专利名称：一种h3r高表达的重组hek293细胞构建方法
技术领域：
本发明属于重组细胞技术领域，涉及一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法。
背景技术：
组胺是一种人体自身成份的小分子胺类物质.它是由组氨酸脱羧酶作用于L-组氨酸而合成，组氨酸脱羧酶在整个机体细胞内均有表达，包括中枢神经系统神经元、胃黏膜壁细胞、肥大细胞及嗜碱粒细胞。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs),又称为七a螺旋跨膜蛋白受体(seven a-helices transmembrane segment receptors, 7TM receptors),是体内最大的蛋白质超家族。在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合G蛋白分子开关后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。组胺受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员，与其他单胺GPCR具有共同的保守序列。但序列同源性很低，在与组胺的亲和力上存在很大差异，通过偶联激活特异的G 蛋白进行信号转导。组胺受体3 (Histamine receptor3, H3R)H3R是突触前自身受体,调节组胺在神经元的合成与释放。H3R在体内分布广泛，主要分布在中枢神经系统，在周围组织中也有分布。H3R不仅参与脑内组胺的释放、合成与代谢，还能抑制N型、P型钙离子通道， 也参与调节脑内组胺(HA)、乙酰胆碱(Ach)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5 —羟色胺 (5-HT)、谷氨酸(Glu)、y-氨基丁酸(GABA)等多种神经递质和激素的合成或释放。具体的调节方式是H3R激动剂抑制组胺神经递质的释放而拮抗剂则促进递质的释放。过敏是指由免疫机制诱导的高敏反应。过敏可以是体液(抗体)或者是细胞免疫机制介导的。在大多数情况下，可产生过敏反应的抗体属于IgE类，这些个体可以归类于患有IgE-介导的过敏反应。然而，并非所有的"特异反应性"(atopy)个体都会发生与IgE 相关的"过敏反应。在非-IgE-介导的过敏反应中，抗体也可以属于IgG—类。实验表明， H3受体可能治疗过敏性鼻炎。组胺H3R拮抗剂被当作治疗老年痴呆症，ADHD (注意力缺陷多动症)，癫痫，焦虑症以及帕金森氏综合征等疾病的候选药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，能够作为筛选H3R阻断剂的细胞模型，为同H3R过敏相关的药物筛选建立细胞模型。为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含H3R全长基因的表达载体。
所述的H3R全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。所述的包含H3R全长基因的表达载体是PEZ-M02，该表达载体是真核表达载体。所述的H3R高表达的HEK293-H3R重组细胞应用于抗过敏药物筛选，应用是将H3R 高表达的HEK293/H3R重组细胞构建成细胞膜色谱柱，以保留时间为指示，筛选以H3R为靶点的抗过敏药物。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果I、本发明扩增了组胺受体3 (H3)的真核表达载体PEZ-M02/H3R，经过克隆测序证实序列同NCBI数据库中的人H3R序列一致；经过脂质体法转染HEK293细胞，G418抗性筛选获得能够稳定生长、存活的细胞株，经过Western blot,免疫荧光检测，筛选出稳定、高表达H3R的重组HEK293/H3R细胞株；本发明构建的包含H3R基因全长的重组HEK293/H3R细胞株能够稳定表达H3R，具有完整的分子结构。2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身还有的各种受体表达量相对较低，而重组后的HEK293/H3R细胞表达的H3R的相对表达量较HEK293空载明显升高，相对于其他细胞表面分子占据优势表达量， 处于特异配体结合优势地位，这样就大大提高了以H3R为药物筛选靶标的特异性及灵敏性。3、重组后的HEK293/H3R细胞表达的H3R利用Western blot技术检测表达量及免疫荧光技术检测其在细胞膜上的表达情况，显示细胞膜上有H3R表达，且比HEK293细胞表达量高，并体现出H3R的分子活性。4、由于重组细胞所表达的H3R的识别能力，而且H3R表达量足够，使得其与配体的结合能力成为其进行药物筛选的依据，可用于抗过敏中药活性成分及活性化合物的筛选。
图I是双酶切pEZ-M02/H3R电泳检测图谱。图2是经G418抗性筛选的阳性细胞培养图。图3_a是Western blot分析阳性细胞H3R表达量；图3_b是是对Western blot 结果灰度分析柱状图。 图4是免疫荧光分析H3R在HEK293/H3R细胞表达定位。
具体实施例方式下面结合附图和实施对本发明做详细描述。本发明在扩增H3R全长基因的真核表达载体pEZ-M02/H3的基础上，转染HEK293 细胞，获得稳定、高表达H3R的重组HEK293/H3细胞株，下面是对本方面做的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，包括以下步骤1)H3R基因克隆按照分子克隆实验指南制备大肠杆菌DH5 a感受态细胞，将10 y L的pEZ_M02/H3 质粒加入200 u L感受态细胞中，冰浴30min，42°C热激90s，加入IOmL的无氨苄青霉素抗
6性LB液体培养基，37°C振摇lh，3000rpm离心3min，将菌体沉淀吹打均匀，加入30mL的含有氨苄青霉素抗性(lOOmg/mL) LB固体培养基中，37°C过夜培养，挑取单克隆在含有氨苄青霉素抗性(100mg/mL) LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒获得高纯度质粒，菌液 PCR初步鉴定阳性克隆，结果如图I所示，并送金瑞斯生物科技公司进行测序，验证序列碱基，DNAstar Seqman进行序列拼接，得到的测序结果如SEQ. ID. NO. I所示，测序结果与基因库(NCBI)中比对，序列一致性为100%，含有正确序列即为pEZ-M02/H3表达载体。2)高表达H3重组HEK293细胞构建①使用Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectAMINE 2000进行转染常规培养HEK293细胞，在6孔板中接种3 X IO5细胞/孔，加入2mL完全培养基，置CO2孵箱中37°C 培养过夜，待细胞长至50-80%时进行转染；在无菌离心管中配制如下溶液溶液A :将5 ii g待转染的超纯DNA稀释到200 U L无血清培养基中；溶液B :将8 ii L LipofectAMINE稀释到200 U L无血清培养基中；混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15 45min ;用2mL无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0. SmL无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37°C孵育6h ;用完全培养基替换转染液，继续培养；HEK293细胞的筛选浓度为800 y g/ mL ;转染72小时后按I : 10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含G418的选择培养基；在6孔板内可见单个细胞，继续培养14天左右，可见单个细胞分裂增殖形成单个抗性集落，如图2所示；②有限稀释法抗性集落细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10_2 10_1(1)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，15天左右细胞长满整个孔，胰酶消化，传代至大瓶培养，反复冻存、培养细胞两次；3)高表达H3R重组HEK293鉴定①Western Blot :4°C条件下，将转染H3R、未转染的HEK293细胞，按I. 5 X IO6个细胞加入200 ii L细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂PMSF)的比例裂解细胞，加入50 ii L loading buffer，沸水浴lOmin，提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用PVDF膜完成全湿电转印，后用含5% (m/v)脱脂奶粉的TBST室温封闭转移后的PVDF膜，经TBST洗涤加经过5% (m/v) BSA的TBST稀释的特异性一抗与靶蛋白4°C过夜孵育，TBST洗涤3次后，再加5% (m/v) BSA 的TBST稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗，用ECL化学发光检测蛋白表达，检测HEK293/H3 细胞H3蛋白表达；经检测，如图3-a所示，H3-7，H3_8，H3-9为筛选的转染了 HEK293/H3的细胞克隆，PcDNA为转染空载的重组HEK293细胞，克隆H3_7，H3_8，H3-9的H3R表达量较克隆HEK293-pcDNA的表达量均有提高，而以克隆H3-8的H3R表达量最高JfWestern blot 的灰度分析结果表明，H3-8较阴性细胞HEK293的H3R的表达升高12倍；如图3_b所示；②免疫荧光分析H3表达定位取对数生长期的HEK293空载细胞和pEZ_M02/H3细胞，0. 25% (m/v)胰蛋白酶消化，按IX IO5个/孔左右接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24h细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次；4% (m/v)多聚甲醛(pH = 7. 4PBS溶解)ImL固定细胞15min后弃去；PBS轻柔洗涤细胞2次,加入ImL含I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBST孵育细胞 Ih ;用含 I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBST 以 I : 100 稀释兔抗人Hl多克隆抗体，加到盖玻片上，室温孵育2h ；PBS轻轻洗涤三次；每次5min ;用含1% (m/v)BSA的PBST以I 200稀释FITC标记山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室温避光孵育Ih ;于暗处，PBS洗涤三次，每次5min ;在载玻片上滴加90% (m/v)甘油封片，注意不要产生气泡。用荧光显微镜观察并拍照，结果如图4所示，图4-a、图4-d为DAPI分别染p-HlR 8和HEK293细胞核，蓝色荧光。图4_b、图4_e为cy-3分别染p-HIR 8和HEK293 细胞膜，红色荧光。图4-c、图4-f分别为p-HIR 8克隆和HEK293细胞核和细胞膜荧光叠加后的图谱。与J1EK293空载细胞相比，p-HIR 8细胞膜上有H3R的表达。
权利要求
1.一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，其特征在于重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含H3R全长基因的表达载体。
2.根据权利要求I所述的一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，其特征在于 所述的H3R全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示核苷酸序列表 〈110〉西安交通大学〈120〉一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法<160>1<210>1〈211>1338<212>DNA〈213〉人工合成<400>1ATGGAGCGCGCGCCGCCCGACGGGCCGCTGAACGCTTCGGGGGCGCTGGCGGGCGAGGCGGCGGCGGCGGGCGGGGCGCGCGGCTTCTCGGCAGCCTGGACCGCGGTGCTGGCCGCGCTCATGGCGCTGCTCATCGTGGCCACGGTGCTGGGCAACGCGCTGGTCATGCTCGCCTTCGTGGCCGACTCGAGCCTCCGCACCCAGAACAACTTCTTCCTGCTCAACCTCGCCATCTCCGACTTCCTCGTCGGCGCCTTCTGCATCCCACTGTATGTACCCTACGTGCTGACAGGCCGCTGGACCTTCGGCCGGGGCCTCTGCAAGCTGTGGCTGGTAGTGGACTACCTGCTGTGCACCTCCTCTGCCTTCAACATCGTGCTCATCAGCTACGACCGCTTCCTGTCGGTCACCCGAGCGGTCTCATACCGGGCCCAGCAGGGTGACACGCGGCGGGCAGTGCGGAAGATGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCTTCCTGCTGTACGGACCAGCCATCCTGAGCTGGGAGTACCTGTCCGGGGGCAGCTCCATCCCCGAGGGCCACTGCTATGCCGAGTTCTTCTACAACTGGTACTTCCTCATCACGGCTTCCACCCTGGAGTTCTTTACGCCCTTCCTCAGCGTCACCTTCTTTAACCTCAGCATCTACCTGAACATCCAGAGGCGCACCCGCCTCCGGCTGGATGGGGCTCGAGAGGCAGCCGGCCCCGAGCCCCCTCCCGAGGCCCAGCCCTCACCACCCCCACCGCCTGGCTGCTGGGGCTGCTGGCAGAAGGGGCACGGGGAGGCCATGCCGCTGCACAGGTATGGGGTGGGTGAGGCGGCCGTAGGCGCTGAGGCCGGGGAGGCGACCCTCGGGGGTGGCGGTGGGGGCGGCTCCGTGGCTTCACCCACCTCCAGCTCCGGCAGCTCCTCGAGGGGCACTGAGAGGCCGCGCTCACTCAAGAGGGGCTCCAAGCCGTCGGCGTCCTCGGCCTCGCTGGAGAAGCGCATGAAGATGGTGTCCCAGAGCTTCACCCAGCGCTTTCGGCTGTCTCGGGACAGGAAAGTGGCCAAGTCGCTGGCCGTCATCGTGAGCATCTTTGGGCTCTGCTGGGCCCCATACACGCTGCTGATGATCATCCGGGCCGCCTGCCATGGCCACTGCGTCCCTGACTACTGGTACGAAACCTCCTTCTGGCTCCTGTGGGCCAACTCGGCTGTCAACCCTGTCCTCTACCCTCTGTGCCACCACAGCTTCCGCCGGGCCTTCACCAAGCTGCTCTGCCCCCAGAAGCTCAAAATCCAGCCCCACAGCTCCCTGGAGCACTGCTGGAAGTGA 。
3.根据权利要求I所述的一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，其特征在于 所述的包含H3R全长基因的表达载体是PEZ-M02，该表达载体是真核表达载体。
4.根据权利要求I所述的一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，其特征在于 所述的H3R高表达的HEK293-H3R重组细胞应用于抗过敏药物筛选，应用是将H3R高表达的 HEK293/H3R重组细胞构建成细胞膜色谱柱，以保留时间为指示，筛选以H3R为靶点的抗过敏药物。
5.根据权利要求I至4任一权利要求所述的一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，其特征在于包括以下步骤1)H3R基因克隆按照分子克隆实验指南制备大肠杆菌DH5 a感受态细胞，将10 ii L的pEZ_M02/H3质粒加入200 u L感受态细胞中，冰浴30min，42°C热激90s，加入IOmL的无氨苄青霉素抗性LB 液体培养基，37°C振摇lh，3000rpm离心3min，将菌体沉淀吹打均匀，加入30mL的含有氨苄青霉素抗性(100mg/mL)LB固体培养基中，37°C过夜培养，挑取单克隆在含有氨苄青霉素抗性(lOOmg/mL) LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒获得高纯度质粒，菌液PCR初步鉴定阳性克隆，并送金瑞斯生物科技公司进行测序，验证序列碱基，DNAstar Seqman进行序列拼接，得到的测序结果如SEQ. ID. NO. I所示，测序结果与基因库(NCBI)中比对，序列一致性为100%，含有正确序列即为pEZ-M02/H3表达载体；2)高表达H3重组HEK293细胞构建①使用Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectAMINE2000进行转染常规培养 HEK293细胞，在6孔板中接种3 X IO5细胞/孔，加入2mL完全培养基，置CO2孵箱中37°C培养过夜，待细胞长至50-80%时进行转染；在无菌离心管中配制如下溶液溶液A :将5 ii g待转染的超纯DNA稀释到200 u L无血清培养基中；溶液B :将8 ii L LipofectAMINE稀释到200 u L无血清培养基中；混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15 45min ;用2mL无血清培养基轻轻洗涤细胞， 加入0. SmL无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中 37°C孵育6h ;用完全培养基替换转染液，继续培养；HEK293细胞的筛选浓度为800 u g/mL ； 转染72小时后按I : 10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含G418的选择培养基；在 6孔板内可见单个细胞，继续培养14天左右，可见单个细胞分裂增殖形成单个抗性集落；②有限稀释法抗性集落细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10_2 10_1(1)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，15天左右细胞长满整个孔，胰酶消化，传代至大瓶培养， 反复冻存、培养细胞两次；3)高表达H3R重组HEK293鉴定①Western Blot :4°C条件下，将转染H3R、未转染的HEK293细胞，按I. 5X IO6个细胞加入200 u L细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂PMSF)的比例裂解细胞，加入50 u L loadingbuffer，沸水浴lOmin，提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用PVDF膜完成全湿电转印，后用含5% (m/v)脱脂奶粉的TBST室温封闭转移后的PVDF膜，经TBST洗涤加经过5% (m/v) BSA的TBST稀释的特异性一抗与靶蛋白4°C过夜孵育，TBST洗涤3次后，再加5% (m/v)BSA 的TBST稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗，用ECL化学发光检测蛋白表达，检测HEK293/H3 细胞H3蛋白表达；经检测，H3-7，H3-8，H3-9为筛选的转染了 HEK293/H3的细胞克隆，pcDNA 为转染空载的重组J1EK293细胞，克隆H3-7，H3-8，H3-9的H3R表达量较克隆HEK293_pcDNA 的表达量均有提高，而以克隆H3-8的H3R表达量最高JfWestern blot的灰度分析结果表明，H3-8较阴性细胞HEK293的H3R的表达升高12倍；②免疫荧光分析H3表达定位取对数生长期的HEK293空载细胞和pEZ_M02/H3细胞，0.25% (m/v)胰蛋白酶消化，按IX IO5个/孔左右接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24 h细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次；4% (m/v)多聚甲醛(pH =7. 4 PBS溶解)ImL固定细胞15min后弃去；PBS轻柔洗涤细胞2次,加入ImL含I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBST孵育细胞 Ih ;用含 I % (m/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBST 以 I : 100 稀释兔抗人Hl多克隆抗体，加到盖玻片上，室温孵育2h ；PBS轻轻洗涤三次；每次5min ;用含 I % (m/v) BSA的PBST以I : 200稀释FITC标记山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室温避光孵育Ih ;于暗处，PBS洗涤三次，每次5min ;在载玻片上滴加90% (m/v)甘油封片，注意不要产生气泡。
全文摘要
一种H3R高表达的重组HEK293细胞构建方法，重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含H3R全长基因的表达载体，包含H3R全长基因的表达载体是pEZ-M02，该表达载体是真核表达载体，H3R高表达的HEK293-H3R重组细胞应用于抗过敏药物筛选，提取真核表达载体pEZ-M02/H1R质粒，进而以其转染HEK293细胞，利用G418筛选得到高表达全长H1R的基因工程细胞系HEK293-H3R，并证实该细胞系可将全长H3R的表达提高12倍。
文档编号C12N15/85GK102604990SQ20121004236
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月23日 优先权日2012年2月23日
发明者张涛, 王嗣岑, 贺浪冲, 韩省力, 黄静 申请人:西安交通大学