专利名称：一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌。
背景技术：
碱性蛋白酶(Alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类。碱性蛋白酶是多由芽孢杆菌发酵而得，主要成分是一种内切酶蛋白酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27kDa。国内工业生产蛋白酶菌株多是经枯草芽孢杆菌2709选育而来。通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。碱性蛋白酶广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业(郑环宇等，2003，大豆通报；夏良树等，1998，中南工学院院报)。碱性蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右(Mala B. R.等，1998, Microbiology andMolecular Biology Reviews);是目前市场上流行的洗漆添加剂,能大幅度提高洗漆去污能力，特别对血溃、汗溃、奶溃、油溃等蛋白类污垢，具有独特的洗涤效果。国内碱性蛋白菌的研究多集中于高产菌株的选育和鉴定(黄继翔，2011，微生物学通报；黄志强等，2006，福建农业大学学报)，以及发酵条件优化等(唐学明等，2002，生物工程学报)。目前，国内工业生产生产菌多由枯草杆菌2709选育而来；这些生产菌的缺点是发酵酶活较低(<35000U/ml);在后处理上，盐析沉淀后蛋白产品往往含有杂质较多并带有特别难闻气味。同时，梁晓梅等(2011，生物技术通报)试图通过构建了高通量筛选而克隆高活性蛋白酶基因。国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强，而且酶结构研究得也比较的深入(TsuyoshiN 等，2004，J. Biol. Chem.)。当前洗涤市场上的碱性蛋白酶被诺维信和杰能科两大酶制剂国际公司垄断，其产品酶活高，溶解速度快以及与洗涤剂配伍时耐受性强。国内酶制剂企业要扩大在洗涤酶领域的市场份额，必须加速开发出发酵酶活高、生产成本低的新型碱性蛋白酶，提高自身的竞争力。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌株。本发明通过将克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的碱性蛋白酶基因转入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中，构建得到枯草芽孢杆菌工程菌株。所述工程菌株能高效分泌表达碱性蛋白酶，为低成本、规模化生产碱性蛋白酶奠定了基础。本发明一方面涉及一种从克劳氏芽孢杆菌中分离的碱性蛋白酶，所述的碱性蛋白酶包括有1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的碱性蛋白酶；
2)在SEQ ID NO:1中限定的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有I)中碱性蛋白酶功能的，由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。上述的克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2。本发明还涉及用于表达上述的碱性蛋白酶的表达载体，所述的表达载体携带有序列为SEQ ID NO:2的编码基因。本发明另一个方面提供一种枯草芽孢杆菌工程菌，该工程菌携带有表达克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的碱性蛋白酶的表达载体；该枯草芽孢杆菌API (Bacillussubtilis API)，已于2012年12月5日保藏于位于武汉珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2012499。本发明另一方面涉及上述枯草芽孢杆菌工程菌的应用，用于生产碱性蛋白酶。本发明所述枯草芽孢杆菌工程菌株能高效表达碱性蛋白酶，酶活达到9120U/mL。 所述碱性蛋白酶的最适pH为12. O,最适温度为60°C,可广泛用作洗漆用品添加剂。
图1 :本发明所用的载体的遗传图谱。图2 :摇瓶发酵上清的SDS-PAGE检测电泳图，箭头所指处为重组表达的碱性蛋白酶。图3 :20L罐发酵的产酶曲线图。
具体实施例方式下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆1.1基因组DNA的提取TIAN GEN公司的TIANamp Bacteria DNA Kit制备克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。1. 2基因克隆以1.1中提取的基因组总DNA为模版，利用引物1:5’-TGGAGAAAGGGCGAAGACGAA-3’和引物 2 :5’ -CTACCATTTGATGAACGGAGC-3’ 进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为 98°C IOmin ；98°C 10s, 68°C 4min，30 个循环；72°C IOmin0 利用 Ε· Ζ. N. A. Gel Extraction Kit 回收PCR扩增产物。1. 3测序分析将1. 2中回收的扩增产物连接到TAKARA pMD18_T载体，相应的克隆载体命名为pT-aprE ;最后把阳性克隆送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析。测序结果显示PCR扩增无误，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3，序列经BLAST比对分析可知该基因编码碱性蛋白酶。实施例2碱性蛋白酶表达载体及工程菌的构建
2.1表达载体的构建根据SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，设计如下引物引物3 :5’ -ACGCGTCGACGATGAAGAAACCGTTGGGGAAA-3’ (Sail 酶切位点)引物4 :5，-ATTAGCAACGTGCATACCATTGTTCCCTGCC-3，引物 5 :5，-GGCAGGGAACAATGGTATGCACGTTGCTAAT-3 ’引物6 :5’ -ACATGCATGCGCGGTCTGTTCTCTTTTTCGA-3’ (SphI 酶切位点)以克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA为模版，利用引物3、引物4 PCR扩增碱性蛋白酶 结构基因起始密码子到内部SphI酶切位点之间的序列，得到片段aprE-U。PCR扩增条件为980C 10 min ；98°C 30 s，68°C I min，30 个循环；72°C 10 min。利用引物 5、引物 6 PCR 扩增碱性蛋白酶结构基因内部SphI酶切位点到终止子之间的序列，得到片段aprE-D。PCR扩增条件为 98°C10 min ；98°C 10 s，68°C I min，30 个循环；72°C 10 min。利用 Ε· Ζ. N. Α.Gel Extraction Kit 回收 aprE-U、aprE-D 片段。将aprE-U、aprE-D片段通过融合PCR获得融合片段aprE。融合PCR过程如下 第一轮，PCR反应体系中各加入200 ng的aprE-U、aprE-D片段，不加引物，PCR扩增10个循环，PCR 扩增条件为 98°C 10 min ；98°C 10 s，68°C 3 min，10 个循环；72°C 10 min。第二轮，取10 μ I第一轮PCR产物作为模板，利用引物3、引物6 PCR扩增30个循环，PCR扩增条件为 98°C 10 min ；98°C 10 s，68°C 2 min，30 个循环；72°C 10 min。利用 Ε· Ζ. N. Α.Gel Extraction Kit回收约1.1 kb的PCR产物,得到aprE片段。经测序,该aprE片段的核苷酸序列为SEQ ID NO :2，其编码氨基酸序列为SEQ ID Ν01ο多个测序结果都一致，证明没有出现扩增中的错误。将aprE片段Sail、SphI双酶切，同时对pWB980载体也进行Sail、SphI双酶切，利用 Ε. Z. N. A. Gel Extraction Kit 纯化后，用 T4 DNA Ligase 将 aprE/Sall/Sphl 与pffB980/SalI/SphI连接连接，将连接产物转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，得到阳性转化子，测序验证后，将获得的质粒命名为pWB980-protease,质粒图谱如图1所示。Bacillus subtilis 1A751利用感受态方法转化,转化具体过程如下将新鲜活化的Bacillus subtilis 1A751由LB (胰蛋白胨1%，酵母粉O. 5%，NaCl 1%)平板接种到5 mlGM I (GM I配制方法为:1*最低盐溶液95. 6ml，20%葡萄糖2. 5 ml，5%水解酪蛋白O. 4 ml,10%酵母粉汁Iml ;其中I*最低盐溶液的配制方法为=K2HPO4 14 g/L，KH2PO4 6 g/L，(NH4)2S04 2 g/L，柠檬酸三钠I g/L，MgS04*7H20 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解)溶液，在30°C、125 rpm振荡培养过夜。第二天取2 ml转接到18 ml GM I中，37°C、250 rpm培养3. 5 h。再取10 ml上一步骤的培养液转接到90 ml GM II (GM II配制方法为1*最低盐溶液96. 98ml，20%葡萄糖 2. 5 ml，5%水解酪蛋白 O. 08 ml，10%酵母粉汁O. 04 ml, I M MgCl2 O. 25 ml,
IM CaCl2 O. 05 ml)中，37°C、125 rpm 培养 90 min 后，5000 g、10 min 离心收集菌体。用10 ml原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在O. 5 ml感受态中加入适量DNA于37°C、200 rpm振荡培养30 min后涂布相应抗性平板(LB)，再在37°C培养过夜，次日检查和验证转化子。pWB980_protease转化Bacillus subtilis 1A751后获得的工程菌命名为枯草芽孢杆菌API (Bacillus subtilis API)，并于2012年12月5日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO: M 2012499。发酵结果表明保藏的重组菌株能够高效的表达碱性蛋白酶，发酵32小时碱性蛋白酶酶活约为9120U/ml。而且，多次传代后也能保证碱性蛋白酶的表达水平。实施例3发酵及酶学性质测定3.1酶活测定方法运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42. 4 8/1)，三氯乙酸(65.4 g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10. O g/L)。反应过程如下试管中加入Iml酶液，40°C温浴2min，加入酪蛋白溶液1ml，摇匀后40°C温浴IOminJPA 2ml三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止lOmin，慢速定性滤纸过滤。取Iml滤液，加碳酸钠溶液5ml,加福林试剂使用溶液Iml, 40°C显色20min,于680nm波长,用IOmm比色皿测定吸光度。
蛋白酶活力单位的定义为Ig固体酶粉(或I ml液体酶)，在一定温度和pH值条件下，Imin水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸，即为I个酶活力单位。3. 2摇瓶发酵从含25 μ g/ml卡那霉素的LB平板挑取Bacillus subtilis API单菌落接种于50ml种子培养基(酵母浸粉O. 5%，胰蛋白胨O. 5%，葡萄糖1%，K2HPO41. 8%，卡那霉素25 μ g/ml)中，34°C、210 rpm振荡培养8h。取2. 5ml接种到50ml发酵培养基(胰蛋白胨1%，酵母粉O. 5%，NaCll%)中，34°C、250rpm振荡培养48h，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，箭头所指处即为重组表达的碱性蛋白酶。3.3 20L 罐发酵从含25 μ g/ml卡那霉素的LB平板挑取Bacillus subtilis API单菌落接种于O. 6L种子培养基(酵母浸粉O. 5%，胰蛋白胨O. 5%，葡萄糖1%，K2HPO41. 8%，卡那霉素25 μ g/ml)中，34°C、210rpm振荡培养8h。将O. 6L种子培养液完全接种到含12L发酵培养基(胰蛋白胨1%，酵母粉O. 5%, NaCl 1%)的20L发酵罐中，34°C发酵培养44h发酵结束；其中发酵过程中，每4小时取样测定酶活。产酶曲线如图3所示，发酵32小时碱性蛋白酶酶活最高，约为9120U/ml。3. 2酶学性质分析(I)最适pH分析用pH值分别为7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0,12. 0,13. O的缓冲液，在温度40°C条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做PH-相对酶活曲线，结果表明本发明重组表达的碱性蛋白酶的最适pH为12. O。(2)最适温度分析分别在3o°c、4o°c、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc、9(rc，pH 10.5 的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果表明本发明重组表达的碱性蛋白酶的最适温度为60°C。 实施例4碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用取上述碱性蛋白酶发酵液浓缩至100000U/ml左右，加入一定量的化学稳定剂、防腐剂等，经溶解混合后，配制成液体蛋白酶制剂(具体组分见表I)。用标准方法(酪素福林试剂法)测定液体蛋白酶制剂存放一定时间后的酶活力(酶活保持率)，并目观察测其沉降情况，进行稳定性的评价。同时用国标方法测定液体酶制剂在液体洗涤剂中的洗涤去污值，比较其实际去污效果。表I液体碱性蛋白酶组分及含量
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I~碱性蛋白酶发酵液25 - 60^
2~碳酸I丐0-0.3^
3~硼酸或其衍生物O - 34~甲酸纳O - 10
5~多元醇5 - 30
6~山梨酸钾O.1 - O. 5将上述组分，在40°C温度下搅拌15-30分钟，充分溶解，混合均匀后，冷却至室温，即可制得一种稳定性较好的液体碱性蛋白酶制剂。将制得的液体酶制剂在40°C下存放30天后，观察发现该酶制剂溶液无沉降产生。经酶活力测试分析，其相对酶活力保持率仍在95%以上(测试标准轻工业行标QB/T1803-93《工业用酶制剂通用试验方法》)。同时，用该液体碱性蛋白酶制剂和市场竟争产品进行同等酶活(1000u/ml)加量条件下的去污值比较(测试标准国标GB/T 13174-2008《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》)。表2不同液体碱性蛋白酶在市售洗衣液中的去污值测定数据
I样品名称Iemp αιιθ Iemp Aii7
1蓝月亮洗衣液2g+1000u/ml本发明碱性蛋白酶8700Τδ3
2蓝月亮洗衣液2g+1000u/ml竞争产品碱性蛋白酶θΓθ 7^74
3蓝月亮洗衣液2g+2000u/ml竞争产品碱性蛋白酶77638 65
4国家标准洗衣液2g (不加蛋白酶)ΓΤ3TTl由表中的数据可看出同等酶活加量下，本发明的液体碱性蛋白酶对国际污布EMPAl 16及EMPA117上的去污效果要好于竞争产品碱性蛋白酶。本发明的工程菌重组表达的碱性蛋白酶作为洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血溃、汗溃、奶溃、油溃等蛋白类污垢，具有独特的洗涤效果。
权利要求
1.一种碱性蛋白酶，所述的碱性蛋白酶包括有 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的蛋白； 2)在SEQID NO:1中限定的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有O中碱性蛋白酶功能的，由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。
2.用于编码权利要求1所述的碱性蛋白酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQID N0:2。
3.用于表达权利要求1所述的碱性蛋白酶的重组表达载体；所述的重组表达载体携带有序列为SEQ ID NO:2的编码基因。
4.一种用于表达权利要求1所述的碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其保藏编号为CCTCC NO: M2012499。
5.权利要求4所述的枯草芽孢杆菌工程菌在生产碱性蛋白酶中的应用。
全文摘要
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌。本发明通过将克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的碱性蛋白酶基因转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，构建得到枯草芽孢杆菌工程菌株，保藏编号为CCTCC NO: M2012499。该工程菌株能高效表达碱性蛋白酶，20L罐发酵其酶活高达9120U/ml。本发明的重组表达碱性蛋白酶可广泛用作洗涤用品添加剂。
文档编号C12R1/07GK103013960SQ201210563540
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者黄亦钧, 齐建, 吴佳鹏, 陈亮, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司