流感病毒株的HA或NA抗原的基因组节段。
118.一种重组或重排列的B型流感病毒疫苗，该疫苗含有包含一组选自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的引入的氨基酸取代的B型流感病毒或B型流感病毒蛋白。
119.一种重组或分离的核酸，其含有编码B型流感病毒多肽的多核苷酸序列，所述B型流感病毒多肽在选自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的位置上含有一个或多个引入的氨基酸取代。
120.一种重组或分离的B型流感病毒多肽，其含有一个或多个选自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的引入的氨基酸取代。
全文摘要
本发明涉及在细胞培养物中生产适于重组流感病毒疫苗制备的流感病毒的载体和方法。本发明还涉及用在多质粒流感病毒表达系统中的双向表达载体。
文档编号A61K39/145GK1678345SQ03815195
公开日2005年10月5日 申请日期2003年4月25日 优先权日2002年4月26日
发明者E·霍夫曼, H·金, B·卢, G·杜克, G·W·坎宝 申请人:米迪缪尼疫苗股份有限公司