制备流感病毒的多质粒系统的制作方法

制备流感病毒的多质粒系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在细胞培养物中生产适于重组流感病毒疫苗制备的流感病毒的载体和方法。本发明还涉及用在多质粒流感病毒表达系统中的双向表达载体。
【专利说明】制备流感病毒的多质粒系统
[0001]本申请是2003.04.25提交的CN03815195.2，题为“制备流感病毒的多质粒系统”
的分案申请。
[0002]交叉参照相关申请
[0003]本申请要求下列申请的优先权和利益:2002年4月26日提交的美国临时申请60/375，675 号；2002 年 7 月 9 日提交的 60/394，983 号；200 年 9 月 12 日提交的 60/410，576号；2002年10月18日提交的60/419,802号；2002年10月23日提交的60/420，708号；2003年3月24日提交的60/457，699号(代理人备案号26-000250US)；以及2003年4月10日提交的题为“制备流感病毒的多质粒系统”申请，其代理人备案号是26-000260US，每个申请的说明书都已完整纳入本文作为参考。
[0004]发明背景
[0005]流感病毒由含分节的单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核及外面的脂蛋白包膜组成，其中脂蛋白包膜由基质蛋白连在一起。A型流感病毒和B型流感病毒都含有8节段的负极性单链RNA。A型流感病毒基因组至少编码11个多肽。节段1-3编码3个多肽，组成病毒RNA依赖的RNA聚合酶。节段I编码聚合酶复合物蛋白PB2。另外的聚合酶蛋白PBl和PA分别由节段2和节段3编码。另外，某些A型流感病毒株的节段I还编码一个小蛋白PB1-F2，是由PBl编码区内的另一个阅读框架产生的。节段4编码血凝素(HA)表面糖蛋白，参与细胞粘附以及使病毒在感染期内进入细胞。节段5编码核壳体核蛋白(NP)多肽，这是一种与病毒RNA相连的主 要结构蛋白。节段6编码神经酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。节段7编码两种基质蛋白，被称为Ml和M2，是由经不同方式剪接的mRNA翻译的。节段8编码NSl和NS2 (NEP)，这是两种非结构蛋白，由经其他方式剪接的mRNA翻译的。
[0006]B型流感病毒的8个基因组节段编码11种蛋白。三个最大的基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。节段4编码HA蛋白。节段5编码NP。节段6编码NA蛋白和NB蛋白。NB和NA蛋白都是由双顺反子mRNA的重叠阅读框架翻译的。B型流感病毒的节段7也编码两种蛋白:M1和BM2。最小的节段编码两种产物:NS1是由全长RNA翻译的，NS2是由剪接的mRNA变体翻译的。
[0007]制备出能产生特异性抗流感病毒保护性免疫反应的疫苗已经超过50年。这些疫苗包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒活疫苗。这些类型的疫苗中任何一种的合适制剂都可以产生系统免疫反应，而减毒活疫苗还可以在呼吸道内刺激局部粘膜免疫。
[0008]FluMist?是一种减毒活疫苗，可保护儿童和成人不患流感(Belshe等，(1998)，“冷适应的三价鼻内减毒活流感疫苗对儿童的效应”(The efficacy of live attenuated,cold-adapted, trivalent,intranasal influenza virus vaccine in children), N EnglJ Med338:1405-12 ;Nichol等，(1999)，“鼻内减毒活流感疫苗对健康的、工作的成年人的效应:随机对照临床试验”(Effectiveness of live, attenuated intranasal influenzavirus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial),JAMA282:137-44)。FLUMIST疫苗株含有来源于当前流行的野生型病毒株的HA和NA基因节段及来源于普通主供体病毒(common master donor virus) (MDV)的六个基因节段:PBU PB2、PA、NP、M和NS。FluMist的A型流感病毒株的MDV(MDV-A)是在连续降低温度的条件下在原代鸡肾组织培养物中通过野生型A/Ann Arbor/6/60病毒株(A/AA/6/60)的系列传代而得到的(Maassab (1967) “流感病毒在25°C时的适应和生长特性”(Adaptationand growth characteristics of influenza virus at25degrees C)Nature213:612-4)。MDV-A可在25 °C时有效复制(ca，冷适应)，但是其生长在38 °C和39 °C时受到抑制(ts，温敏)。另外，这种病毒在被感染的雪貂肺内不能复制(att，减毒的)。这种温敏表型相信是限制其在人呼吸道内最冷区域之外的部位复制而导致其毒性减弱的原因。动物模型试验和临床试验表明这种特性是相当稳定的。与通过化学诱变制备的流感病毒株的这种ts表型不同，MDV-A的ts特性通过在感染的仓鼠内传代或从儿童中分离出的经传代的分离株的这种特性不会还原(最近的综述,见Murphy&Coelingh(2002) “冷适应A型和B型流感减毒活疫苗的制备原理及其应用”(Principles underlying the development anduse of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines)ViralImmunol15:295-323)。
[0009]12株不同的6:2重排列病毒株给予超过20，000名成人和儿童进行临床试验，结果发现这些疫苗是减毒的、安全而有效的(Belshe等，(1998) “冷适应三价鼻内减毒活流感疫苗对儿童的效应”(The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent,intranasal influenza virus vaccine in children)N Engl J Med338:1405-12 ；Boyce等，(2000) “加佐剂的和未加佐剂的亚单位流感疫苗通过鼻内给药在健康成年人体内的安全性和免疫原性“(Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvantedsubunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults)Vaccinel9:217-26 ；Edwards等，(1994) “冷适应灭活疫苗预防A型流感的随机对照临床试验，，(A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines forthe prevention of influenza A disease)J Infect Disl69:68_76 ;Nichol等，(1999)“鼻内减毒活流感疫苗对健康的、工作的成年人的效应:随机对照临床试验”(Effectivenessof live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, workingadults: a randomized controlled trial) JAMA282:137-44)。携带 MDV-A 的 6 个内部基因和野生型病毒的两个HA和NA基因节段的重排列病毒株(6:2重排列株)能始终保持ca、ts和att表型(Maassab等，(1982) “利用雪紹评价冷重组流感病毒疫苗”(Evaluation of acold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)J Infect Disl46:780-900)。
[0010]到目前为止，美国所有商业化的流感疫苗都能在含胚胎的鸡蛋内繁殖。虽然流感病毒在鸡蛋内生长良好，但是疫苗的制备就要依赖鸡蛋的供应。供应鸡蛋必须是有组织的，制备疫苗的病毒株要在下一次流感季节到来前几个月开始筛选，这就限制了这种方法的灵活性，常常会导致疫苗制备和分发的延迟或短缺。
[0011]最近几年已经开发出了在细胞培养物中制备流感病毒的系统(见，Furminger.“疫苗制备” (Vaccine Production)，Nicholson 等(编)，《流感教科书》(Textbook ofInfluenza)，324-332页；Merten等，(1996) “在细胞培养物中生产病毒以制备疫苗，，(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation),Cohen&Shafferman (编)，《疫苗设计和制备的新策略》(Novel Strategies in Design andProduction of Vaccines), 141-151页)。一般来说,这些方法都是利用选定的病毒株感染适宜的永生化宿主细胞。根据已建立的组织培养方法制备疫苗虽然不会出现利用鸡蛋制备疫苗时所遇到的许多困难，但是并不是所有的流感致病株都可以良好生长和制备。另外，许多具有期望特性的病毒株，如减毒性、温度敏感性和冷适应性，利用已建立的方法在组织培养物中无法成功繁殖，而这些特性都是制备减毒活疫苗所需要的。
[0012]利用重组DNA制备流感病毒可显著提高通过组织培养方法制备流感疫苗的灵活性和实用性。最近，有报道利用插入编码病毒基因组的cDNA的重组质粒制备病毒(见Neumann等，(1999) “完全利用克隆的cDNA制备A型流感病毒”(Generation of influenzaA virus entirely from cloned cDNAs).Proc Natl Acad Sci USA96:9345-9350 ;Fodo等，(1999) “从重组 NDA 中恢复 A 型流感病毒”(Rescue of influenza A virus fromrecombinant DNA), J.Virol73:9679-9682 ;Hoffmann 等，(2000) “利用 8 种质粒制备 A 型流感病毒的 DNA 转染系统”(A DNA transfection system for generation of influenzaA virus from eight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA97:6108_6113 ;W001/83794)。通过这些系统可制备能表达任何选定病毒株的免疫原性HA和NA蛋白的重组病毒和重排列病毒。但是，与A型流感病毒不同的是，还没有报道描述利用纯质粒系统来制备B型流感病毒。 [0013]另外，现在还没有一个纯质粒系统可用于生产适于制备减毒活疫苗的减毒的、温度敏感的、冷适应的病毒株。本发明提供了一种8质粒系统用于从克隆的cDNA开始生产B型流感病毒；以及制备适用于疫苗制剂的A型和B型流感减毒活病毒的方法，如鼻内使用活病毒疫苗制剂，阅读本说明书后其他的许多优点就变得很清楚了。
[0014]发明概述
[0015]本发明涉及在细胞培养物中制备流感病毒的多载体系统以及制备重组流感病毒和重排列病毒的方法，包括适宜作疫苗的减毒的(att)、冷适应的(ca)和/或温度敏感的(ts)流感病毒，其中包括流感减毒活疫苗，如那些适于以鼻内疫苗制剂的形式使用的疫苗。
[0016]本发明的第一个方面涉及在无辅助病毒的情况下在细胞培养物中制备重组B型流感病毒的载体和方法(即无辅助病毒细胞培养系统)。本发明的方法包括导入一组载体，这些载体中的每一个都可以将一部分B型流感病毒插入到一群能支持病毒复制的宿主细胞内。宿主细胞在适于病毒生长的条件下培养就可以获得流感病毒。在某些实施方式中，流感病毒是减毒的病毒、冷适应病毒和/或温度敏感性病毒。例如，在一个实施方式中，载体来源的重组B型流感病毒是减毒的、冷适应的、温度敏感的病毒，适于制备成减毒活疫苗鼻内制剂使用。在一个典型的实施方式中，病毒是通过导入一群插入B/Ann Arbor/1/66流感病毒基因组的全部或部分，即ca B/Ann Arbor/1/66病毒基因组的载体而制备的。
[0017]例如，在某些实施方式中，B型流感病毒是经过人工改造的流感病毒，其中插入了一个或多个氨基酸取代，从而改变了流感病毒株ca B/Ann ARB0R/1/66的生物学特性。这种流感病毒包含突变，突变导致在位置PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34上一个或多个氨基酸改变，如 PBl391 (K391E)、PB1581 (E581G)、PB1661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)。任何突变(在一个或多个这种位置上)不论单独或者联合在一起都会导致温度敏感性、冷适应性或减毒性相对于野生型病毒增强，这些突变都是本发明的适宜突变。
[0018]在某些实施方式中，一组载体中插入了一种B型流感病毒株的至少6个内部基因组节段以及另一种流感病毒株的编码免疫原性流感病毒表面抗原的一个或多个基因组节段，这些载体被导入到一群宿主细胞内。例如，一种选定的减毒的、冷适应和/或温敏B型流感病毒株，即B/Ann Arbor/1/66的ca、att、ts株,或经人工改造的含有上述位置上一个或多个氨基酸改变的B型流感病毒株的至少6个内部基因组节段与另一种病毒株来源的编码免疫原性抗原的一个或多个节段一起导入到一群宿主细胞内。免疫原性表面抗原一般是指血凝素(HA)和/或神经酰胺酶(NA)抗原中的一种或两种。在某些实施方式中只导入一个编码免疫原性表面抗原的节段，此时选定病毒的其他7个互补片段也导入到宿主细胞内。
[0019]在某些实施方式中，插入B型流感病毒基因组节段的一群质粒被导入到一群宿主细胞内。例如，8个质粒用于将完整的B型流感病毒基因组导入到宿主细胞内，其中每个质粒所包含的基因组节段都不相同。另外，也可以用插入较小基因组序列的更多个质粒。
[0020]—般来说，本发明的质粒载体都是双向表达载体。本发明的双向表达载体一般都包含第一启动子和第二启动子，其中第一和第二启动子与同一双链cDNA的其中一条链连接，cDNA编码包含流感病毒基因组节段在内的病毒核酸。另外，双向表达载体还可以包含多聚腺苷酸信号和/或终止序列。例如，多聚腺苷酸信号和/或终止序列位于两个启动子之间的流感病毒基因组节段的两侧。本发明的一个优选多聚腺苷酸信号是SV40多聚腺苷酸信号。本发明的典型质粒载体是PAD3000，如图1所示。
[0021]载体导入到宿主细胞内，这种宿主细胞能支持流感病毒在载体启动子控制下的复制。宿主细胞的优选例子包括Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞。在与本文所描述的pAD3000质粒载体结合使用时，优选Vero细胞、293和COS细胞。在某些实施方式中，至少两种细胞系的混合物共培养组成了宿主细胞群，如COS和MDCK细胞的混合物或293T和MDCK细胞的混合物。
[0022]包含B型流感病毒载体的宿主细胞在适宜病毒复制和装配的条件下在培养物中生长。一般来说，包含本 发明的B型流感病毒质粒的宿主细胞在37°C以下培养，优选35°C或以下。细胞一般在32°C到35°C之间的温度下培养。在某些实施方式中，细胞在约32°C到34°C之间的温度下培养，如在约33°C培养。在培养一段适宜的时间使病毒复制到高滴度后收获重组的和/或重排列的病毒。收获的病毒还可以经过灭活。
[0023]本发明还涉及具有很宽适用范围的在细胞培养物中制备重组流感病毒的方法，所述方法包括将一组插入流感病毒基因组的载体导入到一群能支持流感病毒复制的宿主细胞内，在低于或等于35°C的温度下培养细胞，然后收获流感病毒。
[0024]在某些实施方式中，插入流感病毒基因组节段的一群质粒被导入到一群宿主细胞内。在某些特定实施方式中，8个质粒用于将完整的B型流感病毒基因组导入到宿主细胞内，其中每个质粒所包含的基因组节段都不相同。一般来说，本发明的质粒载体都是双向表达载体。本发明的典型质粒载体是PAD3000，如图1所示。
[0025]在某些实施方式中，流感病毒是指B型流感病毒。在另外一些实施方式中，流感病毒是指A型流感病毒。在某些特定实施方式中，方法包括收获重组的和/或重排列的流感病毒，这些病毒给予受试者时，如通过鼻内给药给予受试者时可激发免疫反应。在某些实施方式中，病毒在给药前被灭活，在另一些实施方式中，给予的是减毒活病毒。按照本发明的方法制备的重组的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒也是本发明的一个特征。
[0026]在某些实施方式中，病毒包括减毒流感病毒、冷适应流感病毒、温敏流感病毒、或者具有这几种特征的任意组合的流感病毒。在一个实施方式中，流感病毒是指B/AnnArbor/1/66流感病毒株，即冷适应的、温度敏感的减毒株B/Ann Arbor/1/66。在其他的实施方式中，流感病毒是指A/Ann Arbor/6/60流感病毒株，即冷适应、温度敏感的减毒株A/Ann Arbor/6/60。在另一个实施方式中，病毒是经人工改造的流感病毒，其中有一个或多个影响ca A/Ann Arbor/6/60或ca B/Ann Arbor/1/66病毒生物学特性的氛基酸改变，这种取代的氨基酸优选ca A/Ann Arbor/6/60或ca B/Ann Arbor/1/66的独特氨基酸，对于 A 型流感病毒株来说有:PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G);对于 B 型流感病毒株来说有:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114(V114A)、NP41°(P410H)、NP51ci (Α51OT)、M1159(H159Q)和 Ml183 (M183V)。同样，这些位置上能产生温度敏感性、冷适应性和/或减毒特性的其他种类的氨基酸取代也包含在本发明的病毒和方法范围内 。
[0027]另外，重排列病毒还可以通过导入含选定病毒株的6个内部基因和编码选定致病株的表面抗原(HA和NA)的基因组节段的载体来制备，其中所选定的病毒株具有适于疫苗制备的特性。例如，HA节段优选自致病性的H1、H3或B株，这都可以通过疫苗制备的常规方法实现。同样，HA节段可以选自显性致病株如H2株(如H2N2)、H5株(如H5N1)或H7株(如H7N7)。另外，第一株的7个互补基因组节段可以和HA或NA编码节段一起导入。在某些实施方式中，B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60流感病毒株。
[0028]另外，本发明还涉及制备具有期望特性的新型流感病毒，如温度敏感性、减毒特性和/或冷适应性，这些特性与疫苗的制备有关，本发明还涉及制备含这些新型流感病毒的流感疫苗的方法。在某些实施方式中，新型流感病毒A株是通过引入突变制备的，这些突变导致在一个或多个特定位置上氨基酸的取代，本文已证实这些取代对于温敏表型是十分重要的，如 PBl391、PB1581、PBl661、PB2265 和 NP340 例如，在核苷酸位点 PB11195、PB11766、PB12005、PB2821和NP146上的突变，或者其他能导致特定氨基酸位置上发生氨基酸取代的核苷酸突变。任何突变(在一个或多个这种位置上)不论单独或者联合在一起都会导致温度敏感性、冷适应性或减毒性相对于野生型病毒增强，这些突变都是本发明的适宜突变。例如，优选 PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661 (A661T) ,PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)这些突变引入野生型流感病毒A株的基因组中，即PR8，以制备适于作为减毒活疫苗使用的温度敏感突变株。为了增加期望表型的稳定性，一般要引入一组突变。将所选择的突变引入到基因组后，突变的流感病毒基因组在适于病毒制备的条件下复制。例如，突变的流感病毒基因组可在鸡蛋内复制。另外，流感病毒基因组也可在细胞培养物中复制。在后一种情况下，病毒还可以在鸡蛋内进一步扩增以提高病毒的滴度。按照本发明的方法制备的温度敏感的、减毒的和/或冷适应病毒也是本发明的特征，包含这种病毒的疫苗也是如此。同样，含有在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上出现一个或多个突变的新型重组病毒核酸，即选自下列的突变 PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)；以及具有这种氨基酸取代的多肽也是本发明的特征。
[0029]而且，本文所描述的方法适用于制备具有温度敏感性、弱毒性和/或冷适应性的新型流感病毒B株，该方法是将一个或多个特异性突变引入到B型流感病毒基因组中。例如，将一个或多个导致在 PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、Ml159 或 Ml183 位置上发生氨基酸取代的突变引入到B型流感病毒株中以制备温敏B型流感病毒基因组。氨基酸取代的例子包括:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114 (VI14A)、NP410 (P410H)、NP510 (A510T)、Ml159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)。如上所示，包含这种病毒以及插入这些突变和氨基酸取代的核酸和多肽的疫苗都是本发明的特征。
[0030]相应的，不论其制备方法如何，插入本发明的突变的流感病毒都是本发明的特征。这就是说，本发明包含具有本发明的突变的流感病毒株，即在相对于野生型病毒株的下列一个或多个位置上发生氨基酸取代的任何A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或在相对于野生型病毒株的下列一个或多个位置上发生氨基酸取代的任何B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159 和 Ml183 ;但是病毒株 ca A/AnnArbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66不是本发明的特征。在某些优选的实施方式中,A型流感病毒含有一组突变，其中包括:PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和NP34 (D34G) ;B型流感病毒含有一组突变，其中包括PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41c1 (P410H)、NP51CI(A510T)、Ml159 (H159Q)和Ml183 (M183V)。
[0031]在一个实施方式中，一组含有流感病毒基因组的质粒载体被导入到宿主细胞内。例如，流感病毒基因组节段可以插入到至少8种质粒内。在一个优选实施方式中，流感病毒基因组节段被插入到8种质粒内。例如，这8种质粒的每个质粒都插入有不同的流感病毒基因组节段。
[0032]本发明的载体可以是双向表达载体。本发明的双向表达载体一般都包含第一启动子和第二启动子，其中第一启动子和第二启动子可操作连接到含有流感病毒基因组节段的同一双链病毒核酸的两条链上。另外，双向表达载体还可以包含多聚腺苷酸信号和/或终止序列。例如，多聚腺苷酸信号和/或终止序列位于两个启动子之间的流感病毒基因组节段的两侧。本发明的一个优选多聚腺苷酸信号是SV40多聚腺苷酸信号。本发明的典型质粒载体是PAD3000，如图1所示。
[0033]任何能支持流感病毒在载体启动子控制下复制的宿主细胞都包括在本发明的范围之内。宿主细胞的优选例子包括Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞。在与本文所描述的pAD3000质粒载体结合使用时，优选VeiO细胞、293细胞和COS细胞。在某些实施方式中，至少两种细胞系的混合物共培养组成了宿主细胞群，如COS和MDCK细胞的混合物或293T和MDCK细胞的混合物。
[0034]本发明的一个特征是含有本发明质粒的宿主细胞在37°C以下培养，优选35°C或以下。细胞一般在32°C到35°C之间的温度下培养。在某些实施方式中，细胞在约32°C到34°C之间的温度下培养，如在约33°C培养。
[0035]本发明的另一个方面涉及从培养的Vero细胞内恢复重组的或重排列的A型流感病毒或B型流感病毒(即野生型A型流感病毒或流感病毒及其突变株)的新型方法。一组含流感病毒基因组的载体通过电穿孔导入到一群宿主细胞内。细胞在适于病毒复制的条件下生长，即冷适应的、减毒的、温度敏感的病毒株，Vero细胞在37 °C以下培养，优选35 °C或以下。细胞一般在32°C到35°C之间的温度下培养。在某些实施方式中，细胞在约32°C到34°C之间的温度下培养，如在约33°C培养。另外(如对于疫苗的制备来说)，Vero细胞在无血清无任何动物来源的产物的培养基中生长。
[0036]在上面所描述的方法中，病毒通过培养含流感病毒基因组质粒的宿主细胞而获得。在某些实施方式中，收获的病毒是重组病毒。在另外一些实施方式中，收获的病毒是具有多个亲本病毒株基因背景的重排列病毒。另外，收获的重组病毒或重排列病毒还可以在培养的细胞内或鸡蛋内进一步扩增。
[0037]另外，收获的病毒可以被灭活。在某些实施方式中，收获的病毒组成了流感疫苗。例如，收获的流感疫苗可以是具有来源于选定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA抗原的重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列病毒)。在某些优选的实施方式中，重排列流感病毒具有减毒的表型。另外，重排列病毒可以是冷适应和/或温敏B型流感病毒，即具有表17中一个或多个氨基酸取代的减毒的、冷适应和/或温敏B型流感病毒。这种流感病毒可用作减毒活疫苗以激发针对特定致病性流感病毒株的免疫反应。按照本发明的方法制备的流感病毒，如减毒的重排列病毒是本发明的一个特征。
[0038]在另一方面，本发明涉及制备重组流感病毒疫苗的方法，所述方法包括将一群含流感病毒基因组的载体导入到一群能支持流感病毒复制的宿主细胞内，在低于或等于35°C的温度下培养宿主细胞，以及收获能在给予受试者后激发免疫反应的流感病毒。本发明的疫苗可以是A型流感病毒株，也可以是B型流感病毒株。在某些实施方式中，流感疫苗病毒包括减毒的流感病毒、冷适应流感病毒或温敏流感病毒。在某些实施方式中，病毒具有这些特性的组合。在一个实施方式中，流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60流感病毒株。在另一个实施方式中，流感病毒包含B/Ann Arbor/1/66流感病毒株。另外，疫苗还包括人工改造的A型流感病毒或B型流感病毒，其中含有至少一个取代的氨基酸，这些取代的氨基酸能影响ca A/Ann Arbor/6/60或ca/B/Ann Arbor/1/66的生物学特性,如这些病毒株的独特氨基酸。例如，本发明所包含的疫苗包括人工改造的重组的和重排列的A型流感病毒，这些病毒至少有一个位置发生突变，导致下列位置上发生氨基酸取代:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ;以及人工改造的重组的和重排列的B型流感病毒，这些病毒至少有一个位置发生突变，导致下列位置上发生氨基酸取代:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159和Ml183。
[0039]在某些实施方式中，病毒包括重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列株)，这些病毒含有来源于多个流感病毒株的基因组节段。例如，优选的重排列流感病毒疫苗包含来源于选定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA表面抗原以及来源于具有与疫苗制备有关的期望特性的病毒株的内部基因组节段。通常情况下在预测致病株(如上面所描述的)在局部或世界范围内流行的基础上优选HA和/或NA编码节段来源的流感病毒株。在某些情况下，含有内部基因组节段的病毒株是减毒的、冷适应和/或温敏流感病毒株，如A/AnnArbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有一个或多个取代的氨基酸从而具有所期望的表型的人工改造的流感病毒株，如包含至少一个突变从而导致在下列位置上发生氨基酸取代的A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ;以及包含至少一个突变从而导致在下列位置上发生氨基酸取代的B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159和Ml183。例如，优选的重排列病毒包含具有下列一个或多个氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒:PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G);以及包含具有下列一个或多个氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒:PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41ci (P410H)、NP51CI(A510T)、Ml159 (H159Q)和Ml183 (M183V)。[0040]如果需要，流感病毒可以在收获后被灭活。
[0041]通过本发明的方法制备的流感病毒疫苗，包括减毒活疫苗也是本发明的特征，在某些优选的实施方式中，流感病毒疫苗是重排列病毒疫苗。
[0042]本发明的另一个方面涉及双向表达质粒载体。本发明的双向表达载体含有位于第二启动子和多聚腺苷酸位点即SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子。在一个实施方式中，第一启动子和第二启动子的方向相反，位于至少一个克隆位点的两侧。本发明的典型载体是质粒PAD3000,如图1所示。
[0043]在某些实施方式中，流感病毒基因组至少一个节段被插入到克隆位点上，形成双链核酸。例如，本发明的载体包括一种质粒，该质粒中的第一启动子位于第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间，其中第一启动子和第二启动子方向相反，位于至少一个流感病毒基因组节段的两侧。[0044]包含本发明的一个或多个表达载体的试剂盒也是本发明的一个特征。一般来说，试剂盒还包含一个或多个能支持流感病毒复制的细胞系，缓冲液、细胞培养基、说明书、包装材料和容器。在某些实施方式中，试剂盒含有一组表达载体，每种表达载体至少含有流感病毒基因组的一个节段。例如，试剂盒包含一组表达载体，每种表达载体含有一种选定病毒株的一个内部基因组节段，所选择的病毒株具有与疫苗制备或使用有关的特性，这也是本发明的特征。例如，选定的病毒株可以是减毒的、冷适应的和/或温度敏感的病毒株，如A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有期望特征的其他病毒株，如具有本文表17中所描述的一个或多个氨基酸取代的人工改造的病毒株。在一个实施方式中，试剂盒包含的表达载体含有编码突变的HA和/或NA抗原的核酸文库的成员。
[0045]能在低于或等于35°C的温度下增殖性生长的细胞培养物也是本发明的特征，这些细胞培养物至少包括一种细胞，该细胞包含一组含有流感病毒基因组的载体。组合物还可以包括细胞培养基。在某些实施方式中，一组载体包括双向表达载体，即含有插入到第二启动子和SV40多聚腺苷酸位点之间的第一启动子。例如，第一启动子和第二启动子方向相反，位于流感病毒至少一个节段的两侧。本发明的细胞培养物可在低于或等于35°C的温度下培养，如约32°C到35°C之间，一般来说是在约32°C到34°C之间，如约33°C。
[0046]本发明还涉及细胞培养系统，该系统包括上述能增殖性生长的至少包含一种细胞的细胞培养物，其中细胞包含一组含有流感病毒基因组的载体；以及维持细胞培养物在低于或等于35°C下生长的调节剂。例如，调节剂优选能维持细胞在约32°C到35°C之间生长，一般来说是在约32°C到34°C之间，如约33°C。
[0047]本发明的另一个特征是人工改造的的重组流感病毒或重排列病毒，该病毒含有一个或多个能影响温敏流感病毒、冷适应性和/或减毒特性的取代的氨基酸。例如，在如下位置上出现氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ；以及在下列位置上发生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ;M1159和Ml183都是本发明的优选实施方式。典型的实施方式包括具有下列一个或多个如下取代的氨基酸的A型流感病毒:PB1391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PB1661(A661T)、PB2265 (N265S)和NP34(D34G);以及具有下列一个或多个氨基酸取代的B型流感病毒:PB2630 (S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H) ,NP55 (T55A)、NP114 (V114A)、NP41。(P410H)、NP510 (A510T)、Ml159 (H159Q)和Ml183 (M183V)。在某些实施方式中，病毒包含一组突变，如在上述位置上的1、2、3、4、5、6、7、8或9个取代的氨基酸。相应的，在上述所有5个位置上，即 PBl391 (K391E)、PB1581(E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G)发生氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒；以及在上述8个或所有9个位置上，即PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP51CI(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)发生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒也都包括在本发明的范围之内。另外，病毒也可以含有上面未提到的一个或多个其他类型的取代的氨基酸。
[0048]在某些实施方式中，人工改造的流感病毒是温敏流感病毒、冷适应的和/或减毒的流感病毒。例如，与野生型的流感病毒相比，本发明的温敏流感病毒在39°C生长时一般会降低约2.0到5.0log100例如，与野生型的流感病毒相比，在39°C时，温敏流感病毒病毒的生长至少约降低2.0log10、约3.0log10、4.0log10或4.51og10。一般来说，但也不一定,温敏流感病毒在33°C时保持最旺盛的生长特性。通过雪貂减毒试验发现，与野生型的流感病毒相比，本发明的减毒流感病毒一般会降低约2.0到5.0log100例如，通过雪貂减毒试验证明，与野生型的流感病毒相比，本发明的减毒流感病毒的生长至少约降低2.0logltl、通常降低约3.0logltl,优选降低约4.0log10O
[0049]附图简述
[0050]图1:pAD3000质粒的说明
[0051]图2:感染细胞的显微图片
[0052]图3:通过质粒转染所得到的rMDV-A和6:2H1N1重排列病毒的基因型分析
[0053]图4:制备B型流感病毒的8质粒系统的说明
[0054]图5: A和B.RT-PCR分析重组MDV-B病毒的特征；C和D.RT-PCR分析重组B/Yamanashi/166/98 的特征
[0055]图6: GeneBank 形式的 pAD3000 序列
[0056]图7: MDV-B和8种质粒的序列比对
[0057]图8:同时扩增B型流感病毒的HA和NA节段所得到的RT-PCR产物
[0058]图9:柱形图说明重组病毒和重排列病毒的相对滴度
[0059]图10:柱形图说明重排列病毒在允许温度和限制温度下的相对滴度(温敏流感病毒)
[0060]图11:图表说明插入与温敏流感病毒有关的特异性突变(敲入)的重排列病毒(左图)以及在允许温度和限制温度下的相对滴度(温敏流感病毒)(右图)。
[0061]图12:利用微基因组分析确定ts突变。A.HEp-2细胞转染PB1、PB2、PA、NP以及pFlu-CAT，在33°C或39°C孵育18小时，细胞提取物用于分析CAT报告基因的表达。B.利用引物延伸试验分析CAT mRNA的表达
[0062]图13:【专利附图】

【附图说明】PA、NP和Ml蛋白上具有野生型残基的三基因重组病毒
[0063]图14:表格说明单基因和双基因重组病毒的生长情况
[0064]图15:表格说明非ts表型相应的核蛋白的氨基酸残基
[0065]图16:重组PR8突变株的简图。黑点表示PBl和/或PB2基因上引入的突变
[0066]图17:柱形图说明在33°C和39°C时的相对滴度
[0067]图18:PR8突变株 在各种温度下噬菌斑形态的显微照片。MDCK细胞如所示的那样转染病毒并分别在33°C、37°C和39°C孵育3天。通过免疫染色观察噬菌斑并拍照。[0068]图19:允许温度及非允许温度下的蛋白合成。MDCK细胞如所示的那样转染病毒并分别在33°C或39°C孵育过夜。SDS-PAGE电泳分离放射性同位素标记的多肽并进行放射自显影。图中指示的是病毒蛋白HA、NP、M1和NS。
[0069]图20: A.线图说明MDA-V和MDV-B在Per.C6细胞内与在MDCK细胞内复制的区别。B.线图说明MDV-A单基因重排列病毒在Per.C6细胞内的不同复制情况。
[0070]详细描述
[0071]许多致病性流感病毒在组织培养物中的生长状态很差，适于制备减毒活疫苗(即温敏流感病毒、冷适应的和/或减毒的流感病毒)的病毒株还无法在培养的细胞内成功生长以制备商业用途的产品。本发明提供了一种多质粒系统，该系统可使那些在标准细胞培养条件下不能生长的流感病毒株生长和恢复。 [0072]在第一个方面，本发明的方法涉及在细胞培养物中完全由克隆的病毒DNA来制备重组B型流感病毒的载体和方法。在另一个方面，本发明的方法部分基于组织培养条件的改善，这种条件能够支持具有疫苗制备相关特性(即减弱的致病性、冷适应性、温敏流感病毒等)的病毒株(流感病毒A株和B株)在体外培养的细胞内生长。流感病毒可通过将一组携带克隆的病毒基因组节段的载体导入到宿主细胞内并在不超过35°C的温度下培养而制备。当转染含流感病毒基因组的载体时，适于作为疫苗的重组病毒可通过标准的纯化方法制备。利用本发明的载体系统和方法，可快速高效地在组织培养物中制备插入有6个具有期望特性的病毒株的内部基因节段和选定致病株的免疫原性HA和NA节段的重排列病毒。因此，本文所描述的系统和方法可用于在细胞培养物中快速制备重组的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒，包括适于作为疫苗的病毒，包括减毒活疫苗，如适于鼻内使用的疫苗。
[0073]一般来说，每个A亚型和B亚型选择一个主供体病毒(MDV)株。对于减毒活疫苗来说，主供体病毒一般根据其优良的特性来选择，如与疫苗制备有关的温敏流感病毒、冷适应性和/或减毒特性。例如，典型的主供体病毒分别包括A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66的这种温度敏感株、减毒株和冷适应株。本发明在下面说明了导致这些病毒株产生ca、ts和att表型的突变，并且提供了制备适于作为供体株制备重组疫苗和重排列疫苗的新型流感病毒株的方法。
[0074]例如，一个选定的主供体A型病毒(MDV-A)或主供体B型病毒(MDV-B)可从一组含病毒基因组的克隆的病毒cDNA开始制备。在一个典型的实施方式中，重组病毒是从8个克隆的病毒cDNA开始制备的。8个病毒cDNA代表选定的MDV-A的或MDV-B的PB2、PBUPA、NP、HA、NA、M和NS序列，这些cDNA被克隆到双向表达载体如质粒(如pAD3000)内，这样病毒基因组RNA就可以在RNA聚合酶Ι(ρ01 I)启动子的控制下从一条链上转录出来，病毒mRNA在RNA聚合酶ΙΙ(ρ01 II)启动子的控制下从另一条链上合成出来。另外，任何基因节段都可以经过修饰，其中包括HA节段(如去除多碱基裂解位点)。
[0075]然后将携带8个病毒cDNA的质粒转染到合适的宿主细胞，如VeiO细胞、共培养的MDCK/293T或MDCK/C0S7细胞内，随后就可以收获感染性重组MDV-A或MDV-B病毒。利用本文所描述的质粒和方法，本发明可通过共转染选定病毒(如MDV-A、MDV-B)的6个内部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和不同的相应类型流感病毒(A或B)来源的HA和NA用于制备6:2重排列流感病毒疫苗。例如，HA节段最好是选自致病性的Hl、H3或B病毒株，这些在疫苗制备中都是常规的。同样，HA节段也可以选自与致病株有关联的病毒株，如H2株(H2N2)、H5株(H5N1)或H7株(H7N7)。含有MDV的7个基因组节段和选定病毒株的HA或NA基因的重排列病毒株(7:1重排列病毒)也可以制备。另外，该系统还可以用于确定表型特征的分子基础，如与疫苗制备相关的减毒特性(att)、冷适应性(ca)以及温敏(ts)流感病毒。
[0076]定义
[0077]除非另外给出定义，所有的科学和技术术语都被理解为与其所用领域内的常用含义相同。为了本发明的目的特地对下列术语作出定义。
[0078]术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”以及“核酸序列”是指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，或其嵌合体或类似物。如本文所描述，该术语还可以包括具有天然核苷酸基本属性的天然核苷酸类似物的多聚物，该多聚物可以天然核苷酸相同的方式与单链核酸杂交。除非特别说明，本发明的特定核酸序列除了包含明确指出的序列外还包含互补序列。
[0079]术语“基因”是一个被广泛使用的概念，是指有生物功能的任何核酸序列。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需要的调节序列。术语“基因”适用于特殊的基因组序列，也适用于基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
[0080]基因也包括非表达的核酸节段，如形成其他蛋白的识别序列。非表达调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白如转录因子可与之结合，导致临近或附近序列的转录。“组织特异性”的启动子或增强子是指可在特定类型的组织或细胞内调节转录的启动子或增强子。
[0081]术语“载体”是 指可用于在微生物、细胞或细胞组分之间繁殖和/或转移核酸的工具。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等，载体可自主复制或整合到宿主细胞的染色体内复制。载体还可以是裸RNA、裸DNA、位于同一条链内的由DNA和RNA组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽连接的DNA或RNA、脂质体连接的DNA等，这些载体不能自主复制。本发明最常用的载体是质粒。
[0082]“表达载体”是能启动表达以及能使其携带的核酸复制的载体，如质粒。一般来说，被表达的核酸连接有启动子和/或增强子，核酸的转录被启动子和/或增强子控制。
[0083]“双向表达载体”一般具有方向相反的两个启动子，核酸位于两个启动子之间，表达可在任一方向起始转录出RNA的正义链(+ )或反义链(_)。另外，双向表达载体还可以是双义载体，病毒mRNA和病毒基因组RNA (作为cRNA)从同一条链上表达。
[0084]根据本发明，术语“游离的”是指不含在天然环境中与其伴随或相互作用的组分的生物材料，如核酸或蛋白质。游离的材料还可以包含天然环境中不存在的材料，如细胞。例如，如果材料存在于天然环境中，如细胞，但是该材料在细胞内所存在的位置(如基因组或基因元件)与天然环境中所处的位置是不同的。例如，天然核酸(如编码序列、启动子、增强子等)如果以非天然的方式被引入到基因组(即载体，如质粒或病毒载体，或者复制子)内该核酸所处的天然位点不同的位点上，则该核酸就成为游离的核酸。这种核酸也被称为“异源核酸”。
[0085]术语“重组子”是指经人工改造或人工合成的材料(如核酸或蛋白)。这种改变可在其天然环境或状态中进行，也可从其天然环境或状态中去除。当这个术语指病毒，如流感病毒时，病毒是重组病毒是指该病毒是通过重组核酸的表达而制备的。
[0086]术语“重排列的”指病毒时说明病毒包含来源于多个亲本病毒株或资源的基因元件和/或多肽元件。例如，7:1重排列病毒包括第一亲本病毒来源的7个基因组节段(或基因节段)和第二亲本病毒来源的一个互补病毒基因组节段，如编码血凝素或神经酰胺酶的基因组节段。6:2重排列病毒包括第一亲本病毒来源的6个基因组节段，最常用的是6个内部基因；以及另一个亲本病毒来源的两个互补片段，即血凝素和神经酰胺酶。
[0087]术语“导入的”用于异源或游离核酸时是指核酸掺入到真核细胞或原核细胞内，其中核酸插入到细胞的基因组(如染色体、座机里、质体或线粒体DNA)内，转化形成自主复制子或瞬时表达(如转染的mRAN)。该术语包括方法如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”。在本发明中，各种方法都可以用于将核酸导入到原核细胞内，如电穿孔、钙磷酸盐沉淀、脂质介导的转染(脂转染)等。
[0088]术语“宿主细胞”是指含有异源核酸，如载体，并支持核酸复制和/或表达的细胞，该细胞还可以产生一种或多种编码查努，包括多肽和/或病毒。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，也可以是真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖类动物细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞，其中包括人源细胞。本发明所用的典型宿主细胞包括Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、Per.C6细胞(人胚胎视黄醛细胞)、BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)、原代鸡肾细胞(PCK)、Madin-Darby 狗肾(MDCK)细胞、Madin-Darby 牛肾(MDBK)细胞、293 细胞(如 293T 细胞)和COS细胞(如C0S1、C0S7细胞)。术语宿主细胞包含细胞的混合物，如不同类型的细胞或细胞系的混合培养物。
[0089]术语“温度敏感的”、“冷适应”和“减毒的”是本领域所熟知的。例如，术语“温度敏感的”(“ts”)用于A型流 感病毒株说明该病毒在39°C时的滴度相对于33°C来说下降100倍或更多，用于B型流感病毒株说明该病毒在37°C时的滴度相对于33°C来说下降100倍或更多。例如，术语“冷适应”(“ca”)是指病毒在25°C时的生长在其33°C时的生长的100倍以内。例如，术语“减毒的”(“att”)是指病毒可在雪貂的上呼吸道内复制但是在肺组织内检测不到，也不能引起动物出现感冒样的疾病。也可以理解为病毒具有中间表型，即病毒在39°C (对于A株病毒来说)或37°C (对于B株病毒来说)时滴度降低小于100倍，在25°C时的生长比其在33°C的生长高100倍以上(如200倍、500倍、1000倍、10000倍以内)，和/或其在雪貂肺内的生长弱于其在上呼吸道内的生长(即毒性部分降低)和/或在动物体内引起的感冒样疾病较轻，具有本文所描述的一个或多个氨基酸取代的病毒也是本发明所包括的有用病毒。生长是指病毒量的增加，通过测定滴度、噬菌斑大小或形态、颗粒密度或本领域技术人员所熟知的其他方法。
[0090]术语“人工改造的的”用于本文是指病毒、病毒核酸或病毒编码产物如多肽、疫苗含有至少一个通过重组方法引入的突变，如定向诱变、PCR突变等。术语“人工改造的的”用于含有一个或多个核苷酸突变和/或氨基酸取代的病毒(或病毒成分或产物)时是指编码病毒(或病毒成分或产物)的病毒基因组或基因组节段不是来源于天然资源，如天然产生的或通过非重组方法(如在25°C下累进传代)制备的以前已经存在的实验室病毒株，即野生型的或冷适应A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/l/66S流感病毒株。
[0091]流感病毒
[0092]流感病毒的基因组由线性㈠核糖核酸(RNA)链的8个节段组成，分别编码免疫原性的血凝素(HA)和神经酰胺酶(NA)蛋白；以及6个内部核心多肽:核外壳核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、非结构蛋白(NS)、以及3个RNA多聚酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在复制期间，基因组病毒RNA在宿主细胞的核内转录成(+ )链信使RNA和㈠链基因组cRNA。8个基因组节段都包装到核糖核蛋白复合体内，该复合体内除了 RNA外还含有NP和多聚酶复合体(PB1、PB2 和 PA)。
[0093]在本发明中，8个节段中的每一个相应的病毒基因组RNA被插入到重组载体中进行操作和制备流感病毒。各种载体，包括病毒载体、质粒、粘粒、噬菌体以及人工染色体都可以用于本发明中。为了便于操作，病毒基因组节段一般插入到质粒载体内，载体中含有一个或多个能在细菌和真核细胞内发挥功能的复制起点，还可以含有筛选标记基因以便于筛选转染质粒序列的细胞。典型的载体是图1所示的PAD3000。[0094]本发明最常用的质粒载体是双向表达载体，该载体可使插入的病毒基因组节段在任何一个方向上起始转录，合成出(+ )链RNA和㈠链RNA。为了提高双向转录的效率，每个病毒基因组节段都插入到含有至少两个独立启动子的载体内，这样病毒基因组RNA的拷贝可被第一 RNA聚合酶启动子(即Pol I)从一条链上转录出来，而病毒mRNA被第二 RNA聚合酶启动子(即Pol II)合成。相应的，两个启动子以相反方向排列，位于至少一个克隆位点(即限制性内切酶识别序列)的两侧，优选独特的克隆位点来插入病毒基因组RNA片段。另外，“双义”载体也可以使用，其中(+ )链mRNA和㈠病毒RNA (作为cRNA)从同一条链上表达。
[0095]表达载体
[0096]需要表达的流感病毒基因组节段被连接到控制mRNA合成的适当转录控制序列(启动子)上。各种启动子都适用于流感病毒基因组节段在表达载体内的转录调节。在某些实施方式中，载体是质粒PAD3000，，所用的启动子为巨细胞病毒(CMV)DNA依赖的RNA聚合酶II(Pol II)启动子。如果需要，例如为了调节条件表达的需要，也可以用其他的启动子替换以诱导RNA在特定的条件下转录，或者在特定的组织或细胞内转录。许多病毒的启动子或哺乳动物如人的启动子都可以使用，可根据特定的用途来分离。例如，动物和人病毒基因组来源的启动子包括腺病毒(如腺病毒2)、乳头状瘤病毒、乙型肝炎宾度故、多瘤病毒和猿病毒40(SV40)来源的启动子以及各种逆转录病毒启动子。哺乳动物启动子包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。另外，噬菌体启动子也可以和同源的RNA聚合酶联合使用，如17启动子。
[0097]转录还可以通过加入增强子序列来增强。增强子一般较短，约10_500bp，是一种顺式作用DNA元件，可与启动子一起增强转录。许多增强子序列已被从哺乳动物基因(血红蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中分离出来。增强子可被连接到载体内的异源编码序列的5’或3’位置，但是一般都插入到启动子的5’端。一般来说，所选择的启动子以及附加的转录增强序列能优化异源DNA在其所导入的宿主细胞内的表达(Scharf等，(1994) “热应激启动子和转录因子”(Heat stress promoters andtranscription factors)Results Probl Cell Differ20:125-62 ;Kriegler等，(1990)“增强子、启动子和剪接位点的装配以控制转移基因的表达”(Assembly of enhancers,promoters,and splice signals to control expression of transferred genes)Methodsin Enzymoll85:512-27)。另外,扩增子还可以含有核糖体结合位点或内部核糖体进入位点(IRES)以便于翻译的起始。
[0098]本发明的载体还优选包含转录终止以及稳定mRNA所需要的序列，如多聚腺苷酸位点或终止子序列。这种序列通常置于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区,有时也置于3’非翻译区。在一个实施方式中，即包含质粒PAD3000的实施方式中，多聚腺苷酸信号是由SV40多聚腺苷酸序列提供的。
[0099]另外，如上面所描述，表达载体还可以包含一个或多个筛选标记基因以提供筛选转化细胞所需要的表型性状，处理前面所列的基因外，标记物如二氢叶酸还原酶或新霉素耐药性都适于筛选真核细胞培养物。
[0100]含上述合适DNA序列以及合适启动子或控制序列的载体可用于转化允许蛋白表达的宿主细胞。虽然本发明的载体可在细菌中复制，但是大多数情况下这些载体是需要导入到哺乳动物细胞，如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞、COS细胞内以获得表达。
[0101]其他的表达元件
[0102]在大对数情况下，编码流感病毒蛋白的基因组节段包括其表达，包括翻译成功能性病毒蛋白所需的任何附加序列，在其他情况下，编码病毒蛋白如HA或NA蛋白的小基因或其他人工构建体也可以使用。在这种情况下，通常需要包含特异性的起始信号以帮助异源编码序列有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子及其临近的序列。为了确保整个插入片段的翻译，起始密码子应插入到与病毒蛋白有关的正确阅读框架内。外援转录元件和起始密码子可以是各种来源的，可以是天然的，也可以是合成的。表达效率可以通过添加适于细胞系统的增强子来增强。
[0103]如果需要，编码附加表达元件如信号序列、分泌或局域化序列等的多核苷酸序列可以插入到载体内，通常与目的多核苷酸序列处于同一框架内以使表达的多肽靶向性地定位到期望的细胞腔隙、膜或细胞器内，或者分泌到细胞培养基中。这些序列是本领域技术人员所熟知的，包括分泌前导肽、细胞器靶向性序列(如细胞核定位序列、内质网滞留信号、线粒体转运虚礼)、膜定位/锚定序列(如停止运送序列、GPI锚定序列)等。
[0104]流感病毒疫苗
[0105]流感病毒疫苗以前都是根据经验预测将要流行的病毒株，然后选择病毒株在含胚胎的鸡蛋内制备。最近，重排列病毒株已经被制备出来，这些病毒含有选定的血凝素和神经酰胺酶抗原，是已经被认可的减毒的、温敏流感病毒主病毒株。经过在鸡蛋内多次传代培养以后收获流感病毒，还可以选择利用甲醛和/或丙内酯灭活。但是，以这种方式制备流感疫苗有几个明显的缺点。从鸡蛋内剩余的污染物是具有高抗原活性的，是由于高热所产生的，常常会在使用后产生明显的副作用。更重要的是，设计需要制备的病毒株必需在下一个流行季节到来前几个月开始筛选和分配以便于有足够的时间来制备和灭活流感疫苗。在细胞培养物中制备重组和重排列疫苗的企图也受到了被批准可以制备疫苗的病毒株都不能在标准细胞培养条件下生长这一问题的阻碍。
[0106]本发明提供了在细胞培养物中制备重组和重排列病毒的载体系统和方法，这使根据一个或多个选定的抗原性病毒株来快速制备疫苗成为可能。特别是本发明提供的条件和病毒株可使病毒在细胞培养物中从多质粒系统中有效制备出来。另外，如果需要，病毒还可以在鸡蛋内进一步扩增。
[0107]例如，利用标准的细胞培养条件如在37°C使流感病毒B主病毒株B/AnnArbor/1/66生长是不可能的。在本发明的方法中，多质粒系统中的每一个质粒都含有一个流感病毒基因组的节段，这个系统被导入到适宜的细胞内，然后在低于或等于35°C的温度下培养细胞。一般来说，细胞培养物可在约32°C到35°C之间的温度下培养，优选约32°C到34°C之间，如约33。。。 [0108]通常细胞培养物都是在一个系统内培养，如细胞培养箱，控制湿度和CO2含量,利用温度调节装置是温度保持在一个恒定的范围内，如恒温器以确保温度不超过35°C。
[0109]重排列病毒可以通过导入一组载体很容易地获得，这些载体含有主流感病毒的基因组节段和来源于目的病毒株(即感兴趣的抗原性病毒株)的互补节段。一般来说，主病毒株的选择是基于其是否具有与疫苗使用有关的特性。例如，对于疫苗制备，即减毒活疫苗的制备来说，选择的主供体病毒要有减毒表型、冷适应性和/或温敏流感病毒。因此，流感病毒A株ca A/Ann Arbor/6/60 ;流感病毒B株ca B/Ann Arbor/1/66 ;或其他具有期望表型特性即减毒特性、冷适应性和/或温敏流感病毒病毒株，如实施例4所描述的人工改造的流感病毒A株；或者表17所列的一个或多个取代的氨基酸的人工改造的流感病毒B株都优选为主供体病毒株。
[0110]在一个实施方式中，含有主流感病毒株6个内部基因(即PB1、PB2、PA、NP、Ml、NSl和NS2)和抗原性病毒株，即经预测可能引起明显的局部或全球流感的病毒株来源的血凝素和神经酰胺酶片段的质粒被转染到合适的宿主细胞内。重排列病毒在适于有效生长的温度，即低于或等于35°C，如在约32°C到35°C之间，例如在约32°C到34°C之间，或约33°C下在细胞培养物中复制，然后收获重排列病毒。另外，收获的病毒还可以用变性剂如甲醛或β -丙内酯灭活。
[0111]减毒的、温度敏感的和冷适应的流感病毒疫苗
[0112]在一个方面，本发明是基于确定导致优选的主供体病毒株产生ts表型的突变。为了确定单个核苷酸改变对于MDV病毒株基因组的功能重要性，分析了 A/AA/6/60病毒系内高度相关的病毒株来源的重排列病毒的温敏流感病毒。两个亲本病毒的同基因特性可以使单核苷酸改变对ts表型的影响得以评价。相应的，MDV-A的ts表型在核苷酸水平上的基因基础被映射到PB1、PB2和NP内的特异性氨基酸上。
[0113]以前有研究人员试图利用共感染/重排列技术绘制ca A/AA/6/60的ts表型的基因基础以制备出A/AA/6/60和不相关的野生型病毒株之间的单基因和多基因重排列病毒。这些研究表明PB2和PBl与ts表型都有关系(Kendal等，(1978) “重组病毒在亚理想温度下的生化特性:有迹象表明ts损伤存在于RNA节段I和3，RNAl编码病毒原转录酶，，(Biochemical characteristics of recombinant viruses derived at sub-optimaltemperatures:evidence that ts lesions are present in RNA segmentsland3，andthat RNAlcodes for the virion transcriptase enzyme)，734-743 页，B.W.J.Mahy 和R.D.Barry (编)，Negative Strand Viruses, Academic Press ；Kendal 等，(1977) “野生型和冷突变(温敏流感病毒)流感病毒的比较研究:重组的冷适应病毒H3N2的基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)的系谱学”(Comparative studies of wild-type and coldmutant (temperature sensitive)influenza viruses: genealogy of the matrix (M) andthe non-structural (NS)proteins in recombinant cold-adapted H3N2viruses)，J GenVirol37:145-159 ；Kendal等，(1979) “野生型和冷突变(温敏流感病毒)流感病毒的比较研究:在突变型A/Ann Arbor/6/60与野生型H3N2病毒株重组的过程中病毒复制的温敏流感病毒与病毒原转录酶活性的温敏流感病毒是相互独立的”(Comparative studies ofwild-type and cold-mutant(temperature sensitive)influenza viruses:1ndependentsegregation of temperature-sensitivity of virus replication fromtemperature-sensitivity of virion transcriptase activity during recombinationof mutant A/Ann Arbor/6/60with wild-tyoe H3N2strains),T Gen Virol,44:443-4560:Snyder等，(1988) “4个病毒基因对活流感A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)冷适应重排列病毒疫苗的减毒活性的贡献是独立的” (Four viral genes independently contribute toattenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60(H2N2)cold-adapted reassortantvirus vaccines), T Virol62:488-95) ?但是这些研究的结果被两株不同流感病毒A株来源的混合基因节段所导致的相互影响效应所混淆。通过A/AA/6/60和野生型基因节段而不是具有A/AA/6/60基因背景的表达ts表型的其他病毒株之间的改变可使相互作用减弱。相互影响效应也显示出可混淆M基因组节段与att表型之间相互关系的解释(Subbarao等，(1992)“流感病毒A/Ann Arbor/6/60冷适应病毒(H2N2) M基因所赋予的A/Korea/82 (H3N3)重排列病毒的减毒表型来自于基因相互影响效应”(The attenuation phenotypeconferred by M gene of the influenza A/Ann Arbor/6/60cold-adapted virus(H2N2)onthe A/Korea/82(H3N2)reassortant virus results from a gen constellation effect),Virus Res,25:37-50)。
[0114]在本发明中，导致氨基酸在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上发生取代的突变已被确定对于MDV-A株病毒的温敏表型是具有功能意义的。正如本领域技术人员所理解的，在PB11195、PBl1766, PBl2005, PB2821和NP146位置上发生的核苷酸突变可分别导致在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上发生氨基酸取代。因此，任何能导致在这些位置上发生氨基酸取代的核苷酸改变都是本发明的特征。典型的突变包括单个突变PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G) ,PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)，优选的是联合突变，结果导致病毒产生温敏表型。同样这些突变恢复到野生型ts表型就会消失，而将这些突变引入具有野生型基因背景的病毒中就可以使其具有ts表型。和病毒传代期间这些表型的稳定性一致的是，单个变化不能使病毒的温敏流感病毒回复到野生型病毒的水平。而且这些改变是在一起协调作用来完全表达ts表型的。这个发现可以使我们将其他温敏流感病毒A株改造成适于制备减毒活流感疫苗的主供体病毒。
[0115]同样，主供体病毒B株上每个氨基酸的改变都是与表17中所列的ts表型相关的。因此，本文所描述的方法适于通过在流感病毒B株基因组内引入一个或多个特异性突变来制备具有温敏表型、还可以具有减毒表型和/或冷适应表型的新型流感病毒B株。例如，将一个或多个能导致在下列位置上发生氨基酸取代的突变引入到流感病毒B株基因组中制备温敏 B 型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159 和 Ml183。典型的氨基酸取代包括:PB2630 (S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114(V114A)、NP41CI(P410H)、NP51CI(A510T)、M1159(H159Q)和 Ml183 (M183V)。
[0116]无论其制备方法如何，含有本发明的突变的流感病毒都是本发明的特征。也就是说本发明包括含有本发明的突变的流感病毒株，即在一个或多个下列位置上出现相对于野生型的氨基酸取代的任何A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或者在一个或多个下列位置上出现相对于野生型的氨基酸取代的任何B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159 和 Ml183，但是病毒株 ca A/Ann Arbor/6/60 和 B/AnnArbor/1/66不是本发明的特征。在某些优选的实施方式中，A型流感病毒含有一组(即2 个、3 个、4 个、5 个或更多个)如下突变:PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G) ;B 型流感病毒含有如下一组突变:PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP51CI(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。例如，除了提供具有与疫苗制备有关的表型的病毒以外，含有一组突变，如1、2、3、4或5个选择的突变，的病毒还可用于研究其他突变对病毒表型的影响。在某些实施方式中，流感病毒含有至少一个其他的非野生型核苷酸(可能导致其他的氨基酸改变)，这个核苷酸还可能赋予病毒期望的表型或对已有的期望表型进一步作出贡献。
[0117]细胞培养
[0118]病毒的增殖一般都是在培养宿主细胞的培养基中。适于流感病毒复制的宿主细胞包括Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、MDCK cells细胞和COS细胞，比如293T细胞、C0S7细胞。通常用上述两种细胞系的共培养物，如MDCK细胞与293T细胞或COS细胞以1:1的比例共培养以提高复制的效率。细胞一般在标准的商用培养基中培养，如添加血清(如10%胎牛血清)的Dulbecco改进的Eagle培养基，或无血清培养基，控制湿度和CO2的浓度以维持适宜的中性缓冲pH(即pH在7.0到7.2之间)。另外，培养基中还可以加入抗生素以防止细菌生长，如青霉素、链霉素等，还可以加入营养物质如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必须氨基酸、以及使细胞达到最佳生长状态的添加剂，如胰蛋白酶、β -巯基乙醇等。
[0119]培养哺乳动物细胞的方法已有很多报道，都是本领域技术人员所熟知的。通用的培养过程见下列文献的描述=Freshney(1983)动物细胞的培养:基本技术方法“(Culture of Animal C ells: Manual of Basic Technique), Alan R.Liss, New York ；Paul (1975)《细胞与组织培养》(Cell and Tissue Culture),第五版，Livingston,Edinburgh ；Adams (1980)《生物化学与分子生物学实验室技术一生物化学家适用的细胞培养〉〉(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culturefor Biochemists), Work 和 Burdon (编)，Elsevier, Amsterdam。有关在体外制备流感病毒的特殊组织培养方法的其他细节描述见Merten等，(1996) “在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗的制备” (Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation), Cohen 和 Shafferman (编)，《设计和制备疫苗的新策略》(Novel Strategiesin Design and Production of Vaccines),本文都已完整纳入作为参考。另外，对这些方法进行改动以适用于本发明也是很容易通过常规试验达到的。
[0120]用于制备流感病毒的细胞可在含血清的或无血清的培养基中培养。在某些情况下，如在制备纯化的病毒时，希望宿主细胞在无血清培养基中生长。细胞可以小规模培养，如在含25ml以下培养基的培养皿或培养瓶中培养，也可以在大培养瓶中，如在回旋瓶中振荡培养，或者在微载体微球(如DEAE-Dextran微载体微球,如Dormacel1、Pfeifer&Langen ；Superbead, Flow Laboratories ;苯乙烯共聚物-三-甲胺微球，如 Hillex, Solohill, AnnArbor)表面利用培养瓶或反应器培养。微载体微球是一种微小的球(直径在100-200微米范围内)，为单位体积细胞培养物中的粘附细胞的生长提供了一个较大的表面积。例如，I升培养基可包含2千万以上的微载体微球,提供的生长表面超过8000mm2。对于商业用途的病毒制备，如疫苗制备来说，通常在生物反应器或发酵罐内培养细胞。生物反应器的体积小到I升以下，大到100升以上，如Cyto3生物反应器(Osmonics, Minnetonka,MN) ;NBS 生物反应器(New Brunswick Scientific, Edison, N.J.);来自 B.Braun BiotechInternational (B.Braun Biotech, Melsungen, Germany)的实验室和商用规模的生物反应器。
[0121]在本发明中不论培养体积的大小，培养温度维持在35°C或以下是十分重要的，这样可以确保利用本文所描述的多质粒系统有效收获重组病毒和/或重排列病毒。例如，细胞在约32°C到35°C之间的温度下培养，一般在约32°C到34°C之间，最常用的是约33°C。
[0122]通常情况下用调节器如恒温器或其他能探测及维持细胞培养系统温度装置来确保在病毒复制期间温度不超过35°C。
[0123]载体导入宿主细胞
[0124]携带流感病毒基因组节段的载体按照本领域熟知的方法被导入(如转染)到宿主细胞内从而将异源核酸引入真核细胞内，这些方法包括钙磷酸盐共沉淀法、电穿孔、微注射、脂质体介导以及利用多胺转染试剂转染。例如，载体如质粒可以利用多胺转染试剂TransIT-LTl (Mirus)按照厂家的说明书导入到宿主细胞内，如COS细胞、293T细胞或者COS或293T细胞与MDCK细胞的混合物。约I μ g载体导入到宿主细胞群内需要约2 μ ITransIT-LTl，稀释到160 μ I培养基中，优选无血清培养基，总体积为200 μ I。DNA:转染试剂混合物在室温下孵育45分钟，然后加入800 μ I培养基。将转染混合物加入宿主细胞，然后按照上述方法培养。照此来计算，在细胞培养物中制备重组病毒或重排列病毒时，含有8个基因组节段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)的载体与约20 μ I TransIT-LTl混合并转染宿主细胞。另外，在转染前可用无血清培养基，如Opt1-MEM I替换含血清的培养基，然后孵育4-6小时。
[0125]另外，也可以用电穿孔方法将含流感病毒基因组节段的载体导入到宿主细胞内。例如，含A型流感病毒或B型流感病毒的质粒载体优选利用电穿孔方法导入到Vero细胞内，过程如下:收获5Χ106在添加10%胎牛血清(FBS)的改进的Eagle培养基(MEM)中生长的Vero细胞，重悬于0.4ml OptiMEM中，然后将细胞加入到电穿孔杯内。20 μ g DNA混合到25μ 1，然后加到含细胞的杯内，通过轻叩温和混匀。按照厂家的说明书(BioRad GenePulser II with Capacitance Extender Plus connected)进行电穿孔，参数为 300伏、950微法，持续时间28-33秒。通过温和敲打再混合细胞，电穿孔后约1-2分钟将0.7ml含10%FBS的MEM直接加入到小杯内。然后将细胞转移到标准6孔组织培养板的2个孔内，孔内含2ml MEM+ 10%FBS或无血清的OPT1-MEM。洗涤小杯以回收剩余的细胞，洗涤悬液分成两孔。终体积约为3.5。然后再适合病毒生长的条件下孵育细胞，即冷适应株在约33°C培养。
[0126]病毒一般从培养基中回收，感染(或转染)的细胞在培养基中生长。在浓缩流感病毒前一般要将粗分离的培养基澄清。常用的方法包括过滤、超滤、硫酸钡吸附和洗脱以及离心。例如，感染培养物中粗分离的培养基首先在1000-2000Xg离心足够时间进行澄清以去掉细胞碎片和其他的大颗粒物质，如离心10到30分钟。另外，培养基还可以用
0.8 μ m的醋酸纤维素滤器过滤以去除完整的细胞和其他大颗粒物质。另外，经澄清的培养基上清液还可以再离心以沉淀流感病毒，如15，000Xg离心约3-5小时。将病毒团重悬浮到合适的缓冲液，如 STE (0.01M Tris-HCl ；0.15M NACI ；0.0001M EDTA)或 ρΗ7.4 的磷酸盐缓冲液(PBS)中后，利用蔗糖(60%-12%)或酒石酸钾(50%-10%)密度梯度离心浓缩病毒。持续离心或分步骤离心都可以，如12%到60%之间的蔗糖梯度用4个12%步骤。梯度离心时要有足够的转速和时间以使病毒浓缩成可见的条带以便于回收病毒。另外，对于最大规模的商业用途来说，不用密度梯度离心而用持续模式的带状离心转子。下面文献中所描述的其他细节足以指导本领域的技术人员在组织培养物中制备流感病毒:Furminger, “疫苗制备” (Vaccine Production), Nicholson 等(编)，《流感病毒教科书》(Textbook ofInfluenza) 324-332页；Merten等，(1996) “在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗的制备，，(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation),Cohen和Shafferman(编)，《设计和制备疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design andProduction of Vaccines)，141-151页；以及美国专利5，690，937号。如果需要，回收的病毒还可以用蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)作为稳定剂置于-80°C保存。
[0127]预防用疫苗的使用方法和组合物
[0128]本发明的重组和重排列病毒可以混合在合适的载体或赋形剂内预防使用以刺激一个或多个流感病毒株特异性的免疫反应。载体或赋形剂通常都是药用载体或赋形剂，如无菌水、盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、甘油水溶液、乙醇、未感染的鸡蛋的尿囊液(即正常的尿囊液"NAF")或溶液的混合物。这种溶液要按照本领域已知的方法制备以确保无菌、合适的pH、等渗性及稳定性。载体或赋形剂一般选择能使变态反应或其他不良反应最小的,并且适合特定的给药途径,如皮下注射、肌肉注射、鼻内给药等。[0129]本发明的流感病毒一般都要给予足够的量以刺激一个或多个流感病毒株特异性的免疫反应。流感病毒的使用最好能激发保护性的免疫反应。激发抗一种或多种流感病毒株保护性免疫反应的剂量和方法是本领域技术人员所熟知的。例如，灭活的流感病毒的给药剂量约为1-1OOOHID5ci (人感染剂量)，即每个剂量内约含105_108pfu (噬菌斑形成单位)。另外，约10-50 μ g，如约15 μ g HA不添加佐剂给药，或者以更小的剂量添加佐剂给药。一般来说剂量在这个范围内可以根据年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间以及其他临床因素作出调整。预防性疫苗制剂可以用针头和注射器，或者无针注射装置皮下注射或肌肉注射系统给药。另外，疫苗制剂还可以利用滴剂、大颗粒气溶胶(大于10微米)鼻内给药，或者通过喷雾喷入上呼吸道。虽然上述给药途径都可以激发保护性的全身免疫反应，但是鼻内给药还有另外的优点，即可以在流感病毒进入部位激发粘膜免疫。对于鼻内给药来说，减毒活病毒疫苗通常是优选的，即减毒的、冷适应的和/或温敏流感病毒重组或重排列流感病毒。虽然利用单次剂量来刺激保护性免疫反应是优选的，但是通过相同的或不同的给药途径给予附加的剂量也可以达到预期的保护效果。
[0130]另外，通过体外或体内树突状细胞靶向性地与流感病毒相互作用也可以激发免疫反应。例如，增殖性的树突状细胞以足够的剂量和足够的时间与病毒接触可以使树突状细胞捕获流感病毒抗原。然后将细胞通过标准的静脉移植方法转移到被免疫的受试者内。
[0131]另外，保护性流感病毒或其亚单位的制剂还可以包含一种或多种佐剂以增强抗流感病毒抗原的免疫反应。适宜的佐剂包括:皂甙、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、杆菌卡介苗(BCG)、小棒状杆菌以及合成的佐剂QS-21和MF59。[0132]如果需要，预防性流感病毒疫苗还可以和一种或多种免疫刺激分子一同使用。免疫刺激分子包括各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，这些因子具有免疫刺激活性、免疫增强活性和原炎症因子活性，如白细胞机介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL_4，IL-12，IL-13);生长因子(如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF));以及其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配基、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可以和流感病毒在同一种制剂内，也可以和流感病毒分别给药。蛋白质或编码蛋白质的表达载体可以使用以产出免疫刺激效应。
[0133]在另一个实施方式种，本发明的含流感病毒基因组节段的载体可用于将异源核酸导入到宿主菌或宿主细胞内，如哺乳动物细胞，其中包括来源于人的细胞，并且与上述合适的药用载体或赋形剂联合使用。异源核酸通常被插入到基因或基因节段，如节段7的M基因的非必需区。异源多核苷酸序列编码多肽或肽，或者RNA，如反义RNA或核酶。然后通过制备携带异源核酸的重组病毒将异源核酸引入宿主或宿主细胞内，病毒按照上面所描述的方法使用。 [0134]另外，本发明的含异源核酸的载体可通过共转染的方式导入到感染流感病毒的细胞内并在宿主细胞内表达。然后还可以将细胞回输到受体内，一般是回输到细胞的来源部位。在某些应用方面，细胞可通过已有的细胞转移或移植方法移植到感兴趣的组织、器官或系统位点(如上所述)上。例如，造血细胞系的干细胞，如骨髓、脐带血或外周血来源的造血干细胞可通过标准转移或输注技术转移到受体内。
[0135]另外，含异源核酸的病毒也可以转移到受体体内的细胞内。这种方法一般包括将载体颗粒注射给靶细胞群(血细胞、皮肤细胞、肝细胞、神经(包括脑)细胞、肾细胞、子宫细胞、肌肉细胞、肠细胞、颈细胞、阴道细胞、前列腺细胞等；以及各种细胞、组织、器官来源的肿瘤细胞)。可通过静脉注射病毒颗粒系统给药，也可以通过各种方法，如注射(利用针头或注射器)、无针疫苗转移、局部给药或推入组织、器官或皮肤部位将病毒颗粒直接转移到目的部位。例如，病毒载体颗粒可通过吸入、口服、静脉注射、皮下注射、真皮下注射、真皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、气管内注射、阴道或直肠注射，或者通过在手术过程中将病毒颗粒置于身体的腔隙或其他部位转移。
[0136]上述方法可通过将本发明的含异源多核苷酸的载体引入体外或体内的靶细胞群用于治疗性和/或预防性治疗疾病或失调，其中异源多核苷酸编码治疗性或预防性多肽(或肽)或RNA (入反义RNA或核酶)。编码目的多肽(或肽)或RNA的多核苷酸一般都连接有上面“表达载体”部分和“其他表达元件”部分所描述的适当调节序列。另外，一个载体或病毒可以插入多个异源编码序列。例如，除了编码治疗性或预防性活性多肽或RNA外，载体还可以含有其他治疗性或预防性多肽，如抗原、共刺激分子、细胞因子、抗生素等，和/或筛选标记等。
[0137]本发明的方法和载体可用于预防或治疗多种疾病，包括遗传疾病和获得性疾病，如以疫苗的形式预防或治疗由病毒、细菌等引起的疾病。
[0138]试剂盒
[0139]为了便于使用本发明的载体和载体系统，任何载体，如含有流感病毒共有序列的质粒、含有突变的流感病毒多肽的质粒、流感病毒多肽文库质粒等，和用于包装和感染实验性或治疗性流感病毒的其他组分，如缓冲液、细胞、培养基都可以包装成试剂盒的形式。一般来说，除了上述组分外，试剂盒还包含其他材料，如使用本发明方法的说明书、包装材料以及容器。
[0140]病毒核酸和蛋白质的操作
[0141]在本发明的范围内，流感病毒核酸和/或蛋白质可按照已知的分子生物学技术操作。许多这种方法，包括扩增、克隆、突变、转化等的详细过程见下列文献的描述=Ausubel等，《当前的分子生物学操作技术》(2000年增补)(Current Protocols in MolecularBiology(supplemented through2000)) John ffiley&Sons, New York ("Ausubel")；Sambrook 等，《分子克隆一实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)
(第二版)，1_3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,1989 ("Sambrook")；以及Berger和Kimmel《分子克隆技术指导，酶学方法》，152卷，Academic Press, Inc., San Diego,CA(〃Berger〃)。
[0142]除了上述文献外，其他可用于扩增本发明的cDNA探针的体外扩增技术操作方法，如多聚酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qi3 -复制酶扩增以及其他RNA聚合酶介导的技术OnNASBA)可见于下列文献的描述=Mullis等，(1987)美国专利4，683，202号；《PCR 技术一方法和应用指导》(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)(Innis 等编)，Academic Press Inc.San Diego, CA(1990)(〃Innis〃)；Arnheim 和Levinson(1990)C&EN36 ；The Journal Of NIH Research(1991)3:81 ;Kwoh 等，(1989)ProcNatl Acad Sci USA86,1173 ;Guatelli等，(1990)Proc Natl Acad Sci USA87:1874 ；Lomell等，(1989)J Clin Chem35:1826 ;Landegren等,(1988)Science241:1077 ；Van Brunt(1990)Biotechnology8:291 ；ffu 和 Wallace(1989)Gene4:560 ；Barringer 等，(1990)Gene89:117以及Sooknanan和Malek, (1995) Biotechnology 13:563。其他可用于克隆本发明的核酸的方法见于Wallace等，5，426，039号。通过PCR扩增大片段核酸的改进方法见综述Cheng等，(1994)Nature369:6 84及其参考文献。
[0143]本发明的某些多核苷酸，如寡核苷酸可利用各种固相技术合成，其中包括单核苷酸-和/或三核苷酸亚磷酰胺耦合化学。例如，核酸序列可通过将活化的单体或三体顺序添加到延伸的多核苷酸链上来合成，见Caruthers, M.H.等，(1992)Meth Enzymol211:3。
[0144]除了合成所需要的序列以外，还可以从各个商家订购基本的核酸序列，如 Midland Certified Reagent Company(mcrcioligos.com), The Great AmericanGene Company(www.genc0.com), ExpressGen, Inc.(www.expressgen.com), OperonTechnologies, Inc.(www.0peron.com)等。
[0145]另外，取代病毒多肽上的指定氨基酸可通过位点特异性突变来实现。例如，含有在功能上与表型特征，如减毒表型、冷适应性、温敏流感病毒相关的取代的氨基酸的病毒多肽可通过将特异性的突变引入编码多肽的病毒核酸片段上来制备。位点特异性突变的方法是本领域熟知的，见上述Ausubel、Sambrook和Berger的描述。许多位点特异性突变试剂盒都可以买到，如Chameleon定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla),可按照厂家的操作说明书进行操作，将表6或表17中所描述的一个或多个氨基酸取代引入到编码流感病毒A或B多肽的基因组节段中。
实施例[0146]实施例l:pAD3000的构建
[0147]质粒pHW2000 (Hoffmann等，(2000) “用于从8个质粒开始制备流感病毒A的DNA转染系统，，(A DNA transfection system for generation of influenza A virus fromeight plasmids) Proc Natl Acad Sci USA97:6108-6113)经过改造,用猿病毒 40 (SV40)来源的多聚腺苷酸信号序列代替牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号。
[0148]SV40来源的序列用下列寡核苷酸通过Taq MasterMix (Qiagen)扩增，方向为5’到3’:
[0149]polyA.1:AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(SEQ IDNO:1)[0150]polyA.2:TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(SEQ IDNO: 2)
[0151]用质粒pSV2His作为模板。按照厂家的说明书用Topo TA cloningvector (Invitrogen)扩增出一个与预测一致的175bp产物,然后克隆到pcDNA3.1中。用EcoRV和BstEII将所需要的含SV40多聚腺苷酸信号的138bp的片段从所得到的质粒上切下，琼脂糖凝胶电泳分离，然后利用常规方法(见Ausubel, Berger, Sambrook)克隆到pHW2000的独特PvuII和BstEII位点上。所得到的质粒pAD3000 (图1)经测序发现含有SV40多聚腺苷酸位点并且方向正确。pAD3000上的核苷酸295-423相对于SV40株777(AF332562)上的核苷酸 2466-2594。
[0152]实施例2:制备MDV-A的8质粒系统
[0153]通常用冷适应性的A型流感病毒突变株A/AA/6/60作为主供体病毒制备鼻内给药的A型流感疫苗。这个病毒株在本发明中是典型的主供体病毒(MDV)。为了简化，本文将这个A/AA/6/60突变株命名为MDV-A。MDV-A病毒RNA用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)提取，8个相应的cDNA片段用表1所列引物通过RT-PCR扩增。
[0154]表1.用于克隆MDV-A8个节段的引物序列
[0155]
【权利要求】
1.人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，该病毒包含: 使PBl多肽具有391位为谷氨酸和581位为甘氨酸的突变，其中所述PBl多肽在氨基酸残基457位包含谷氨酸；和所述流感病毒具有温度敏感表型。
2.如权利要求1所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，其中所述PBl多肽具有661位为苏氨酸的氨基酸取代。
3.如权利要求2所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，PBl多肽中的氨基酸取代由391位为谷氨酸、581位为甘氨酸，和661位为苏氨酸构成。
4.如权利要求1-3任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，还包含一个或多个突变，导致在PB2多肽中包含265位为丝氨酸的氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，在PB2多肽中的氨基酸取代由265位为丝氨酸组成。
6.如权利要求1-5任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，还包含一个或多个突变，导致在NP多肽中包含34位为甘氨酸的氨基酸取代。
7.如权利要求6所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，在NP多肽中的氨基酸取代由34位为甘氨酸组成。
8.如权 利要求7所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于， PBl多肽中的氨基酸取代由391位为谷氨酸、581位为甘氨酸，和661位为苏氨酸构成； 在PB2多肽中的氨基酸取代由265位为丝氨酸组成； 在NP多肽中的氨基酸取代由34位为甘氨酸组成。
9.如权利要求1-8任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，其为6:2重排列A型流感病毒。
10.如权利要求1-9任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，在33°C的细胞培养物中的生长的病毒滴度比在39°C生长的同一细菌至少高41og1Q。
11.如权利要求1-10任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，所述病毒包含PR8多核苷酸。
12.如权利要求1-11任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，所述病毒具有减毒表型。
13.如权利要求12所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，所述A型流感病毒在雪貂减毒试验中比不包含所述氨基酸取代的病毒复制至少下降3.0个1g10O
14.如权利要求13所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，其特征在于，所述流感病毒在雪貂减毒试验中无法检测到其复制。
15.一种包含权利要求1-14任一所述的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒和运载体或赋形剂的组合物。
16.权利要求15所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备激发免疫反应的药物。
17.—种制备人工改造的重组或重排列的A型流感病毒的方法，所述方法包括: a)在A型流感病毒基因组中引入突变，所述突变得到包含391位为谷氨酸和581位为甘氨酸的氨基酸取代的PBl多肽，所述PBl多肽在457位包含谷氨酸； b)将一组载体导入到一群培养的宿主细胞内，所述载体对应于A型流感病毒基因组，多个载体包含a)中所述的突变； c)培养该群宿主细胞；以及 d)回收c)中的宿主细胞产生的人工改造的重组或重排列的A型流感病毒，所述A型流感病毒具有温度敏感表型。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中所述PBl多肽具有661位为苏氨酸的氨基酸取代。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，包括在A型流感病毒基因组中引入突变，所述突变导致PBl多肽中的氨基酸取代由391位为谷氨酸、581位为甘氨酸，和661位为苏氨酸构成。
20.如权利要求17-19任一所述的方法，其特征在于，还包含在A型流感病毒中引入一个或多个突变，导致在PB2多肽中包含265位为丝氨酸的氨基酸取代。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒基因组中的一个或多个突变导致在PB2多肽中的氨基酸取代由265位为丝氨酸组成。
22.如权利要求17-21任一所述的方法，其特征在于，还包含在A型流感病毒基因组中引入一个或多个突变，导致在NP多肽中包含34位为甘氨酸的氨基酸取代。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒基因组中的一个或多个突变导致在NP多肽中的氨基酸取代由34位为甘氨酸组成。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒基因组中的突变导致: 具有氨基酸取代由391位为谷氨酸、581位为甘氨酸，和661位为苏氨酸构成的PBl多肽； 具有氨基酸取代由265位为丝氨酸构成的PB2多肽；和 包含34位为甘氨酸的氨基酸取代的NP多肽。
25.如权利要求17-24任一所述的方法，其特征在于，所述重排列A型流感病毒为6:2重排列A型流感病毒。
26.如权利要求17-25任一所述的方法，其特征在于，在33°C的细胞培养物中的生长的病毒滴度比在39°C生长的同一细菌至少高41og1Q。
27.如权利要求17-28任一所述的方法，其特征在于，所述重组或重排列A型流感病毒包含PR8多核苷酸。
28.如权利要求17-27任一所述的方法，其特征在于，还包括在(d)后，在培养细胞或鸡蛋内通过传代扩增所述重组或重排列A型流感病毒。
29.如权利要求17-28任一所述的方法，其特征在于，所述培养细胞或宿主细胞独立选自Vero细胞、MDCK细胞、293T细胞和COS细胞。
30.如权利要求17-29任一所述的方法，其特征在于，所述突变通过定点诱变引入。
31.如权利要求17-30任一所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒具有减毒表型。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒在雪貂减毒试验中比不包含所述氨基酸取代的病毒复制至少下降3.0个log1(l。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述流感病毒在雪貂减毒试验中无法检测到其复制。
34.如权利要求17-33任一所述的方法，其特征在于，在低于或等于35°C的温度下培养细胞。
35.如权利要求17-34任一所述的方法，其特征在于， 还包括在步骤(d)后，将所述重组或重排列A型流感病毒与运载体或赋形剂混合。
36.人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，该病毒包含: 使NP多肽具有114位为丙氨酸和410位为组氨酸的突变，其中:所述NP多肽在氨基酸残基55位包含苏氨酸；和所述B型流感病毒具有温度敏感表型。
37.如权利要求36所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，其中所述NP多肽具有509位为苏氨酸的氨基酸取代。
38.如权利要求37所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，NP多肽中的氨基酸取代由114位为丙氨酸、410位为组氨酸，和509位为苏氨酸构成。
39.如权利要求36-38任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，还包含一个或多个突变，导致在PA多肽中包含至少一个选自431位为甲硫氨酸和497位为组氨酸的氨基酸取代。
40.如权利要求36-39任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，还包含一个或多个突变，导致在M多肽中包含至少一个选自159位为谷氨酰胺和183位为缬氨酸的氨基酸取代，其中所述B型流感病毒具有减毒表型。
41.如权利要求36- 40任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，还包含一个或多个突 变，导致在PB2多肽中包含至少一个630位为精氨酸的氨基酸取代。
42.如权利要求36-41任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，其为6:2重排列B型流感病毒。
43.如权利要求36-42任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，在33°C的细胞培养物中的生长的病毒滴度比在37°C生长的同一细菌至少高21og1Q。
44.如权利要求36-43任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，所述病毒衍生自B/Ann Arbor/1/66毒株。
45.如权利要求36-44任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，所述B型流感病毒在雪貂减毒试验中比不包含所述氨基酸取代的B型流感病毒复制至少下降 2.0-5.00 个 log1Q。
46.如权利要求45所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，其特征在于，所述B型流感病毒在雪貂减毒试验中无法检测到其复制。
47.一种包含权利要求36-46任一所述的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒和运载体或赋形剂的组合物。
48.权利要求47所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备激发免疫反应的药物。
49.一种制备人工改造的重组或重排列的B型流感病毒的方法，所述方法包括: a)在B型流感病毒基因组中引入突变，所述突变得到包含114位为丙氨酸和410位为组氨酸的氨基酸取代的NP多肽，所述NP多肽在55位包含苏氨酸； b)将一组载体导入到一群培养的宿主细胞内，所述载体对应于B型流感病毒基因组，多个载体包含a)中所述的突变； c)培养该群宿主细胞；以及d)回收c)中的宿主细胞产生的人工改造的重组或重排列的B型流感病毒，所述B型流感病毒具有温度敏感表型。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，包括在B型流感病毒基因组中引入一个或多个突变，得到包含509位为苏氨酸的氨基酸取代的NP多肽。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，包括在B型流感病毒基因组中引入突变，所述突变导致NP多肽中的氨基酸取代由114位为丙氨酸、410位为组氨酸，和509位为苏氨酸构成。
52.如权利要求49-51任一所述的方法，其特征在于，包括在B型流感病毒基因组中引入一个或多个突变，得到包含431位为甲硫氨酸和497位为组氨酸的氨基酸取代的PA多肽。
53.如权利要求49-52任一所述的方法，其特征在于，包括在B型流感病毒基因组中引入一个或多个突变，导致在M多肽中包含至少一个选自159位为谷氨酰胺和183位为缬氨酸的氨基酸取代，其中所述B型流感病毒具有减毒表型。
54.如权利要求49-53任一所述的方法,其特征在于，还包含一个或多个突变，导致在PB2多肽中包含630位为精氨酸的氨基酸取代。
55.如权利要求49-54任一所述的方法，其特征在于，所述B型流感病毒为6:2重排列B型流感病毒。
56.如权利要求49-55任一所述的方法，其特征在于，在33°C的细胞培养物中的生长的病毒滴度比在37°C生长的同一细菌至少高21og1Q。
57.如权利要求49-56任一所述的方法，其特征在于，所述病毒衍生自B/AnnArbor/1/66 毒株。
58.如权利要求49-57任一所述的方法，其特征在于，还包括在(d)后，在培养细胞或鸡蛋内通过传代扩增所述重组或重排列B型流感病毒。
59.如权利要求51-58任一所述的方法，其特征在于，所述B型流感病毒在雪貂减毒试验中比不包含所述氨基酸取代的B型流感病毒复制至少下降2.0-5.0个log1Q。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述B型流感病毒在雪貂减毒试验中无法检测到其复制。
61.如权利要求49-60任一所述的方法，其特征在于，在低于或等于35°C的温度下培养细胞。
62.如权利要求49-61任一所述的方法，其特征在于，所述培养细胞或宿主细胞独立选自Vero细胞、MDCK细胞、293T细胞和COS细胞。
63.如权利要求49-62任一所述的方法，其特征在于，所述突变通过定点诱变引入。
64.如权利要求49-63任一所述的方法，其特征在于， 还包括在步骤(d)后，将所述重组或重排列B型流感病毒与运载体或赋形剂混合。
【文档编号】C12N15/87GK103540568SQ201310364981
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2003年4月25日 优先权日:2002年4月26日
【发明者】E·霍夫曼, H·金, B·卢, G·杜克, G·W·坎宝 申请人:米迪缪尼有限公司