专利名称：抗mn抗体和使用它们的方法
抗MN抗体和使用它们的方法本申请为分案申请，其原申请的申请日为2006年12月12日，申请号为 200680052716. X(国际申请号PCT/US2006/047445)，名称为“抗MN抗体和使用它们的方法”。引用参考本申请要求2005年12月12日提交的美国临时专利申请No. 60/749，716的权利。前述申请，以及其中引用的所有文献和其中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)，以及在本文引用的文献中所引用或参考的所有文献，连同用于本文提到的或本文参考引入的任何文献中提到的任何产品的任何厂商使用说明、说明书、产品说明书和产品插页，都因此而引入本文作为参考，并且可以被用于实施本发明。
背景技术：
I.发明领域本发明涉及对MN蛋白有特异性的抗体和/或其片段。本发明进一步涉及抗体和 /或免疫缀合物组合物以及它们治疗、预防和/或诊断MN相关病症例如癌症的用途。2.背景癌症的发生最常见地是与衰老相关联的，所有癌症新病例的65%都是在年龄65 岁及以上的患者中记录到的。癌症是美国第二大主要死亡原因，仅次于心脏病。实际上，美国癌症学会已经预计，假定目前的死亡率保持恒定，美国四分之一的人将死于癌症。仅仅在美国，2006年就预期有1，399，790个癌症新发病例和564，830个癌症死者。这些新发病例的大多数都可以预期是结肠癌(106，680)、肺癌(172,570)和乳腺癌(214，640)。而且，预计癌症的发病率和流行都将在未来十年增加大约15%，反映出I. 4%的平均增长率(美国癌症学会，2006)。MN是一种最近鉴别到的肿瘤相关抗原，它是细胞表面蛋白，已经发现它在许多临床癌中表达。例如，已经发现MN在100%的肾细胞癌(Liao，SY, Cancer Res.，1997，57 2827-2831)、100% 的食管癌(Turner JR, Hum. Pathol.，199，28 :740-744)、超过 90 % 的宫颈癌(Liao, SY, Cancer Res.，1997，57 :2827-2831)、76 % 的恶性结肠癌(Saarnio, J. et al.，Am. J. Path.，1997，153 :279-285)、80% 的非小细胞肺癌(Vermylen P. et al.，Eur. Respir. J.，1999，14 :806-811)和 48% 的乳腺癌(Chia SK et al.，J. Clin. Oncol.，2001， 19 =3660-3668)中异常表达。象其它肿瘤相关抗原一样，丽蛋白也存在于少数正常组织细胞上，包括例如胃、胆管粘膜和位于小肠中的高度增殖的正常细胞(Saarnio J. et al.， J.Histochem. Cytochem.，1998,46 :497-504)。已经克隆并测序了人类 MN cDNA(Pastorek, et al. , Oncogene, 1994,9 2877-2888)。预测的蛋白由信号肽、蛋白聚糖相关序列、碳酸酐酶结构域(碳酸酐酶IX或 CA IX)、跨膜区段以及短的胞内尾组成。碳酸酐酶IX结构域催化二氧化碳可逆水合为碳酸。 该活性可能在调节肿瘤环境的胞外部分的局部酸化方面具有作用，这可能因此而导致蛋白酶的激活以及最终的转移。
也已经研究了 MN表达的调节。一方面，例如，MN表达被缺氧所上调。被称为缺氧诱导因子-I (HIF-I)的转录复合物是丽表达的调节剂。因此，丽被称为HIF-I应答基因，它牵涉到对缺氧的肿瘤应答的理解(Wykoff CC et al. ,Cancer Res.，2000，60 :7075-7083)。 此外，丽表达与肿瘤缺氧水平相关，并且是宫颈癌的总体存活和无转移存活的预后指示 (Loncaster, JA et al.，Cancer Res.，2000，60 :7075-7083)。MN 表达也与高的平均血管密度、晚期癌阶段、头颈部癌的坏死程度(Beasley NJP et al.，Cancer Res. ,2001,61 5262-5267)、鼻咽癌的低存活(Hui EP et al.，Clin. Cancer Res.，2002，8 :2595-2604)、侵入性乳腺癌的肿瘤坏死、更高分级、阴性雌激素受体状态、更高的复发率和低存活(Chia SK et al.，J. Clin. Oncol. ,2001,19 :3660-3668)相关。因此MN抗原的表达与低存活预后和更闻分级的癌症相关。用于这些迅速发展的癌症的新的改进治疗方法，特别是靶向MN表达的那些方法， 将是非常期望的，这将代表现有技术的进步。同样地，本发明公开了新的抗体组合物及其免疫缀合物，它们在MN相关癌症的治疗、预防和/或诊断方面是有用的。发明概述本发明涉及结合到细胞表面蛋白MN上并且可用于治疗、预防和/或诊断癌症的抗体，例如单克隆抗体，或者抗体片段。本发明的抗体可进一步被缀合到细胞毒性试剂例如单甲基金抑素-E(monomethylauristatin-E)上,和/或与一种或多种另外的抗癌试剂共同给药或配制。本发明的抗MN抗体和免疫缀合物可用于本发明的方法中来治疗和/或诊断和/或监测癌症，例如实体瘤。一方面，本发明提供了抗体或抗体片段，或者包括抗体或抗体片段的组合物，其中抗体或抗体片段具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点。抗原结合位点可包括至少一个 ⑶R1、⑶R2或⑶R3，或者⑶Rl与⑶R2或⑶R3 —起，或者⑶R2与⑶Rl或⑶R3 —起，或者 CDR3与CDRl或CDR2—起，或者它们的任意组合。CDRl可选自SEQ ID NO =57,58,59,60, 61，62，77，80，81，86，87，88，89，98，99，104，107 和 108。CDR2 可选自 SEQ ID NO =63,64,65, 66，67，68，69，78，82，83，90，91，92，93，100，101，105，109 和 110。CDR3 可选自 SEQ ID NO: 70，71，72，73，74，75，76，79，84，85，94，95，96，97，102，103，106，111 和 112。本发明这个方面的⑶R序列也可包括与上面对每种⑶R1、⑶R2或⑶R3所述序列的任一序列具有优选高于大约80%序列同一性，更优选高于大约85%的序列同一性，还更优选高于大约90%的序列同一性，更加优选大约95%或者甚至大约99%的序列同一性，甚至达到大约100%的序列同一性的氨基酸序列。另一方面，抗原结合位点可具有重链可变区⑶R，其选自SEQ ID NO :57_85以及与 SEQ ID NO :57-85的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。抗原结合位点可具有轻链可变区⑶R，其选自SEQ ID NO :86-112以及与SEQ ID NO =86-112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。抗原结合位点也可选自一组特定⑶R序列，包括下面这些六种⑶R的组(a) [3ee9] SEQ ID NO : 57，63，70，89，93 和 97 ;(b)[3ef2]SEQ ID NO :58，64，71，107，109 和 111 ;(c)[le4]SEQ ID NO :59，65，72，107，109 和 111 ;(d) [3a4] SEQ ID NO :60,66，73，108，110 和 112 ;
(e)[3ab4]SEQ ID NO :61，67，74，87，91 和 95 ;(f)[3ahlO]SEQ ID NO :61，68，75，88，92 和 96 ;(g)[3bb2]SEQ ID NO :62,69,76，98，100 和 102 ；(h) [laal]SEQ ID NO :77,78,79，86，90 和 94 ；(i) [5a6] SEQ ID NO :80,82,84,99，101 和 103 ；以及(j) [5aa3]SEQ ID NO :81，83，85，104，105 和 106。抗原结合位点也可包括一组重链⑶R序列，其选自(a) [3ee9]SEQ ID NO :57,63 和 70 ；(b) [3ef2]SEQ ID NO :58,64 和 71 ;(c) [le4]SEQ ID NO :59,65 和 72 ；(d) [3a4] SEQ ID NO :60,66 和 73 ；(e) [3ab4] SEQ ID NO :61,67 和 74 ；(f) [3ahlO]SEQ ID NO :61,68 和 75 ；(g) [3bb2]SEQ ID NO :62,69 和 76 ；(h) [laal] SEQ ID NO :77,78 和 79 ；(i) [5a6] SEQ ID NO :80,82 和 84 ；以及(j) [5aa3]SEQ ID NO :81,83 和 85。抗原结合位点也可包括一组轻链⑶R序列，其选自(a) [3ee9]SEQ ID NO :89,93 和 97 ；(b) [3ef2]SEQ ID NO :107，109 和 111 ；(c)[le4]SEQ ID NO : 107，109 和 111 ;(d) [3a4] SEQ ID NO : 108，110 和 112 ;(e) [3ab4] SEQ ID NO :87,91 和 95 ；(f) [3ahlO]SEQ ID NO :88,92 和 96 ；(g) [3bb2]SEQ ID NO 98,100 和 102 ；(h) [laal] SEQ ID NO :86,90 和 94 ；(i) [5a6] SEQ ID NO 99,101 和 103 ；以及(j) [5aa3]SEQ ID NO : 104，105 和 106。还有另一方面，本发明提供了具有抗原结合位点的抗体或抗体片段，所述位点含有选自下组的一对重链可变区和轻链可变区(a)重链可变区SEQ ID NO :133和轻链可变区SEQ ID NO :134 ；(b)重链可变区SEQ ID NO :135和轻链可变区SEQ ID NO :136 ；(c)重链可变区SEQ ID NO :137和轻链可变区SEQ ID NO :138 ；(d)重链可变区SEQ ID NO :139和轻链可变区SEQ ID NO :140 ；(e)重链可变区SEQ ID NO :141和轻链可变区SEQ ID NO :142 ；(f)重链可变区SEQ ID NO :143和轻链可变区SEQ ID NO :144 ；(g)重链可变区SEQ ID NO :145和轻链可变区SEQ ID NO :146 ；(h)重链可变区SEQ ID NO :147和轻链可变区SEQ ID NO :148 ；⑴重链可变区SEQ ID NO :149和轻链可变区SEQ ID NO :150 ;以及
(j)重链可变区SEQ ID NO :151和轻链可变区SEQ ID NO :152。本发明的抗体或抗体片段能够以优选大约O. 15nM到大约50nM的离解常数结合到丽蛋白上。另一方面，本发明的抗体或片段是IgG抗体或IgG片段。抗体或片段也可以是 IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA 或 IgM 抗体、Fab 片段、F (ab，)2 片段、scFv 片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、生物特异性抗体、多特异性抗体或者嵌合抗体 (例如包括稼接到人或非人抗体结合区的人抗体支架，或者稼接到人或非人抗体结合区的非人抗体支架)。嵌合抗体可包括，例如，来自非人来源的抗体支架区，诸如来自牛、小鼠、美洲马它、骆§它或兔子。关于抗体工程化的更多信息可在文献中找到，例如Holliger和Hudson, Nature Biotechnology, (2005年9月)23 :1126-1136，将其引入本文作为参考。上述片段可从免疫球蛋白获得或者通过合适手段以片段形式产生，例如重组表达。本发明的抗体或抗体片段也可是人源化的，其中CDR序列或区域(例如CDR1、 CDR2、CDR3)可以是非人的，例如鼠的。本发明的抗体或抗体片段、或者包括抗体或片段的组合物可包括缀合到抗体或片段上的细胞毒性试剂。一方面，细胞毒性试剂是单甲基金抑素-E (MMAE)，然而，也提供了其它细胞毒性试剂，可包括例如MMAE的功能性类似物(例如单甲基金抑素-F)和其它细胞毒性试剂例如阿普立丁(aplidin)、氮杂尿苷、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替左米(bortezomib)、薯司他丁 _1、白消安、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱、10-轻基喜树碱、卡氮芥、塞来西布、苯丁酸氮芥、顺钼、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、葡糖苷酸柔红霉素、正定霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表阿霉素、炔雌醇、雌氮芥、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3'，5' -O-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟利坦、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、罗氮芥、氮芥、醋酸甲孕酮(medropiOgesterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、米托恩醌、光神霉素、 丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、强的松、甲基苄肼、紫杉醇、喷托他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷(taxanes)、紫杉醇、丙酸睾酮、沙立度胺、巯基鸟嘌呤、塞替哌、替尼泊苷、拓扑替康、尿喃唳氮芥、万河(velcade)、长春花碱、长春瑞宾、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹娃酶(onconase)、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、 美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素以及假单胞菌内毒素或者它们的组合。任意细胞毒性试剂也可包括它们的功能性类似物。本发明的组合物除了抗体和片段(带有或不带上述缀合的细胞毒性试剂)之外， 还可包括各种抗癌试剂，可包括例如博来霉素、多西他赛(肽帝索)、阿霉素、依达曲沙、 厄洛替尼(erlotinib)(特罗凯(Tarceva))、依托泊苷、非那雄胺(保列治)、氟利坦(氟他胺)、吉西他滨(健择(Gemzar))、吉非替尼(genitinib)(易瑞沙(Irresa))、醋酸性瑞林(诺雷德(Zoladex))、格雷西隆(凯特瑞(Kytril))、伊马替尼(imatinib)(格列卫 (Gleevec))、伊立替康(开普拓/开普拓沙(Camptosar))、奥丹西隆(枢复宁)、紫杉醇 (他克唑)、培加帕酶(培门冬酶)、盐酸毛果芸香碱(匹罗卡品)、卟吩姆钠(光敏素)、白介素_2(普罗白精)、利妥希单抗(rituximab)(利妥希玛(Rituxan))、拓扑替康(盐酸拓扑替康)、司徒曼布(赫赛汀)、特立平(Triapine)、长春新碱和长春瑞宾(诺维本)，或者它们的治疗性抗体或片段，或者抗血管生成试剂例如制管张素、贝伐单抗(bevacizumab) (阿瓦斯丁 ( Avastin ))、索拉非尼(sorafenib)(多吉美 ( Nexavar ))、杆抑素 (baculostatin)、癌抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-I抗体、抗Flt-I抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-i3、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、酰胺基三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马马司他、 戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、罗喹美克、沙立度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、阿卡丁(accutin)、 西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板第四因子或者米诺环素。另一方面，本发明进一步提供了通过给予治疗有效量的本发明的抗体和/或片段、或者包括本发明抗体和/或片段的本发明的组合物治疗MN相关病症的方法。MN相关病症可包括例如癌症，诸如实体瘤癌症。实体瘤可以位于或源自乳腺、呼吸道、肺、脑、生殖器、 消化道、结肠、泌尿道、肾、食道、子宫颈、眼、肝、皮肤、头部、颈部、甲状腺和甲状旁腺。另一方面，本发明提供了诊断以异常MN水平为特征的MN相关病症的方法，包括将疑似患病组织或细胞中的MN水平与相应健康组织或细胞中的MN水平进行比较，其中疑似患病组织或细胞中的异常MN水平表示存在MN相关病症，所述比较步骤进一步包括用本发明的抗体或抗体片段通过免疫分析检测患病组织和健康组织中的MN水平。在特定方面，本发明提供了诊断MN相关病症的方法，其中免疫分析包括步骤(a) 检测健康组织中的丽蛋白水平；(b)检测疑似患病组织中的丽蛋白水平；以及(C)比较 (a)和(b)的丽蛋白水平。与健康组织中的丽蛋白水平相比，疑似患病组织中的丽蛋白水平升高表示存在MN相关病症。本发明也提供了试剂盒，包括本发明的抗体或抗体片段，或者备选地，包括本发明的组合物，以及治疗MN相关病症或用于诊断MN相关病症的方法中使用试剂盒的一套说明书。这些和其它实施方案是下面的详细说明所公开的，或者由此是显而易见的并且是它所包括的。附图简述结合附图可以最好地理解通过实施例方式给出的以下详细说明，但是不打算将本发明仅仅限定到所描述的特定实施方案，其中图I图示了抗体互补决定区(CDR)的DNA序列；图2图示了抗体互补决定区(OTR)的蛋白序列；图3图示了特定抗体轻链和重链可变区的DNA序列，每一种都含有CDR和构架区这两者；图4图示了特定抗体轻链(VL)和重链(HL)可变区的蛋白序列，每一种都含有CDR 和构架区这两者；图5图示了本发明的丽抗体的丽结合性质；图6图示了通过用抗丽抗体温育所产生的肿瘤细胞对丽包被平板的粘附的抑制；
图7图示了在含有MaTu肿瘤的异种移植模型中的体内抗肿瘤活性，这是通过用含有抗MN单克隆抗体le4的免疫缀合物处理而产生的；图8图示了 FACS测定抗丽抗体对PC3mm2细胞系的结合，该细胞系在其表面上表达丽蛋白；图9示意性图示了抗体缀合物(缀合到MMAE上的抗丽抗体)；图IOa显示了 FACS图谱，图示了 3ee9/MMAE结合MN+ (MaTu)细胞但不结合 MN-(DLD)细胞；图IOb显示了 FACS图谱，图示了 1E4免疫缀合物结合MN+(PC3mm2)细胞但不结合 MN-(DLD)细胞；图IOc显示了 FACS图谱，图示了 Iaal免疫缀合物结合MN+(PC3mm2)细胞但不结合MN-(DLD)细胞；图Ila显示了免疫荧光照片，图示了 MN+细胞导致的3ee9/MMAE的内化，而MN-细胞没有导致内化。内化的3ee9/MMAE显示为荧光；图Ilb显示了免疫荧光照片，图示了 MN+细胞导致的1E4免疫缀合物的内化，而 MN-细胞没有导致内化。内化的1E4免疫缀合物显示为荧光；
疫沉淀
图12显示了免疫印迹，图示了 MN抗体导致的生物素化细胞表面蛋白的特异性免
图13a用图表描述了 3ee9/MMAE对MN+细胞而不对MN-细胞有细胞毒性；
图13b用图表描述了 1E4免疫缀合物对MN+细胞而不对MN-细胞有细胞毒性；
图13b用图表描述了 Iaal免疫缀合物对MN+细胞而不对MN-细胞有细胞毒性； 图14显示了免疫荧光照片，图示了通过微管蛋白抑制产生的3ee9/MMAE对正常
纺锤体形成的抑制；
效；
效；
效；
图15用图表描述了 3ee9/MMAE对MaTu异种移植物的抗肿瘤功效；
图16用图表描述了 1E4免疫缀合物对已证实的MaTu乳腺肿瘤的抗肿瘤功效；
图17用图表描述了 Iaal免疫缀合物对MaTu异种移植物的抗肿瘤功效；
图18用图表描述了 3ee9/MMAE对MaTu异种移植物的治疗指数(TI)；
图19用图表描述了 3ee9/MMAE和没有MMAE时对HT-29异种移植物的抗肿瘤功
图20用图表描述了按照Q7Dx2方案，3ee9/MMAE对HT-29异种移植物的抗肿瘤功
图21用图表描述了按照QlDxl方案，3ee9/MMAE对HT-29异种移植物的抗肿瘤功
图22用图表描述了 3ee9/MMAE对PC3mm2异种移植物的抗肿瘤功效；
图23用图表描述了 3ee9/MMAE对Colo-205异种移植物的抗肿瘤功效；
图24用图表描述了 3ee9/MMAE对HCT-15异种移植物的抗肿瘤功效；
图25用图表描述了 3ee9/MMAE对MN-(左侧图)和MN+(右侧图)MIAPaca2异种移植物的抗肿瘤功效；图26a和26b用图表描述了 3ee9/MMAE联合希罗达⑧在不同剂量下对 Colo-205CRC异种移植物的抗肿瘤功效；
图27显示了免疫荧光照片，图示了 3ee9在huMN_MIAPaca2和MIAPaca2肿瘤中的体内定位；以及图28显示了免疫荧光照片(组织样品)，图示了两种剂量的3ee9/MMAE对 HT-29CRC异种移植物中微管蛋白聚合的抑制。图29显示了哺乳动物表达载体3ee9H+JCMVua)E8 (见实施例21)的插入区的全部核苷酸序列，该载体编码人IgG抗MN抗体，该抗体包括分别为SEQ ID NO :126和125的κ和重链CDR可变区，该载体获自载体3ee9pM0RPHx9 (见实施例1-3)。SEQ ID NO 1530发明详述要明白的是，本文所述的本发明并不被限定到涉及本发明任意方面的本文提供的特定细节，包括所描述的抗丽抗体、免疫缀合物、治疗方法、实验方案、细胞系、动物种或属、构建体以及试剂，同样也可以变化。也要明白的是，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案，并不打算限定本发明的范围。定义除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的意义。然而，下面的参考文献能够提供本发明所属技术领域的技术人员许多本发明中使用的术语的一般定义，只要这些定义与现有技术中所通常理解的意义一致，都能够参考并使用。这些参考文献包括但不限于Singleton et al. , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2d ed. 1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed. ,1988) ；Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991) jPLackie et al.,The Dictionary of Cell & Molecular Biology(3d ed. 1999) jPCellular and Molecular Immunology,Eds. Abbas,Lichtman and Pober, 2nd Edition, ff. B. Saunders Company。可以参考本领域普通技术人员所能获得的任何其它的技术资源，其中提供了具有本领域所通常理解意义的本文所使用术语的定义。对于本发明来说，进一步定义以下术语。另外的术语在说明书的其它地方定义。如本文中以及所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数含义，除非上下文另外明确规定了其它意思。这样，例如，在谈到“一个基因”时，就是指一个或多个基因，包括本领域技术人员已知的它们的等价物，等等。本文所使用的术语“抗体”包括免疫球蛋白分子(例如任何类型包括IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA 和 IgY，和 / 或任意亚型包括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)，它们是从天然分离的或者通过重组方式制备的。抗体的含义也包括结合抗原的抗体片段，诸如Fab、 (ab，)2、cFv (单链Fv)、Fv、单链抗体、双抗体(diabodies)、二硫键连接的Fv (sdFv)以及包含\或Vh结构域的片段，它们是由完整免疫球蛋白制备的或者通过重组方式制备的。本发明的抗体和/或结合抗原的抗体片段可以是单特异性的(例如单克隆抗体)、双特异性的、三特异性的或者更多特异性的。多特异性抗体可以是特异于抗原的不同表位或者可以是特异于多种抗原的表位。参见例如PCT公开文本WO 93/17715 ；W0 92/08802 ；W0 91/00360 ；W092/05793 ；Tutt, et al. , 1991, J. Immunol. 147 :6069 ;美国专利No. 4，474，893 ；4, 714，681 ；4, 925，648 ；5, 573，920 ；5, 601，819 ；Kostelny et al.，1992， J. Immunol. 148 :15471553,每一篇都引入本文作为参考。结合抗原的抗体片段可包含单独的可变区或者同时包含以下区域的整体或部分铰链区、CHU CH2、CH3和CL结构域。本发明也包括这样的抗原结合的抗体片段，即它们也包含可变区与铰链区、CHI、CH2、CH3和CL结构域的任意组合。优选地，抗体或结合抗原的抗体片段是人的、人源化的、鼠的(例如小鼠和大鼠)、 驴的、绵羊的、兔的、山羊的、豚鼠的、马的或者鸡的。本文使用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，以及包括分离自人免疫球蛋白文库、人B细胞或者对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的动物的抗体，如下文所述，例如在Kucherlapati等的美国专利No. 5，939，598中。术语抗体也延伸到其它蛋白支架，它们能够将抗体⑶R插入物定位成天然抗体中所发现的同样的活性结合构象，以致于用这些嵌合蛋白所观察到的靶抗原结合相对保持了这些⑶R所来源的天然抗体的结合活性。本文使用的术语非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分都是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的的超变区残基(例如互补决定区“CDR”)被非人物种的抗体(供体抗体)的超变区残基 (CDR)所替换，非人物种的抗体是来自诸如小鼠的、大鼠的、兔的或非人灵长类的具有期望的特异性、亲和性和结合能力的抗体。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基可以被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体可以基本上包含至少一个或典型地两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的超变区相应于非人免疫球蛋白的那些并且全部或基本上全部的FR都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体也可任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的。综述参见Jones， et al. , (Nature 321 :522-525,1986) ；Reichmann, et al. , (Nature 332 :323-329,1988)； 以及Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596,1992)。人源化抗体的制备可在美国专利 No. 7，049，135,6, 828，422,6, 753，136,6, 706，484,6, 696，248,6, 692，935,6, 667，150、 6，653，068,6, 300，064,6, 294，353和5，514，548中找到，每一篇都引入本文作为参考。本文使用的术语“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V1^P'结构域，其中这些结构域是以单链多肽存在的。通常，Fv多肽还包含V1^P'结构域之间的多肽接头， 它能够让sFv形成适合抗原结合的期望结构。综述参见Pluckthun(The PharmacoloRY of Monoclonal Antibodies，Vol. 113，Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315，1994)，将其完整引入本文作为参考。术语“双抗体”是指带有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含在同一多肽链(Vh-')中连接到轻链可变结构域(')上的重链可变结构域(Vh)。通过使用足够短的而不会导致同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链上的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述在例如EP 404, 097 ；W0 93/11161;以及 Hollinger, et al. , (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448,1993)中，每一篇都引入作为参考。术语“线性抗体”是指现有技术例如Zapata, et al. , (Protein Eng. 8 (10) 1057-1062,1995)中描述的抗体，将该文引入作为参考。简要地说，这种抗体含有一对串联 Fd区段(Vh-ChI-Vh-ChI),形成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。本文使用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均质的抗体中获得的抗体，也就是包含同一群体中的个体抗体，除了可以少量存在可能的天然突变。单克隆抗体是高度特异性的，也就是针对单一抗原位点。而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂不同的是，每个单克隆抗体只针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示了从基本上均质的抗体群中获得的抗体的特征，不要理解为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler，et al.， (Nature 256 =495,1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利No. 4，816，567。单克隆抗体也可使用例如Clackson, et al. , (Nature 352 624-628,1991)和 Marks, et al.，(J. Mol. Biol. 222 :581-597,1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离到。本文的单克隆抗体也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或者属于特定抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源，而链的其它部分与源自另一物种或者属于另一抗体类型或亚型的抗体，以及这种抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们显示出期望的生物学活性(参见例如美国专利No. 4，816，567 ;以及Morrison， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855，1984，每一篇都引入作为参考)。本文使用的术语“生物样品”或本文使用的“患者样品”是指获自生物或生物组分 (例如细胞)的样品。样品可以是任何生物组织或流体。样品可以是“临床样品”，它是源自患者的样品。这些样品包括但不限于痰、血液、血清、血浆、血细胞(例如白细胞)、组织样品、活组织检测样品、尿、腹膜液、以及胸膜液、唾液、精液、乳腺渗出液、脑脊液、泪液、粘液、 淋巴液、胞质溶胶、腹水、羊水、膀胱冲洗液、以及支气管肺泡灌洗液或其中的细胞，连同其它体液样品。患者样品可以是新鲜的或冷冻的，可以用肝素、柠檬酸盐或EDTA处理。生物样品也可包括组织切片诸如用于组织学目的的冷冻切片。术语“癌”包括但不限于实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈部癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌以及它们的远处转移。 该术语也包括肉瘤、淋巴瘤、白血病和浆细胞骨髓瘤。乳腺癌的例子包括但不限于侵入性导管癌、侵入性小叶癌、导管原位癌和小叶原位癌。呼吸道癌的例子包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的例子包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤，小脑和大脑星形细胞瘤，髓母细胞瘤，室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肿瘤。雄性生殖器肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌。雌性生殖器肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫肉瘤。消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、 胰腺癌、直肠癌、小肠癌、以及唾液腺癌。泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、以及尿道癌。眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的例子包括但不限于肝细胞癌(带有或不带纤维层状变异的肝细胞癌)，胆管癌(肝内胆管癌)，以及混合型肝细胞胆管癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌，卡波西肉瘤，恶性黑素瘤，梅克尔细胞(Merkel cell)皮肤癌，以及非黑素瘤皮肤癌。头颈部癌包括但不限于喉癌 /下咽癌/鼻咽癌/ 口咽癌，以及唇癌和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，何杰金氏病，以及中枢神经系统淋巴瘤。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维性组织细胞瘤，淋巴肉瘤，以及横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病,慢性粒细胞白血病，以及毛细胞白血病。本发明中使用的术语“表位”意指抗原上的任何抗原决定簇，例如MN蛋白，抗体通过抗原结合位点结合到它上面。决定簇或抗原决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链这些分子的化学活性表面基团所组成，通常具有特殊的三维结构特征以及特殊的电荷特征。术语“特异性免疫反应性”是指抗体和蛋白、化合物或抗原之间的结合反应，所述蛋白、化合物或抗原具有由抗体的抗原结合位点所识别的表位。该结合反应是在蛋白和其它生物物质的混合群体的存在之中存在具有识别的表位的蛋白、抗原或表位的决定因素。 在免疫分析情况下，特异性免疫反应性抗体可结合具有识别的表位的蛋白，即使结合样品中存在的没有表位的蛋白，也是在可检测的更低程度上结合。在体内情况下，“特异性免疫反应性”可指这样的条件，在此条件下动物形成针对疫苗或抗原的免疫应答，例如对抗原的体液应答(针对免疫反应性条件下所呈递疫苗、蛋白、化合物或抗原的抗体的产生)或细胞介导的应答(也称为“细胞免疫应答”，也就是通过T淋巴细胞介导的针对所呈递疫苗、蛋白、化合物或抗原的应答)。本文使用的术语“免疫反应性条件”是在免疫分析情况下或体外反应中使用的，其中提供或调节了反应的物理条件以便能够将关联抗体结合到抗原上，这些物理条件包括例如温度、盐浓度、pH、试剂及其浓度、以及抗原和对抗原有特异免疫反应性的关联抗体的浓度。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的模式，典型地是免疫分析实验方案中所利用的那些。参见 Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York,对于免疫分析模式和条件的描述。本文使用的术语“患者”或“受试者”包括哺乳动物(例如人和动物)。技体本发明涉及结合丽的抗体。这些抗体对于各种治疗和诊断目的可能是有用的。本领域技术人员一般都将理解的是，抗体选择性和结合亲和力的最关键决定因素是互补决定区(⑶幻的序列和由此产生的构象。大多数抗体含有六个⑶R，重链可变区(VH) 中三个，轻链可变区(VL)中三个。VH和VL中的CDR之间的间插序列是定使CDR定向的构架区。CDR共同形成了抗体中的抗原结合位点。已经在抗体人源化和抗体优化方法中对这些CDR在决定抗体功能性质方面的关键作用进行了长期探索。在前一方法中，将来自单克隆抗体例如小鼠抗体的CDR转移到相似构架设计的人抗体中，从而产生具有同样功能性质的但是在人体中的免疫原性减弱的抗体。根据已经成功商业化为人体治疗剂的人源化抗体的数量，该方法的成功是明显的，这些治疗剂包括赫赛汀 (司徒曼布，Genentech, Inc. , South San Francisco, CA)、 Synagis (palivizumab, Medimmune, Inc. , Gaithersburg, MD)、 Campath (alemtuzumab，Genzyme Oncology, Cambridge, MA)、 Zenapax (daclizumab，Roche Pharmaceut i c I as, Nutley, NJ)、 Xolair (omalizumab, Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)、 Raptiva (efalizumab，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)、 阿瓦斯丁 (贝伐单抗，Genentech，Inc.，South San Francisco, CA)以及 Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth-Ayerst，Madison，NJ)。其它例子已经描述于 Singer， et al.，(J. Immunol,150 :2844-2857,1993) ;Luo，et al.，(J. Immunol Meth. , 275 :31-40, 2002);以及 Kostelny，et al.，(Int. J. Cancer93 ;556_565，2001)中。
抗体优化方法集中于通过CDR序列的特殊改变来改善抗体选择性或结合亲和力。 在抗体开发领域中所公认的是，CDR编码治疗和诊断用途所需的结合亲和力和选择性，也可使用这些⑶R来将这些期望的功能性质赋予给大范围的各种备选抗体构架，这可以使用本领域技术人员已知的标准程序进行。也可能通过将抗体CDR架接到其它具有免疫球蛋白样折叠的蛋白上以转移抗体结合活性，所述蛋白诸如免疫球蛋白超家族中的其它蛋白以及具有与免疫球蛋白相似的折叠的非免疫球蛋白(Nicaise, et al. , Protein Science 13 1882-1891,2004)。本发明打算包括任何已知的或合适的用于制备本发明的抗体和结合抗原的抗体片段的技术。例如，噬菌体展示技术对于获得本发明的高亲和力抗丽抗体或结合抗原的抗体片段来说是有用的，它们用于诊断和/或治疗MN相关病症诸如MN相关癌症的用途中。被称为亲和力成熟的技术采用诱变或者CDR步移和重选择，其使用MN抗原来鉴别以比初始抗体或亲本抗体更高的亲和力结合抗原的抗体(参见例如Glaser et al. , 1992, J. Immunologyl49 :3903)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸产生了氨基酸突变的半随机文库。可构建由一组变体克隆所组成的文库，每一克隆都在单个CDR中相差单个氨基酸改变，并且这些克隆包含代表了每个CDR残基的每个可能氨基酸取代的变体。可通过与含有标记抗原的固定化突变体相接触来筛选对抗原的结合亲和力增加的突变体。可使用本领域已知的任何筛选方法来鉴定对抗原的亲和力增加的突变抗体(例如ELISA)(参见Wu et al.，1998，Proc Natl. Acad. Sci. USA 95 :6037 ；Yelton et al.，1995，J. Immunology 155 1994，引入作为参考)。也可使用CDR步移来随机化轻链(参见Schier et al.，1996，J. Mol. Bio. 263 :551，引入作为参考)。在特定实施例中，MorphoSys AG(德国)提供了可用于产生全人抗体的嗷菌体-抗体技术。Morphosys HuCAL GOLD文库提供了许多优于该技术早期版本的改进(Knappik， et al. , J. Mol. Biol. 296 :57-86，2000，引入作为参考)，包括 Rauchenberger，et al.， (J. Biol. Chem. 278 :38194-38205，2003，引入作为参考)所描述的 HuCAL-Fab I 文库。象早期版本一样，HuCAL GOLD加入了人抗体设计，其描述人共有构架序列和模拟天然人序列多样性的⑶R可变性模式。然而，HuCAL GOLD中的多样性延伸到了包括六种抗体⑶R。而且， 通过CysDisplay 特征增加了高亲和力抗体的回收(Kretzschmar and von Ruden, Curr. Opin. Biotechnol. 13 :598_602，2002)。用该技术产生的抗体显示了免疫原性可能性的极大降低。嗷菌体展示技术，诸如可从Morphosys获得的那些，是本领域已知的，可进一步参考 Boehncke WH et al.，Br J Dermatol. (2005)，Nov ；153 (5) :1092 ；Simon Moroney et al.，Modern Biopharmaceuticals ;编者 J. Knaeblein，Wiley-VCH Verlag(2005) ；alf Ostendorp et al·，抗体(Antibodies)，第 2 卷新技术和治疗用途(Novel technologies and therapeutic use)，p. 13-52，(2004)，Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York ；R. Rauchenberger et al.，J Biol Chem.，(2003)，Oct 3,278(40) :38194-38205 ； T. Kretzschmar et al. ,Curr Opin Biotechnol.，(2002),Dec,13(6) :598-602 ；Krebs B et al, J Immunol Methods，(2001)，Aug 1,254(1-2) ；M. Marget et al.，Tissue Antigens， (2000),56 l-9 ；A. Knappik et al.，J.Mol Biol. , (2000)，Feb 11,296(1) :57-86;以及A. Pliickthun et al. , Immunotechnology, (1997), Jun ；3 (2) :83-105,每一篇都整体引入本
文作为参考。作为例子，可以使用MorphoSys技术鉴别具有MN结合活性和细胞粘附中和活性的抗体。可将MN蛋白包被在微量滴定板上或者磁珠上，与MorphoSys HuCAL-GOLD Fab噬菌体文库保温。可将不结合MN的噬菌体连接的Fab从平板上冲洗掉，只留下结合MN的噬菌体。可通过加入硫醇还原试剂诸如二硫苏糖醇(DTT)导致连接抗体与噬菌体的二硫键裂解从而将结合的噬菌体洗脱下来。可以用表达结合MN的抗体片段的噬菌体富集所回收的噬菌体群，可以通过感染大肠杆菌宿主进行扩增。可以使用富集的噬菌体群重复该淘选过程以进一步富集结合MN的噬菌体连接的抗体群。然后可使用标准克隆技术将编码Fab的基因序列切下来，转移到表达载体，诸如细菌(例如大肠杆菌)表达载体或者哺乳动物表达载体中，将载体用来转化宿主细胞系，诸如CHO或大肠杆菌表达细胞系。然后就可以表达并纯化来自富集的集合的Fab。备选地，可以使用MN表达细胞作为抗原进行淘选。例如，可用生物素标记转染了 MN抗原的细胞。然后可将这些转染细胞与未标记的、未转染MN的细胞进行混合，标记的与未标记的比例为I : 10。将噬菌体文库加入到细胞中，生物素化，用结合了链霉亲和素的磁珠捕获带有MN的细胞，该磁珠被结合到磁铁上。将非特异性的噬菌体冲洗掉，通过去除磁场将带有MN的细胞特异性洗脱下来。然后可将这些特异性结合的噬菌体扩增，进行另外几轮的细胞淘选，或者可用肽和/或蛋白淘选代替。也可通过下述的其它各种技术来生产抗体。例如，获得抗体的另一方法是从B细胞中筛选DNA文库，如Dower，et al.，(W0 91/17271，引入作为参考)以及McCafferty，et al.，(W0 92/01047)(每一篇都整体引入作为参考)所述。在这些方法中，产生了噬菌体文库，其中的成员在其外表面上展示了不同抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。通过亲和富集选择噬菌体展示抗体，用于结合所选蛋白。在噬菌体展示方法的变型中，可生产具有所选鼠抗体结合特异性的人抗体(例如 WO 92/20791，引入作为参考)。在该方法中，可以使用所选鼠抗体(例如5C7. 29)的重链或轻链可变区作为起始材料。例如如果选择轻链可变区作为起始材料，就可构建噬菌体文库，其中的成员展示同样的轻链可变区(也就是鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区可从重排的人重链可变区文库中获得。选择对蛋白显示出强烈特异性结合(例如至少IOnM或至少InM)的噬菌体。然后将来自该噬菌体的人重链可变区用作构建进一步的噬菌体文库的起始材料。在该文库中，每个噬菌体都展示同样的重链可变区(也就是从第一个展示文库鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区可从重排的人轻链可变区文库中获得。再次选择显示出强烈特异性结合的噬菌体。作为另一个例子，也可使用三体瘤(trioma)方法生产抗体。基本方法和用于该方法中的例证性细胞融合配偶体SPAZ-4已经描述于Oestberg, et al. , (Hybridoma 2 361-367,1983 ;美国专利No. 4，634，664，每一篇都引入作为参考);以及Engleman，et al.， (美国专利No. 4，634，666，引入作为参考)。通过该方法获得的产生抗体的细胞系被称为三
体瘤，因为它们来自三个细胞-两个人细胞和一个小鼠细胞。最初，将小鼠骨髓瘤细胞系
与人B淋巴细胞融合以获得不产生抗体的异种杂交细胞，诸如SPAZ-4细胞系。然后将异种细胞与免疫过的人B淋巴细胞融合以获得产生抗体的三体瘤细胞系。已经发现三体瘤产生的抗体比由人细胞制备的普通杂交瘤更稳定。从人供体的血液、脾、淋巴结或骨髓中获得B淋巴细胞。通常不希望用蛋白对活的人体进行体内免疫，因为有引起有害应答的风险。因此，通常都是用蛋白(例如MN)或其抗原性片段或含有所述蛋白(如MN)的细胞在体外免疫B淋巴细胞。也可将基本上由结合例证性鼠抗体之一的氨基酸区段所组成的特定表位片段用于体外免疫。典型地将B淋巴细胞在培养基诸如补充10%人血清的RPMI-1640(参见美国专利No. 4，634，666)中暴露给抗原 7-14 天。也可将免疫过的B淋巴细胞通过本领域已知的方法融合到异种杂交细胞诸如 SPAZ-4上。例如，可用40-50%的分子量1，000-4, 000的聚乙二醇在大约37°C处理细胞大约5-10分钟。可从融合混合物中分离细胞，在选择期望杂种(例如HAT或AH)的培养基中增殖。可通过分析三体瘤培养基对蛋白(例如MN)结合的能力来鉴别可分泌具有所需结合特异性的抗体的克隆，使用的是与上述用于非人抗体同样的方法。可亚克隆能够产生具有期望特异性的人抗体的三体瘤，例如通过限制性稀释技术和在培养基中体外培养。尽管三体瘤是遗传稳定的，但是它们不可能产生极高水平的抗体。表达水平的增加可通过将抗体基因从三体瘤克隆到一种或多种表达载体中，并将载体转化到细胞系中， 诸如表达重组或人源化免疫球蛋白的细胞系。也可从非人转基因哺乳动物中生产与蛋白(例如MN)具有交叉反应性的人抗体， 该转基因哺乳动物具有编码人免疫球蛋白基因座至少一个区段的转基因。通常，这些转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座都是功能上灭活的。人免疫球蛋白基因座区段可包括重链和轻链组分的未重排序列。内源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的引入都可通过靶向的同源重组或通过引入YAC染色体来实现。由该方法产生的转基因哺乳动物能够功能性重排免疫球蛋白组分序列，表达由人免疫球蛋白基因编码的各种同种型抗体的所有组成成分，不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些性质的哺乳动物的生产和性质详细描述于例如 Lonberg，et al.，(W0 93/12227);以及 Kucherlapati，(W0 91/10741)(每一篇都整体引入作为参考)。可通过如上所述免疫转基因非人哺乳动物获得交叉反应性MN人抗体。单克隆抗体的制备可通过例如使用常规的Kohler-Milstein技术将来自这些哺乳动物的B细胞融合到合适的骨髓瘤细胞系中(Kohler and Milstein，Nature 256:495-497， 1975,引入作为参考)ο可使用各种免疫策略来获得与蛋白(例如MN)具有交叉反应性的小鼠或其它非人抗体。在一些策略中，可用MN抗原免疫非人动物(通常是非人哺乳动物诸如小鼠)。免疫原可包括稳定转染了 MN并在其细胞表面表达MN的细胞，以及MN蛋白或含有能够结合到例证性交叉反应性抗体上的这些分子的区段的表位片段。获自被免疫动物的产生抗体的细胞可被永生化，并选择用于产生特异性结合MN的抗体(例如Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, C. S. H. P.，N. Y.，1988，引入作为参考)。可以使用例如带有第二标记的适当二抗来检测结合。然后可进一步筛选交叉反应性抗体引导对表达MN的细胞的选择性细胞毒性的能力。本发明也涉及与所选小鼠或其它非人抗体具有相似结合特异性和亲和力的人源化抗体。人源化抗体的形成可通过重组DNA技术将非人抗体的⑶R区(例如⑶R1、⑶R2 和 CDR3)连接到人构架区和恒定区(例如 Queen, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029-10033,1989 ；W0 90/07861 ;每一篇都整体引入作为参考，也就是CDR稼接。这些人源
化免疫球蛋白具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变区构架残基和基本上来自小鼠免疫球蛋白(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区(CDR)。恒定区，如果有的话，也可基本上来自人免疫球蛋白。原则上，来自任何人抗体的构架序列都可用作⑶R稼接的模板。然而，已经证明直接在这种构架上进行⑶R替换经常会导致对抗原的结合亲和力的明显丧失(Glaser， et al. , J. Immunol. 149 :2606,1992) ;Tempest, et al. , Biotechnology 9 :266,1992 ； Shalaby，et al.，J. Exp. Med. 17 217,1992)。人抗体与最初鼠抗体的同源性越高，鼠CDR 与人构架的结合就越不可能在CDR中引入能够降低亲和力的畸变。因此，建议人源化抗体可变区构架与供体抗体可变区构架之间的同源性(即序列同一性百分比)优选至少大约 65%,更优选至少大约75%,还更优选至少大约85%,以及进一步更优选大约95%或大约 99%。重链和轻链可变区构架残基可源自相同的或不同的人抗体序列。然而，选自相同人抗体的重链和轻链构架序列降低了两条链组装不兼容的可能性。人抗体序列可以是天然存在的人抗体序列或者可以是几种人抗体的共有序列(例如WO 92/22653，引入作为参考)。根据对CDR构象和/或结合抗原的可能影响，可选择人可变区构架残基的某些氨基酸进行取代。这些可能影响的分析可通过模拟、检验特定位置的氨基酸性质，或者对特定氨基酸的取代或诱变功效进行经验性观察来实现。例如，当鼠可变区构架残基和所选人可变区构架残基之间的氨基酸不同时，人构架氨基酸就可被来自小鼠抗体的等效构架氨基酸所取代，这时可合理地预期该氨基酸(I)直接接触抗原，(2)在序列中与⑶R区相邻，或者(3)以其它方式与⑶R区相互作用(例如在⑶R区的4-6人之内)。其它取代候选物是例如在那个位置上对人免疫球蛋白来说是不常见的受体人构架氨基酸。这些氨基酸可用来自供体抗体的等同位置的氨基酸或来自更典型人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸进行取代。人源化免疫球蛋白可变区构架可显示出与人可变区构架序列或这些序列的共有序列例如至少优选大约85%的序列同一性，更优选至少大约90%的序列同一性，还更优选至少大约95%的序列同一性，以及更优选至少大约99%的序列同一性。本发明也涉及双特异性或双功能性抗体，它们具有特异性结合蛋白(例如MN)的一个结合位点以及特异性结合第二部分的第二结合位点。在双特异性抗体中，一个重链和轻链对通常来自例如MN结合抗体，另一对来自针对另一表位而产生的抗体。这产生了多功能性价，也就是同时结合至少两种不同表位的能力。结合分析描述本发明的抗体或抗体片段与本发明的抗原(MN蛋白)之间的结合强度(或亲和力)的任何有用方法都可以使用。例如，可通过本领域已知的标准动力学分析方法确定离解常数^!^ = !^/^ =[抗体][抗原]/[抗体-抗原复合物])。本领域普通技术人员将理解的是，离解常数指示了抗体和抗原之间的结合强度，它是依据分开复合物的容易程度。如果需要高浓度的抗体和抗原来形成复合物，结合强度或结合亲和力就低，产生较高的Kd。由此可见，Kd越小(表示为浓度单位，例如摩尔或纳摩尔)，结合就越强。可通过各种已知技术和免疫分析法分析和/或测定亲和力，包括例如酶联免疫特异性分析(ELISA)、双分子相互作用分析(BIA)(例如Sjolander and Urbaniczky, Anal. Chem. 63 :2338-2345,1991 ；Szabo, et al.，Curr.Opin.Struct. Biol. 5 :699-705,1995,每一篇都引入本文作为参考)以及用于定量抗体对表达丽的细胞的结合的荧光激活细胞分选(FACS)。BIA是用于实时分析生物特异性相互作用的技术，不标记任何反应物(例如BI Acor e )。BIAcore是基于确定生物分子之间，诸如本发明的抗体和丽蛋白抗原之间的实时反应中的光学现象表面等离子共振(SPR)。关于BIAcore技术的参考文献可进一步在美国已公布申请 No :2006/0223113、2006/0134800、2006/0094060、2006/0072115、 2006/0019313,2006/0014232和2005/0199076中找到，每一篇都整体引入本文作为参考。特异性结合蛋白(例如MN)的本发明的抗体或结合抗原的抗体片段提供了检测信号，例如，当与免疫化学分析中使用的其它蛋白提供的检测信号相比时，优选至少大约高5 倍、更优选至少大约高10倍、以及还更优选至少大约高20倍。同样地，这些抗体也可用于从溶液中免疫沉淀蛋白(例如MN)。可通过本领域已知的任何合适方法分析本发明的抗体和片段的免疫特异性结合 (或者本文所定义的“特异性免疫反应性”的结合)。涉及抗体和抗原的分析被称为“免疫分析”，在本发明中可使用来表征本发明的抗体和抗原。可使用的免疫分析，包括但不限于竞争性和非竞争性分析系统，使用的技术仅举几个例子诸如蛋白印迹、放射免疫分析、 ELISA(酶联免疫吸附分析)、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射分析、突光分析、蛋白A免疫分析。 这些分析方法是本领域常规的和公知的(参见例如Ausubel et al. , eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc. , New York,整体引入本文作为参考)，不需要过度实验就可进行。例证性的免疫分析在下文简要描述(但是不打算用限定的方式)。免疫沉淀实验方案通常包括在裂解缓冲液诸如补充了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA, PMSF、抑酶肽、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1% NP-40或Triton X-100， 1%脱氧胆酸钠，0. 1% SDS，0. 15M NaCl，pH 7· 2 的 0. OlM 磷酸钠，I % Trasylol)中裂解细胞群，将感兴趣的抗体加入到细胞裂解物中，在4°C保温一段时间(例如14小时)，将蛋白A 和/或蛋白G琼脂糖珠加入细胞裂解物中，在4°C保温大约一小时或更久，在裂解缓冲液中漂洗珠，将珠重悬浮在SDS/样品缓冲液中。感兴趣的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如蛋白印迹进行分析。本领域技术人员将明白能够修改以增加抗体对抗原的结合并降低背景的参数(例如预先清除带有琼脂糖珠的细胞裂解物)。关于免疫沉淀实验方案的进一步探讨参见例如 Ausubel et al. , eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc.，New York 第 10. 16. I,引入本文作为参考。蛋白印迹分析通常包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如8%、20% SDS-PAGE，根据抗原的分子量)中电泳蛋白样品，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙的膜上，在封闭液(例如带有3% BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，在漂洗缓冲液(例如PBS-Tween 20)中漂洗膜，用在封闭缓冲液中稀释的一抗(感兴趣的抗体)封闭膜，在漂洗缓冲液中漂洗膜；用在封闭缓冲液中稀释的缀合到酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或1251)上的二抗(它识别一抗，例如抗人抗体)封闭膜，在漂洗缓冲液中漂洗膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员将明白能够修改以增加检测信号并降低背景噪声的参数。关于蛋白印迹实验方案的进一步探讨参见例如 Ausubel et al. , eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc.，New York 第 10. 8. I,引入本文作为参考。ELISA典型地包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，将缀合到可检测化合物诸如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)上的感兴趣的抗体加入到孔中， 保温一段时间，以及检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的抗体不必缀合到可检测化合物上；而是可将缀合到可检测化合物上的二抗(它识别感兴趣的抗体)加入到孔中。此外，不用抗原包被孔，而是可将抗体包被到孔中。在这种情况下，可在感兴趣的抗原加入到包被的孔之后将缀合到可检测化合物上的二抗加入。本领域技术人员将明白能够修改以增加检测信号的参数，以及将明白本领域已知的其它ELISA变型。关于ELISA的进一步探讨参见例如 Ausubel et al., eds,1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc.，New York 第 11. 2. I,引入本文作为参考。一方面，本发明包括许多具有丽结合特性的不同抗体，它们是通过筛选 MorphoSys HuCAL GOLD Fab文库而鉴别到的。在本发明的一方面,鉴别到了人抗体VH区三个⑶R的氨基酸序列(SEQ ID NO :57-85 ;图2)。在本发明的另一实施方案中，鉴别了人丽抗体VL区的三个⑶R的氨基酸序列(SEQ ID N0:86-112，图2)。本发明也涉及⑶R、构架和VH/VL对的组合。这些组合的例子示于图3 (SEQ ID NO :113-132用于编码核酸序列) 和图4(SEQ ID NO :133-152用于蛋白序列)。具有丽结合性的抗体也示于图4中。筛选方法的细节在本文所述的实施例中描述。用于高活性特异性抗体或抗体片段的其它筛选方法是本领域技术人员可预见的，并用于鉴别人MN抗体。本发明的抗体和/或结合抗原的抗体片段也可从表达抗体的任何细胞中纯化得到，包括已经转染了编码抗体的表达构建体的宿主细胞。可将宿主细胞培养在抗体可表达的条件下。可使用本领域公知的方法将纯化的抗体和/或结合抗原的抗体片段与细胞中可能与抗体结合的其它细胞组分诸如某些蛋白、碳水化合物或脂分开。这些方法包括但不限于大小排阻层析、硫酸铵分级分离、离子交换层析、亲和层析和制备凝胶电泳。制剂纯度可通过本领域已知的任何手段进行分析，诸如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化抗体的制剂可含有一种以上的抗体(例如具有MN结合和中和特性的抗体)。备选地，抗体的生产可使用化学方法来合成它的氨基酸序列或抗体序列的一部分(诸如⑶R序列)，诸如通过使用固相技术指导肽合成(例如Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 :2149-2154,1963 ；Roberge, et al.，Science 269 :202_204，1995，每一篇都引入本文作为参考)。蛋白合成可使用手动技术或通过自动化来进行。自动合成可使用例如 Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现。任选地，抗体片段可单独合成并使用化学方法进行组合以产生全长分子。一旦例如通过本文描述的任一方法，例如包括通过抗体生产(例如动物免疫方法)、单克隆生产的常规方法或者通过重组DNA手段鉴别到或获得了根据本发明的抗体或片段，那么就可优选进行进一步的步骤来表征和/或纯化和/或修饰抗体。例如，制备免疫反应性抗体片段或者制备所鉴别的期望抗体的纯化的高滴度组合物，或者测试所鉴别抗体或其片段的免疫活性都是理想。本发明包括用于表征、纯化或分析本发明抗体的任何已知的和合适的方法，可以预期的是，本发明所属技术领域的普通技术人员将具有必需水平的技术知识和资源，例如技术手册或论文，以实现对本发明抗体的任何进一步的表征、纯化和 /或分析，而不需要过度实验。在特定方面，本发明的抗体和/或抗体片段可从重组细胞培养物中回收并纯化， 其通过公知的方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析以及凝集素层析。也可采用高效液相层析("HPLC")进行纯化。参见例如Colligan,Current Protocols in Immunology 或 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N. Y., (19972001)，例如第1、4、6、8、9、10章，每一篇都整体引入本文作为参考。在抗体情形下的术语“分离”是指本领域纯化抗体的任何已知方法。用于纯化抗体的方法是本领域公知的，本发明包括技术人员已知的且不需要过度实验的任何合适方法。 例如层析法，诸如免疫-亲和层析(固定化配体结合并捕获感兴趣的抗体)、亲和层析、蛋白沉淀、离子交换层析、疏水相互作用层析、大小排阻层析，以及电泳，它们都可在技术文献中找到描述，例如 Methods in Enzymology,第 182 卷,Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, 1st Edition, 1990,将其引入本文作为参考。这样，用于进行这些纯化步骤诸如层析步骤的合适材料都是本领域技术人员已知的。这些方法都适合于纯化根据如本文所述发明的任何抗体、抗原或其片段。某些实施方案可能需要从宿主细胞或其一部分中纯化或分离所表达的蛋白或抗体或其片段。用于从转化宿主细胞中分离重组蛋白的常规程序是本发明所打算包括的。这些方法包括例如分离感兴趣的蛋白或片段，其通过首先从细胞沉淀或从细胞培养基中提取，接着通过盐析，可使用一个或多个层析步骤，包括含水离子交换层析、大小排阻层析步骤，高效液相层析(HPLC)，以及亲和层析来分离重组蛋白或片段。用于蛋白纯化的程序指南可在技术文献中找到，包括例如Methods in Enzymology,第182卷，Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, 1st Edition, 1990,已经弓I入作为参考。可通过制备性高效液相层析充分纯化化学合成分子(参见例如Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles,ffH Freeman and Co. ,New York,N. Y.， 1983，引入本文作为参考)。合成多肽的组成可通过氨基酸分析或测序(例如使用Edman降解)来确认。多核苷酸另一方面，本发明涉及编码本发明的抗体(例如抗MN的抗体)或结合抗原的抗体片段的多核苷酸。这些多核苷酸可用于例如生产大量抗体用于治疗或诊断用途，或者生产抗体或片段的样品用于本发明的免疫分析用途。可用于编码例如抗体VH区中三种⑶R每一种的多核苷酸由SEQ ID N0:l_29所描述。可用于编码例如抗体VL区中三种⑶R每一种的多核苷酸由SEQ ID NO :30-56所描述。 编码例如抗体的完整重链和轻链可变区的多核苷酸由SED ID NO :113-132所描述(图3)。本发明的多核苷酸也可分离自宿主细胞，不存在根据现有技术中任何已知或合适方法的其它细胞组分诸如膜组分、蛋白和脂。可使用标准核酸纯化技术分离多核苷酸，或者使用扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCR)合成或通过使用自动合成仪合成多核苷酸。分离多核苷酸的方法是常规的，它们是本领域已知的。可以使用获得多核苷酸的任何这种技术来获得编码本发明抗体的分离的多核苷酸。例如，可使用限制酶和探针来分离编码抗体的多核苷酸。可使用mRNA作为模板，以标准分子生物学技术制备编码抗体的cDNA分子。然后， 可以复制cDNA分子，使用的是本领域已知的和手册诸如Sambrook, et al. , (Molecular Cloning A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Cold Spring Harbor,N. Y. ;1989，Vol. 1-3，引入本文作为参考)中披露的分子生物学技术。可以使用扩增技术诸如PCR来获得多核苷酸的其它拷贝。备选地，可使用合成化学技术来合成编码本发明抗体的多核苷酸。遗传密码的简并性使得能够合成备选核苷酸序列，它们将编码具有例如VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、 VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3、完整 VH 或完整 VL 氨基酸序列(例如 SEQ ID NO :57-112 和 133-152)之一的抗体。为表达编码抗体的多核苷酸，可将多核苷酸插入到含有转录和翻译所插入编码序列的必需元件的表达载体中。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有编码抗体的序列以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。这些技术描述于例如Sambrook, et al. (1989)和Ausubel, et al., (Current Protocols in Molecular Biology,Tohn Wiley & Sons,New York, N. Y. ,1995, 引入本文作为参考)中。可利用各种表达载体/宿主系统来包含和表达编码抗体的序列。它们包括但不限于微生物，诸如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；感染了病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV ;烟草花叶病毒，TMV);或者细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统，或者动物细胞系统。控制元件或调节序列是载体的非翻译区，即增强子、5’和3’非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用以执行转录和翻译。这些元件在强度和特异性方面可以不同。根据所采用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子诸如BLUESCRIPT噬菌粒 (Stratagene, LaJolla, Calif. )、pSPORTl 质粒(Life Technologies)的杂合 IacZ 启动子等等。在昆虫细胞中可使用杆状病毒多角体蛋白。可将源自植物细胞基因组(例如热休克蛋白、RUBISC0和贮存蛋白基因)的启动子或增强子或者源自植物病毒的启动子或增强子 (例如病毒启动子或前导序列)克隆到载体中。在哺乳动物细胞系统中，可使用来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子，例如CMV启动子。如果有必要产生包含编码抗体的核苷酸序列的多个拷贝的细胞系，就可以使用带有合适的选择标记的基于SV40或EBV的载体。因此，本发明也涉及包括本发明分离核酸分子(例如SEQ ID NO =113-132的重链和轻链可变区)的重组载体，用重组载体遗传工程化的宿主细胞，以及本发明重组抗体或其片段的生产和/或表达。表达构建体可进一步含有转录起始位点、终止位点以及位于转录区的用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可进一步包括开头的翻译起始密码子和恰当地位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，对于哺乳动物或真核细胞表达来说优选UAA和UAG0表达载体也可包括至少一种选择标记。这些标记包括但不限于哺乳动物细胞标记，诸如氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR)(参见例如美国专利No. 4，399，216 ； 4，634，665 ;4，656，134 ;4，956，288 ;5，149，636 和 5，179，017，每一篇都引入作为参考)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷胺酰胺合成酶(GS)(参见例如美国专利 No. 5，122，464 ;5，770，359 ;5，827，739，每一篇都引入作为参考)，以及细菌细胞标记，诸如四环素或氨苄青霉素抗性基因。用于上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员来说将是显而易见的。可以利用任何合适的已知方法来将本发明的DNA，例如含有SEQ ID NO =113-132 的一种或多种抗体编码序列的DNA载体引入到宿主细胞中。一些已知方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂介导的转染、电穿孔、转导、转染或者其它已知方法。 这些方法描述于现有技术中，诸如 Sambrook, et al.，(Molecular Cloning A Laboratory Manual, (Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Cold Spring Harbor, N. Y. ; 1989) Vol. 1-3，第 14、16 和 18 章)。本领域普通技术人员在可获得的用于表达编码本发明抗体或其部分的核酸的多种表达系统方面是了如指掌的。适用于生产本发明抗体或抗体片段的细胞培养物的例子是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统经常将是单层细胞的形式，尽管也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。现有技术中已经发展了多种能够表达完整糖基化蛋白的合适细胞系，包括CH0、CH0-S、 C0S-1 (例如 ATCC CRL 1650)、C0S-7 (例如 ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如 ATCC CRL-10)、CH0 (例如 ATCC CRL 1610)和 BSC-1 (例如 ATCCCRL-26)细胞系、Cos_7 细胞、CHO 细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8. 653、SP2/0_Agl4、293细胞、HeLa细胞等等，它们都很容易从例如美国典型培养物保藏中心获得。用于这些细胞的表达载体可包括一种或多种下列表达控制序列，例如但不限于复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(例如美国专利No. 5，168，062 ； 5，385，839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油激酶)启动子、EF-I α启动子(美国专利 No. 5，266，491)、免疫球蛋白启动子；增强子，和/或加工信息位点诸如核糖体结合位点、 RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T抗原聚腺苷酸添加位点)，以及转录终止子序列。适用于生产本发明核酸或蛋白的其它细胞是已知的，和/或可从例如美国典型微生物保藏中心细胞系和杂交瘤目录或者其它已知的或商业来源获得。当采用真核宿主细胞时，可将聚腺苷酸化序列或转录终止子序列引入载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。也可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40 (Sprague, et al. , J. Virol. 45 :773781 (1983))的 VPl内含子。此外，可将控制宿主细胞中的复制的基因序列引入到载体中，如现有技术中已知的那样。描述对本文有用的其它分子生物学技术包括抗体制备的通用文本包括Berger and Kimmel(Guide to Molecular CloninR Techniques, Methods in EnzymoloRY, Vol. 152, Academic Press,Inc.) ；Sambrook, et al. , (Molecular CloninR A LaboratoryManual, (Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Cold Spring Harbor, N. Y. ；1989)Vol. 1-3) ； Current Protocols in Molecular Biology, (F. M.Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (supplemented through 2000))； Harlow et al.，(Monoclonal Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed. ]) Fundamenta.1 Tmmunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998));以及Harlow, et al.，(Using Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)),所有的都引入本文作为参考。在另一实施方案中，本发明也涉及用定量免疫分析测定患者样品中的丽蛋白水平。为用在本发明的方法中，可对许多形式进行适应性改变。例如，患者样品中MN蛋白的检测和定量可通过酶联免疫吸附分析、放射免疫分析、双抗体夹心分析、凝集分析、荧光免疫分析、免疫电镜和扫描显微术进行，以及本领域通常已知的其它分析法。可通过本领域已知的常规方法对这些分析法中的MN蛋白定量进行适应性改变。在一个实施方案中，循环MN 蛋白水平的连续变化可通过夹心分析法检测和定量，其中使用常规技术将捕获抗体固定在支持物表面上。合适的支持物包括例如合成的聚合物支持物，诸如聚丙烯、聚苯乙烯、取代的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(诸如聚酰胺和聚氯乙烯)，玻璃珠，琼脂糖以及硝酸纤维素。可用在本发明方法中的ELISA夹心免疫分析法的例子是使用小鼠抗人丽单克隆抗体作为捕获抗体，生物素化的山羊抗人MN多克隆抗体作为检测抗体。捕获单克隆抗体被固定在微量滴定板的孔上。将稀释的血清/血浆样品或MN标准(重组野生型MN蛋白) 在孔中保温以使得MN抗原能够被捕获单克隆抗体结合。漂洗孔之后，将固定化的MN抗原暴露给生物素化的检测抗体，之后再次漂洗孔。然后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物。最后的漂洗之后，将TMB蓝底物加入到孔中以检测结合的过氧化物酶活性。通过加入2. 5N硫酸终止反应，测定450nm的吸光度。样品与MN标准的吸光度数值的关联能够确定血清或血浆中丽的以pg/ml为单位的定量值。适用于鉴别MN蛋白的抗体可以以任何常规方式进行标记。标记的例子是辣根过氧化物酶，标记抗体的方法的例子是通过使用生物素-链霉亲和素复合物。适当的时候，本发明的免疫分析中使用的用作示踪剂的抗体可以以任何方式进行直接或间接标记，从而产生可见的或能够变得可见的信号。可检测标记物质包括放射性核素，诸如3H、125I和131I ;荧光剂，诸如异硫氰酸荧光素和其它荧光染料、藻胆蛋白、藻红蛋白、 稀土金属螯合物、得克萨斯红、丹磺酰和罗丹明；比色试剂(色原)；电子不透性材料，诸如胶体金；生物发光剂；化学发光剂；染料；酶，特别是诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶；辅酶；酶底物；酶辅因子；酶抑制剂；酶亚基；金属离子；自由基；或者提供检测或测定所形成免疫复合物之存在或量的手段的任何其它免疫活性物质或惰性物质。酶底物组合的例子是辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)，以及碱性磷酸酶和磷酸对硝基苯酯(ρΝΡΡ)。根据本发明的其它检测和定量系统产生发光信号，其是生物发光(BL)或化学发光(CL)。在化学发光(CL)或生物发光(BL)分析中，测定密度或总发光，将其与未知分析物的浓度进行关联。可使用光度计(光电倍增管作为检测器)或电荷耦合器件定量测定光或者通过照相胶片或X-射线胶片定性测定光。使用这些分析法的主要优点在于它们的简单性和分析灵敏度，使得能够检测和/或定量极少量的分析物。例证性的发光标记是口丫唳锑酯(acridinium ester)，丫唳锑磺酰甲酰胺 (acridinium sulfonyl carboxamide),鲁米诺，伞形花内酯(umbelliferone),异鲁米诺衍生物，发光蛋白诸如水母发光蛋白以及来自萤火虫、海洋细菌、海荧属和海鳃属的荧光素酶。鲁米诺可任选与增强剂分子一起使用，诸如4-碘苯酚或4-羟基肉桂酸。典型地，通过用氧化剂在碱性条件下处理来产生CL信号。另外的发光检测系统是那些通过底物上的酶反应产生信号(可检测标记)的系统。已经发展了 CL和BL检测方案用于分析特别是碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、辣根过氧化物酶(HRP)和黄嘌呤氧化酶标记。AP和HRP是两种能够通过一系列CL和BL反应定量的酶标记。例如，AP可与底物诸如金刚烷基-1，2-二氧杂环丁烷芳基磷酸酯底物(例如 AMPPD 或 CSPD ；Kricka, L. J.，" Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis by, " Molecular Biology and Biotechnology A Comprehensive Desk Reference (ed. R. A. Meyers) (VCH Publishers ；N. Y. ,N. Y. ； 1995)) 一起使用；例如，4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)-螺-[1，2-二氧杂环丁乙烷_3，2’ -金刚烷] 的二钠盐，带有或不带增强剂分子诸如I-(三辛基鱗甲基)-4-(三丁基鱗甲基)_ 二氯苯。HRP可与底物诸如2’，3’，6’ -三氟苯基-甲氧基-10-甲基9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯一起使用。可适应性修改CL和BL反应，不但可用于分析酶，也可用于分析其它底物、辅因子、 抑制剂、金属离子等等。例如，鲁米诺、萤火虫荧光素酶和海洋细菌荧光素酶反应是分别用于过氧化物、ATP和NADPH的产生或消耗的指示剂反应。它们可与涉及氧化酶、激酶和脱氢酶的其它反应相偶联，可用于测定偶联反应的任何组分(酶、底物、辅因子)。可检测标记可直接或间接地连接到本发明分析法中所使用的抗体上。可检测标记的间接连接的例子是使用抗体和标记之间的结合对或者使用信号放大系统。可用于将抗体连接到可检测标记上的结合对的例子是生物素/抗生物素蛋白，链霉亲和素，或者抗生物素；亲和素/抗亲和素；甲状腺素/结合甲状腺素的球蛋白；抗原/抗体；抗体/抗抗体；碳水化合物/凝集素；半抗原/抗半抗原的抗体；染料和疏水分子/疏水蛋白结合位点；酶抑制剂，辅酶或辅因子/酶；多核酸/同源多核酸序列；荧光素/抗荧光素；二硝基苯酚/抗二硝基苯酚；维生素B12/内因子；可的松，氢化可的松/氢化可的松结合蛋白；以及特定受体蛋白/膜结合的特定受体蛋白的配体。用于将标记直接或间接连接到抗体的各种手段是现有技术中已知的。例如， 标记可共价或非共价结合。例证性的抗体缀合方法描述于Avarmeas, et al. , Scan. J. Immunol. 8(Suppl. 7) :7,1978) ；Bayer, et al.，Meth. EnzymoI. 62 :308,1979 ；Chandler, et al.，J. Immunol. Meth. 53 :187,1982 ；Ekeke and Abuknesha，J. Steroid Biochem. 11 1579，1979 ；Engvall and Perlmann, J. Immunol. 109 129,1972 ;Geoghegan，et al.， Immunol. Comm. 7:1，1978 ；以及 Wilson and Nakane，Immunofluorescence and Related Techniques，Elsevier/North Holland Biomedical Press ;Amsterdam(1978)，，每一篇都引入本文作为参考。根据标记的性质，可采用各种技术来检测和定量标记。对于荧光剂来说，大量荧光计是可获得的。对于化学发光剂来说，光度计或胶片是可获得的。对于酶来说，可以使用荧光计、光度计、分光光度计或者目测确定或测定荧光、化学发光或有色产物。具有吖啶镑、苯并吖啶锑或9，10- 二氢化吖啶型杂环系统的各种类型的化学发光化合物是标记的其它例子。吖啶f翁酯的例子包括具有杂环或环系统的那些化合物，其含有正氧化态的的杂原子包括诸如吖啶锑、苯并[a]吖啶锑、苯并[b]吖啶锑、苯并[c]吖啶钱、苯并咪唑阳离子、喹啉锑、异喹啉锑、喹嗪锑、环取代的喹啉锑、菲啶锑以及喹喔啉锑这样的环系统。示踪剂的制备可通过将吖啶I翁或苯并吖啶f翁酯上存在的活性官能团直接或间接连接到所选抗体上，如本领域技术人员所公知的那样(参见例如Weeks, et al. , Clin. Chem. 29 (8) : 1474-1479，1983)。化合物的例子是在芳基环的对位或间位存在芳基环离去基团和活性官能团的吖啶锑和苯并吖啶锊酯(例如美国专利No·4，745，1幻和WO 94/21823，引入本文作为参考)。使用方法术语“处理”包括任何的过程、作用、应用、治疗等等，其中受试者(或患者)，包括人，被给予了目的在于直接或间接改善患者状况、或者减缓患者状况或病症进展、或者改善所治疗中的疾病或病症的至少一种症状的医学救助。术语“联合治疗”或“共治疗”意指给予两种或更多种治疗剂来治疗疾病、状况和 /或病症。这种给药包括以基本上同时的方式共同给予两种或更多种治疗剂，诸如具有固定比例活性组分的单个胶囊或者用于每种抑制剂的多个分开的胶囊。此外，这种给药包括以连续方式使用每种类型的治疗剂。两种或更多种连续共同给予治疗剂的给药顺序不受限制。用语“治疗有效量“意指每种所给药试剂的量将达到改善疾病、状况和/或病症的严重程度和/或其症状的目的，同时避免或最小化了与所给予治疗性处理相关的不良副作用。术语“药学可接受的”意指适合用于药用产品中的对象物品。本发明的抗体预期作为治疗剂是有价值的。因此，本发明的实施方案包括治疗患者(包括哺乳动物)中各种状况的方法，包括将含有治疗目标状况有效量的本发明抗体给予所述患者。本发明的抗体可用于治疗或预防与MN蛋白相关的疾病和/或行为。这些疾病和 /或行为包括例如癌症，诸如肾癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌。本发明也涉及改善病症症状的方法，其中MN升高或者异常表达。这些病症包括但不限于肾癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌(参见例如Liao, Cancer Res. 57 :2827-2831,1997 ；Turner, Hum. Pathol. 28 :740-744,1997 ;Liao，et al.，Am. J. Pathol. 145 :598-609,1994 ；Saarnio, et al.，Am. J. Pathol. 153 :279-285,1998 ；Vermylen, et al.，Eur. Respir. J. 14 :806-811, 1999。在发明的一个实施方案中，将治疗有效剂量的本发明抗体给予具有MN升高的病症的患者。本发明的抗体可单独给药或者与一种或多种另外的治疗剂。联合治疗包括含有本发明抗体和一种或多种另外的治疗剂的单个药物剂量制剂的给药，也包括本发明抗体与每种其本身为分开的药物剂量制剂的另外的治疗剂的给药。例如，本发明抗体和治疗剂可以以单个口服剂量组合物一起给予患者，或者每种试剂可以以分开的口服剂量制剂给药。当使用分开的剂量制剂时，本发明抗体和一种或多种另外的治疗剂可以基本上同时给药(例如同时给药)或者分别在错开的时间给药(例如顺序给药)。试剂的给药顺序不被限制。例如，一方面，本发明的抗MN抗体或抗体片段与一种或多种抗癌剂一起共给药以加强抗体/片段或抗癌剂二者之一或者两者的效果，这可被预期用于治疗MN相关病症诸如癌症。也可使用这些联合治疗法来预防癌症，防止癌症复发，防止癌症的传播或转移，或者减轻或改善癌症相关症状。一种或多种抗癌剂可包括现有技术中任何已知的和适合的化合物，例如化学试剂，其它免疫治疗剂，癌疫苗，抗血管生成试剂，细胞因子，激素治疗，基因治疗，以及放射治疗。化学试剂(或者“抗癌试剂”或“抗肿瘤试剂”或“癌治疗剂”)是指参与癌症治疗的任何分子或化合物。本发明化学试剂的例子包括但不限于阿糖胞苷，紫杉醇类(例如紫杉醇、多西他赛)，抗微管蛋白试剂(例如紫杉醇、多西他赛、埃博霉素BGpothilone B)或其类似物)，大环内酯(例如根霉素)，顺钼，卡钼，阿霉素，鬼臼噻吩甙(tenoposide)，米托蒽醌，discodermoIide,五加苷(eleutherobine), 2_氯脱氧腺苷,烧化剂(例如环磷酰胺， 氮芥，噻替哌，苯丁酸氮芥，美法仑，卡氮芥(BSNU)，罗氮芥(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲菌素，丝裂霉素C，顺二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼，噻替哌)，抗生素(例如更生霉素(以前的放线菌素)，博来霉素，光神霉素，氨茴霉素)，抗代谢物(例如氨甲喋呤， 6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤,阿糖胞苷，flavopiridol, 5-氟尿喃唳,氟达拉滨,吉西他滨， 达卡巴嗪，泰莫佐罗)，天冬酰胺酶，卡介苗(Bacillus Calmette and Guerin),白喉毒素, 六甲蜜胺、羟基脲，LYS0DREN. RTM.，核苷类似物，植物碱(例如他克唑，紫杉醇，喜树碱，拓扑替康，伊立替康(开普拓沙，CPT-11)，长春新碱，长春碱诸如长春花碱)，鬼白毒素(包括衍生物诸如表鬼白毒素、VP-16 (依托泊苷)，VM-26 (替尼泊苷))，细胞松弛素B，秋水仙素，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱(emetine)，丝裂霉素，甲基苄肼(甲基苄肼)，氮芥，蒽环霉素(例如正定霉素(以前的道诺霉素)，阿霉素，阿霉素脂质体)，二羟基蒽环二酮，米托恩醌，光神霉素，放线菌素D，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素，抗有丝分裂剂，相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假单胞菌外毒素，神经生长因子，血小板衍生生长因子，组织纤溶酶原激活物，阿地白介素(aldesleukin), allutamine,阿那曲唑，比卡鲁胺， biaomycin,白消安，卡培他滨，卡钼，chlorabusil,克拉屈滨，cylarabine, daclinomycin, 雌莫司汀(estramusine), f Ioxuridhe,吉西他滨，gosereine,去甲柔毛霉素,itosfamide, 乙酸亮丙立得，左旋咪唑(levamisole)，罗氮芥，氮芥，醋酸甲孕酮，巯基嘌呤，巯乙磺酸钠 (美斯那(mesna))，mitolanc，培力口中白酶，pentoslatin, picamycin, riuxlmab, campath-1, straplozocin,硫鸟嘌呤,维生素A酸(tretinoin),长春瑞宾,或者它们的任意片段、家族成员或衍生物，包括它们的药学可接受的盐。包括一种或多种化学试剂Uf^nFLAG、CH0P) 的组合物也是本发明所预期的。FLAG包括氟达拉滨，阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺，长春新碱，阿霉素和强的松。化学试剂可以是抗血管生成剂，例如制管张素、贝伐单抗(阿瓦斯丁 )、索拉非尼(多吉美㊣)、杆抑素、癌抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-I抗体、抗Flt-I抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、 组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、酰胺基三唑、CM101、马马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、罗喹美克、沙立度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、阿卡丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板第四因子或者米诺环素。不受理论所束缚，抗血管生成剂的共给药可有利地导致肿瘤中MN表达的增加，从而使得肿瘤对本发明的抗体和抗体缀合物更敏感。—方面,所述化学试剂是剂量范围100到1000mg/m2/周期的吉西他滨。一个实施方案中，所述化学试剂是剂量范围200到4000mg/m2/周期的达卡巴嗪。另一方面，所述剂量范围是700到1000mg/m2/周期。还有另一方面，所述化学试剂是剂量范围25到50mg/ m2/周期的氟达拉滨。另一方面，所述试剂是剂量范围200到2000mg/m2/周期的阿糖胞苷 (Ara-C)。还有另一方面，所述化学试剂是剂量范围I. 5到7. 5mg/kg/周期的多西他赛。另一方面，所述化学试剂是剂量范围5到15mg/kg/周期的紫杉醇。进一步的方面，所述化学试剂是剂量范围5到20mg/kg/周期的顺钼。还有另一方面，所述化学试剂是剂量范围5到 20mg/kg/周期的5-氟尿喃唳。另一方面，所述化学试剂是剂量范围2到8mg/kg/周期的阿霉素。另一方面，所述化学试剂是剂量范围40到160mg/kg/周期的表鬼臼毒素。另一方面，所述化学试剂是剂量范围50到200mg/kg/周期的环磷酰胺。进一步的方面，所述试剂是剂量范围50到150mg/m2/周期的伊立替康。进一步的方面，所述试剂是剂量范围3. 7到 18. 5mg/m2/周期的长春花碱。另一方面，所述试剂是剂量范围0. 7到2mg/m2/周期的长春新碱。一方面，所述试剂是剂量范围3. 3到1000mg/m2/周期的氨甲喋呤。另一方面，本发明的抗丽抗体和/或抗体片段是与一种或多种免疫治疗剂组合给药的，诸如抗体或免疫调节剂，包括但不限于赫赛汀 、RetUXan 、OvaRex、Panorex、 BEC2、IMC-C225、Vitaxin、Campath I/H、Smart MI95、LymphoCide> Smart I D10,以及 Oncolym、利妥希玛、利妥希单抗、gemtuzumab或司徒曼布。本发明也包括给予本发明的抗MN抗体和/或抗体片段与一种或多种抗血管生成剂，包括但不限于血管抑素、沙立度胺、kringle 5、内皮抑制素、Serpin (丝氨酸蛋白酶抑制剂)、抗凝血酶、纤连蛋白的29kDaN末端蛋白水解片段和40kDa C末端蛋白水解片段、促乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板第四因子的7. SkDa蛋白水解片段、相应于血小板第四因子片段(Maione et al.，1990，Cancer Res. 51 :2077)的β -氨基酸肽、相应于胶原I片段 (Tolma et al.，1993，J. Cell Biol. 122 :497)的14个氨基酸的肽、相应于血小板反应蛋白蛋白I片段(Tolsma et al.，1993，J. Cell Biol. 122 :497)的19个氨基酸的肽、相应于 SPARC 片段(Sage et al. , 1995，J. Cell. Biochem. 57 :1329-)的 20 个氨基酸的肽，或者它们的任意片段、家族成员或衍生物，包括它们的药学可接受的盐。抑制血管生成并相应于昆布氨酸、纤连蛋白、前胶原和EGF的片段的其它肽也已经被描述(参见综述Cao, 1998，Prog. Mol. Subcell. Biol. 20 :161)。已经证实阻断能够结合R⑶蛋白(也就是具有肽基序Arg-Gly-Asp)的某些整联蛋白的单克隆抗体和环五肽具有抗血管生成活性(Brooks et al. , 1994, Science 264:569 ；Hammes et al. , 1996, Nature Medicine 2 :529)。此外，拮抗剂对尿激酶纤溶酶原激活物受体的抑制能够抑制血管生成、
27肿瘤生长和转移(Min et al. , 1996,Cancer Res. 56 :2428-33 ；Crowley et al. , 1993,Proc Natl Acad. Sci. USA 90:5021)。这些抗血管生成剂的用途也是本发明所预期的。另一方面，本发明的抗MN抗体和/或抗体片段是联合放射治疗方案来给药的。本发明的抗MN抗体和/或抗体片段也可与一种或多种细胞因子联合给药，包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素-α、淋巴毒素_β、 干扰素-β、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-I、白介素_2、白介素_6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、0X40、CD27、CD30、CD40 或CD137配体、Fas-Pas配体、4-1BBL、内皮单核细胞活化蛋白或者它们的任意片段、家族成员或衍生物，包括它们的药学可接受的盐。本发明的抗MN抗体和/或抗体片段也可与癌疫苗联合给药，其例子包括但不限于自体细胞或组织、非自体细胞或组织、癌胚抗原、α -甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、BCG 活疫苗、黑素细胞系蛋白(例如gplOO、MART-l/MelanA、TRP-I (gp75)、酪氨酸酶、广泛共有的肿瘤相关包括肿瘤特异性的抗原(例如BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-3、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、pl5)、肿瘤相关的突变抗原(β -联蛋白、MUM-1、⑶Κ4)、非黑素瘤抗原 (例如HER_2/neu(乳腺和卵巢癌)、人乳头状瘤病毒_E6、E7(宫颈癌)、MUC_1 (乳腺、卵巢和胰腺癌)。对于由T细胞所识别的人肿瘤抗原,通常参见Robbins and Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8 :628。癌疫苗可以是纯化的制剂或者可以不是纯化的制剂。在另一实施方案中，本发明的抗丽抗体和/或抗体片段是与激素处理一起使用的。激素治疗处理包括激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟利坦、他莫昔芬、乙酸亮丙立得盐 (LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂、类固醇(例如地塞米松、类维生素A、倍他米松、氢化可的松、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、 睾酮、孕酮)、抗孕激素物质(例如米菲司酮、奥那斯酮)、和抗雄激素物质(例如甲撑氯地孕酮)。本发明的抗丽抗体和/或片段可与抗MDR (多药物抗性)表型试剂一起使用，例如共同给药。许多人类癌症都固有地表达或自发地发展出对几种类型抗癌药物同时产生的抗性，尽管每种药物类型具有不同的结构和作用机制。这种现象可在培养的哺乳动物细胞中进行模拟，它通常被称为多药物抗性(“MDR”)或者多药物抗性表型。MDR表型对病人癌症的成功化学治疗处理是明显的障碍。恶性肿瘤对多种化学治疗剂的抗性是治疗失败的主要原因(Wittes et al. , Cancer Treat. Rep. 70 :105(1986) ；Bradley, G. et al. , Biochim. Biophys.Acta 948:87(1988) ；Griswald, D.P.et al. , Cancer Treat.Rep.65 (S2) 51(1981) ；0steen, R. T. (ed.)，Cancer Manual, (1990))。最初对细胞毒性药物敏感的肿瘤经常复发或者变得对多种化学治疗试剂来说是难治的(Riordan et al. , Pharmacol. Ther. 28 51 (1985) ；Gottesman et al. , Trends Pharmacol. Sci. 9 :54(1988) ；Moscow et al. , J. Natl. Cancer Inst. 80 14 (1988) ；Croop, J. M. et al. , J. Clin. Invest. 81 1303(1988))。从肿瘤获得的并且在选择性细胞毒性药物存在下培养的细胞或组织可能对那种类型的其它药物以及其它类型的药物，包括但不限于蒽环类、长春碱和表鬼白毒素产生交叉耐药性(Riordan et al. , Pharmacol. Ther. 28 51 (1985) ；Gottesman et al., J. Biol. Chem. 263 :12163 (1988))。这样，对单个药物的获得性抗性就同时产生了对结构上和功能上均不相关的不同组药物的抗性。这种抗性对于实体形式肿瘤和液体形式肿瘤(例如基于血液或淋巴的癌症)来说都可能是问题。哺乳动物细胞中多药物抗性的一个主要机制涉及170kDa质膜糖蛋白泵系统表达的增加(Juranka et al. , FASEB J 3:2583(1989) ；Bradley, G. et al. , Biochem. Biophys. Acta 948:87(1988))。该泵系统有时也被称为多药物转运蛋白，编码该泵系统的基因已经从培养的人细胞中克隆到了，通常称为mdrl。该基因在几种类型的正常组织中表达，但是还没有鉴别到转运用于在这些组织中的mdrl基因产物的生理底物。MDRl产物是ABC转运蛋白超家族的成员，这是一组具有能量依赖的输出功能的蛋白。mdrl基因的蛋白产物通常称为P-糖蛋白("P-170"，" p-gp")，是170kDa的跨质膜蛋白，构成上述能量依赖的外排泵。P-gp在细胞表面的表达足以使细胞抗多种细胞毒性药物，包括许多抗癌试剂。P-gp介导的MDR似乎是不同类型肿瘤的肿瘤抗性的重要临床组分，mdrl基因表达与不同类型癌症对化疗的抗性相关联。mdrl 基因的核昔酸序列(Gros, P. et al.，Cell 47 :371(1986) ；Chen, C. et al.， Cell 47 :381(1986))表明它编码与P-糖蛋白相似或相同的多肽，它们是相似于细菌转运蛋白的高度保守类型膜蛋白的成员，参与正常的生理转运过程。mdrl基因的序列分析表明 Pgp由分布在两个同源性(43%同一性)部分之间的1280个氨基酸组成。分子的每一半具有六个疏水跨膜结构域，每一个都在大胞质环中具有ATP结合位点。分子仅有大约8%是在胞外，碳水化合物部分(大约30kDa)结合到该胞外区的位点上。因此，将会理解的是，具有“多药物抗性”或“抗多药物”表型的哺乳动物细胞是通过它将许多细胞毒性物质(例如化疗药物)从胞内环境掩蔽、输出或排出的能力来表征的。细胞获得这种表型可能是作为选择压力的结果，该选择压力是通过暴露给单个化疗药物(选择毒素)而被施加的。备选地，细胞可能在毒素暴露之前就显示出表型，因为毒性物质的输出可能涉及与细胞分泌产物、代谢物等等的正常输出相同的机制。多药物抗性不同于对选择毒素的简单获得性抗性，因为细胞获得了输出另外的细胞毒素(其它化疗药物)的能力，这些另外的细胞毒素是以前并未暴露给细胞的。例如，Mirski et al. (1987)， 47Cancer Res. 2594-2598描述了多药物抗性细胞群的分离，其通过培养源自人小细胞肺癌的H69细胞系，存在阿霉素(羟基正定霉素)作为选择毒素。发现存活细胞抵抗了蒽环类似物(例如道诺霉素、表阿霉素、美洛格瑞和米托恩醌)、异-恶唑醋酸、依托泊苷、短杆菌肽 D、秋水仙素和长春花来源的生物碱(长春新碱和长春花碱)以及阿霉素的细胞毒性功效。 可应用类似的选择培养技术来产生另外的多药物抗性细胞群。因此，本发明的药物组合物可另外包括作用是抑制MDR表型和/或MDR表型相关状况的化合物。这些组合物可包括任何现有技术中已知的MDR抑制剂化合物，诸如特异于 MDR组分的抗体(例如抗MDR转运蛋白的抗体)或者MDR转运蛋白的小分子抑制剂，特别地包括他莫昔芬、维拉帕米和环孢菌素A，它们是已知的逆转或抑制多药物抗性的试剂(Lavie et al. J. Biol. Chem. 271 =19530-10536,1996，引入本文作为参考)。这些化合物可在美国专利No. 5，773，280,6, 225，325和5，403，574中找到，每一篇都引入本文作为参考。这些MDR 抑制剂化合物可与本发明的抗MN抗体和/或片段共同给药，用于各种目的，包括在检测到 MDR表型后逆转MDR表型以辅助或增强化疗处理。MDR抑制剂，例如他莫昔芬、维拉帕米或环孢菌素A，可以与本发明的化合物一起使用以辅助检测MDR表型。根据这个方面，MDR抑
29制剂能够增强本发明化合物在MDR癌细胞中的摄取和累积，因为MDR转运系统转运或者“泵出”与底物结构域相像的化合物的能力在MDR抑制剂存在时将被降低。在另一个实施方案中，本发明的抗丽抗体和/或抗体片段在癌症治疗中与基因治疗程序一起使用。用分泌白介素-2的重组细胞进行的基因治疗可以与本发明的抗体一起给药以预防或治疗癌症，特别是乳腺癌(参见例如Deshmukh et al. ,2001, J. Neurosurg. 94 287)。为评估特定抗体的治疗学上有用的治疗癌症的能力，作为例子，抗体可以在小鼠异种移植肿瘤模型中进行体内测试。如果需要，可在治疗性评估之前将MN抗体转变成IgGl 抗体。这种转变描述于实施例5中，治疗模型的例子详细描述于实施例9中。也可使用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性分析法来测试抗体活性，如实施例12中所述的。本发明也提供了诊断方法，用这些方法就可在患者样品或生物样品中检测到MN。 这些诊断方法可用于例如诊断其中的MN升高的那些病症。这些病症包括但不限于肾癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌。当用于诊断时，检测到来自患者样品的抗体-MN复合物的量比正常样品的复合物的量更大时，就确定患者可能患有病症。在实施例11中描述了用于检测癌症组织中的MN的免疫组织化学方法。在本发明的另一方面，提供了用于检测和/或观察MN相关癌症的方法，所述癌症具有异常表达量的MN蛋白。这些方法可包括，将MN相关癌细胞与本发明的抗MN抗体或片段接触，使用医学成像设备成像，其中抗MN抗体或片段包括能够被医学成像设备检测到的标记结构域。本发明的检测方法可在体外进行。癌细胞或组织可以来自任何合适来源，例如活组织检测或者细胞或组织培养物。用于获得活组织检测物以及维持和/或增殖所取下组织和/或细胞的方法将是技术人员所公知的。多药物抗性的体外检测可以具有各种应用，例如在治疗之前、期间或之后确定特定患者的癌症是否已经发展出多药物抗性。用于检测本发明化合物的成像形式的类型将取决于本发明化合物中所使用的特定标记结构域。例如，如果标记结构域包括钆螯合物，那么典型地可以使用MRI来检测本发明的成像剂。如果使用放射性核素螯合物作为标记结构域，就可以使用核成像方法(例如 PET)。如果使用基于荧光的标记结构域，可以使用光学成像系统，例如FACS系统或荧光显微镜或荧光自动平板读数仪。选择用于本发明体外检测方法的合适成像设备完全在技术人员的知识范围之内。此外，用于本发明体外检测方法中的成像剂的量将由本领域普通技术人员来确定，可依赖于MDR表型的存在程度，例如MDR转运系统(例如P-糖蛋白)的表达水平。技术人员不需要过度实验就能够确定多大量的新显象化合物对于检测到MDR表型来说才是足够的，也就是可检测的足够的量。所使用成像形式的类型不限于任何特定类型，可包括例如MRI、核成像(例如PET 或SPECT)、光学成像、声波发光成像或光声成像(超声)。技术人员将明白，本发明成像化合物的特定标记结构域应该与所使用的特定成像设备相兼容。在优选实施方案中，检测方法利用了抗MN抗体或其片段以及能够被MRI检测到的合适标记。例如，本发明的抗体或片段可包括作为MR造影剂的标记结构域，例如顺磁性金属螯合物或螯合物或任何的本文所描述的那些试剂。成像剂也可包括能被核成像形式诸如正电子发射成像(PET)或单光子发射计算机成像(SPECT)成像或检测的放射性核素标记结构域，例如放射性核素，诸如 199Au、72As、141Ce、67Cu、6°Cu、52Fe、67Ga、68Ga、51Gr、mIn、177Lu、 51Mn、2ci3Pb、188Re、97Ru、47Sc、177niSru 94niTc、167Tm和90Y。放射性核素可通过合适的螯合剂或通过多种螯合剂诸如HYNIC、DRPA、EDTA、DOTA、TETA、DTPA和BAT进行螯合。螯合剂与金属配位的条件描述于例如 Gansow et al.，美国专利 No. 4，831，175,4, 454，106 和 4，472，509，每一篇都引入本文作为参考。99mTc (锝-99m)对于治疗和诊断应用来说是特别有吸引力的，因为它是核医学部门一般都可得到的，它也不贵，给予患者的是最低放射剂量，并且具有理想的核成像性质。可将患者样品与本发明的抗体接触，然后可分析患者样品中抗体-MN复合物的存在。如上所述，抗体可包括可检测标记，诸如荧光、放射性核素、化学发光或酶标记，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。任选地，可将抗体结合到固相支持物上，它可以使得分析能够适应自动化。合适的固相支持物包括但不限于玻璃或塑料片、组织培养板、微量滴定孔、管子、硅片或者微粒诸如小珠(包括但不限于胶乳、聚苯乙烯或玻璃珠)。可以使用本领域已知的任何方法将抗体结合到固相支持物上，包括使用共价和非共价键、被动吸附或者结合到抗体和固相支持物上的结合对。可以在适于包含反应物的任何容器中完成MN和抗体的结合。这些容器的例子包括微量滴定板、试管和微量离心管。药物组合物和剂暈可以以包括药学可接受载体的药物组合物的形式提供本文所述的抗体。药学可接受的载体可以是不致热的。组合物可以单独给药或者与至少一种其它试剂一起给药，诸如稳定化合物，可以以任何无菌的、生物相容的药学载体的形式给药，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。可以使用多种水性载体，包括但不限于盐水、甘氨酸等等。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。这些溶液可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。通常，用语“药学可接受的载体”是本领域所公认的，包括药学可接受的材料、组合物或运载体，适合将本发明的化合物给予哺乳动物。载体包括液态或固态填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，参与将测试试剂从一种器官或身体部分携带或运送到另一器官或身体部分。每种载体都必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容，对患者无害。能够用作药学可接受载体的材料的一些例子包括糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；糖醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药学制剂中所使用的其它无毒的相容性物质。本发明的抗体组合物中也可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和加香剂、防腐剂和抗氧化剂。药学可接受的抗氧化剂的例子包括水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BTH)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α -生育酚等等； 以及金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。组合物可含有接近生理条件所需的药学可接受的辅料，诸如pH调节剂和缓冲剂等等。根据所选择的特定给药模式，这种药物制剂中的本发明抗体的浓度可以大范围地变化，主要可基于流体体积、粘度、等进行选择。如果希望，可以在药物组合物中包括多于一种类型的抗体(例如具有不同Kd的抗体用于丽结合)。组合物可单独给予患者，或者与其它试剂、药物或激素一起给药。除了活性成分之外，这些药物组合物可包含合适的药学可接受载体，包括赋形剂和辅料，它们帮助将活性化合物，加工为可在药学上使用的制剂。本发明的药物组合物可通过任何数量的途径进行给药，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、经皮、皮下、腹膜内、 鼻内、肠外、局部、舌下或直肠方式。本发明的组合物另外包括合适的免疫载体，诸如蛋白、多肽或肽，诸如白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白及其衍生物，特别是牛血清白蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)，多糖，碳水化合物，聚合物和固相。其它蛋白衍生的或非蛋白衍生的物质是本领域技术人员已知的。在涉及疫苗，例如带有本发明抗体的癌疫苗的方面，本发明的组合物可与或不与佐剂一起给药。可在没有佐剂时进行给药以避免任何佐剂诱导的毒性。本发明所属技术领域的普通技术人员，例如专攻癌症的医师，将理解并明白如何确定应不应该使用佐剂，这可能取决于患者的病史、家族数据、毒性数据、变态反应相关的测试结果等等。在使用佐剂的实施方案中，有利的是，佐剂促进了保护性抗体，诸如保护性IgG抗体的形成。本领域普通技术人员已知的任何合适佐剂都被本发明所包括，很容易使其适用于本发明。用于免疫动物用途的合适佐剂包括但不限于氢氧化铝、氢氧化铝、皂苷及其纯化成分Quit A、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。已经证明硫酸葡聚糖是抗葡萄球菌细胞表面抗原的 IgG2抗体的有效刺激物，也适合作为佐剂。技术人员将理解的是，一些佐剂可能更优选用于兽医应用，而其它佐剂将优选用于人体，在将化合物给予人体之前，技术人员应当考虑佐剂毒性。适用于肠胃外的、皮下的、静脉内的、肌肉内的制剂等等；合适的药学载体；以及用于制剂和给药的技术可通过本领域公知的任何方法制备(参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, Pa. , 20th edition,2000)。用于口服的本发明组合物的液体剂型包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性成分，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，溶解试剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、 1，3_丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、种子油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、 四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。本文所使用的用语“肠胃外的给药”或“肠胃外给予”意指除了肠内和局部给药的给药模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和注入。治疗有效剂量的确定完全是在本领域技术人员的能力范围之内的。治疗有效剂量是指可用于有效治疗疾病(例如癌症)的抗体的量，与没有治疗有效剂量的疗效相比是明
32显的。治疗有效剂量最初可在动物模型(例如大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中进行评估。动物模型也可用于确定合适的浓度范围和给药途径。然后可使用这些信息来确定用于人体给药的有用剂量和途径。抗体的疗效和毒性(例如ED5tl——在50%群体中治疗有效的剂量和LD5tl——对 50%群体致死的剂量)可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定。毒性与疗效的剂量比就是治疗指数，它可表示为LD5tZED5tl比。从动物研究获得的数据可用于制定用于人体使用的剂量范围。这些组合物中包含的剂量可以在循环浓度范围之内，其包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50。剂量在这个范围之内变化，取决于所使用的剂型、患者的敏感性以及给药途径。确切的剂量可由专业人员根据需要治疗的患者相关的因素来确定。可调整剂量和给药以提供足够水平的抗体或保持期望的功效。可被考虑的因素包括病状的严重性，患者的一般健康，患者的年龄、体重和性别，饮食，给药时间和频率，联合用药，反应敏感性以及对治疗的耐受/应答。可构建编码本发明抗体的多核苷酸，使用公知技术将其离体或体内引入到细胞中，这些技术包括但不限于转铁蛋白聚阳离子介导的DNA转移，用裸的或包裹的核酸进行的转染，脂质体介导的细胞融合，DNA包被的胶乳珠进行的胞内转运，原生质体融合，病毒感染，电穿孔，“基因枪”以及DEAE或磷酸钙介导的转染。抗体有效的体内剂量在大约5 μ g到大约500 μ g/kg体重的范围。对于编码抗体的多核苷酸的给药来说，有效的体内剂量在大约IOOng到大约500 μ g DNA的范围。含有抗体的本发明的药物组合物的给药模式可以是将抗体传递给宿主的任何合适途径。举例来说，本发明的药物组合物对于肠胃外给药(例如皮下、肌肉内、静脉内或鼻内给药)来说可能是有用的。本公开内容中引用的所有专利和专利申请都特别地引入本文作为参考。上述公开内容一般性地描述了本发明。更完整的理解可以通过参考下面的特定实施例来获得，所提供的实施例仅仅是为了例证性说明，并不打算限制发明的范围。
实施例本文所述的结构、材料、组合物和方法是本发明的代表性例子，本发明的范围不受实施例范围的限制，这是能够明白的。本领域技术人员将认识到，本发明的实施可以在所公开的结构、材料、组合物和方法的基础上进行变化，这些变化被认为在本发明的范围内。实施例I :人组合Fab文库(HuCAL Gold)的构津HuCAL GOLD是基于HuCAL 技术(人组合抗体文库；MorphoSys AG， Martinsried/Planegg, Germany)的抗体文库。这个文库组合了 Fab格式的合成的全人抗体文库，特征在于具有六个不同的CDR区，用展示技术选择高亲和力抗体 CysDisplay (MorphoSys AG, Martinsried/Planegg, Germany)。 CysDisplay 是基于通过二硫键的表型-基因型连接的单价噬菌体展示技术，它能够以高亲和力回收特定抗体。噬菌体展示载体pMORPH 23是能够容许Fab片段的单价CysDisplay 的噬菌粒载体。它编码全长glllp、Fd链(Vh-ChI)和轻链('-CJ，它们都具有不同的分泌信号序列，引导相应蛋白链到大肠杆菌的周质中。利用了 ompA和phoA信号序列两者来转运重链和轻链到周质，其中产生了由非共价相互作用引起的链组装。该展示载体携带有可诱导的Iac启动子/操纵子区域。用于阻遏表达的IaqItl基因产物是由大肠杆菌宿主菌株TGl 提供的。Cys-glllp和Fab表达的诱导是通过加入IPTG(异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)来实现的。使用限制酶XbaI和EcoRI将富集的Fab集合从pMORPH 23亚克隆到Fab表达载体pMORPH x9上。通过该步骤，除去了 Fd链的C末端的半胱氨酸和接头-His6部分，切下了 glllp。表达载体pM〇RPH x9_Fab_ni提供了两个C末端标志 FLAG和6xHis，这样有助于Fab蛋白的检测和纯化。噬菌粒回收和噬菌体扩增 在补充了 34 μ g/ml氯霉素和I %葡萄糖的2xTY培养基中扩增TGl细胞中的HuCAL GOLD Fab噬菌粒。在辅助噬菌体于37°C感染(VCSM13约2-6xlOnpfu/ml) 30分钟后，通过离心浓缩TGl细胞。通过将感染的TGl细胞在含有34 μ g/ml氯霉素、50 μ g/m卡那霉素和 0. 25mM IPTG的2xTY培养基中于22°C培养过夜，扩增噬菌粒。使用含有噬菌体的上清液进行曬菌体淘选。实施例2 :固相淘诜固相淘选是通过用PBS中的人MN蛋白包被MaxiSorp 平板(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)或 Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA)来进行的 (I μ g/孔或I μ g/lrng珠)。丽蛋白代表了带有用于纯化的C末端his标志的蛋白的整个胞外结构域。MN蛋白是在哺乳动物细胞系HKB-Il中表达的，通过Ni-NTA层析进行纯化，使用的是本领域技术人员公知的标准方法。用PBS中的5%奶对含有已结合的MN蛋白的孔进行封闭，在PBS中漂洗，然后用一等份预封闭的含有IX IO12个HuCAL GOLD Fab噬菌体的 HuCAL GOLD噬菌体文库于室温保温2小时。漂洗已结合的噬菌体，然后用IOmM Tris缓冲液pH 8. O中的20mM DTT进行洗脱。进行三轮淘选，每轮淘选之间都进行如上所述的噬菌体扩增。每轮淘选之间都增加漂洗严谨度以减少非特异性结合。实施例3 :亚克降所诜择的Fab片段用于大肠杆菌中的表汰将所选择的Fab从pMORPH 23展示载体克隆到pMORPH x9_Fab_ FH表达载体上以促进用于ELISA筛选的可溶性Fab的快速表达。用EcoRI和XbaI消化pMORPH 23载体的DNA制备物，这样就切下了整个Fab编码片段(ompA-VL-VL和 phoA-Fd)。在接着的纯化之后，将片段连接到所制备的pM0RPHx9_Fab_FH载体上(也用 EcoRI/Xbal消化并纯化)。通过电穿孔将含有Fab插入片段的载体转染到感受态大肠杆菌 TGlF细胞中。将转化的大肠杆菌细胞于37°C下培养在含有34 μ g/ml氯霉素和1%葡萄糖的LB平板上。挑选菌落，置于含有34μ g/ml氯霉素和1%葡萄糖的培养基中。加入甘油到20%，将这些储备起始培养物保存在-80°C下直到需要用于ELISA。为获得纯化的Fab， 将携带该载体的大肠杆菌转化体典型地培养在多个IL的摇瓶培养物中，收获，使用Ni-NTA 亲和层析进行纯化，使用的是本领域技术人员公知的方法。实施例4 :通过ELISA鉴别结合丽的Fab片段用PBS中的浓度为5 μ g/ml的已纯化人MN蛋白溶液以100 μ I/孔包被Maxisorp 96孔ELISA平板。使用培养在来自起始储备培养物的含有34 μ g/ml氯霉素的2 X TY培养基中的大肠杆菌转化体表达Fab。收获前十二(12)小时，加入IPTG(终浓度O. 5mM)诱导 Fab表达。裂解细胞，将100 μ I裂解物于室温下保温在预包被了 MN并用奶封闭的Maxisorp 平板的孔中2小时。然后在TBS和含有吐温的TBS中漂洗平板以去除非特异性结合。用缀合到碱性磷酸酶上的山羊抗人(Fab，)2抗体(Pierce Chemical, Rockford, IL)检测结合的Fab。按照厂商说明书的指导使用底物AttoPhos (Roche Diagnostics, Alameda, CA),在 430nm激发，在535nm读出发射。大量的大肠杆菌转化体表达Fab，其显示的ELISA中的信噪比大于10。对超过50 个的独特MN结合Fab鉴别了 VH和VL区的DNA测序。根据它们的功能性，十个抗体的完整 VH和VL的DNA和蛋白序列分别示于图3和4中。通过ELISA将这十个公开的抗体每一个都结合到分离自哺乳动物表达细胞系HKB-II的纯化MN蛋白上(图5)。所检测的抗体也与分离自sf9昆虫细胞的纯化MN反应，这些昆虫细胞已经被编码MN胞外结构域的杆状病毒感染过，(图5)这证明ELISA反应对于MN蛋白是特异性的，而不是蛋白制剂中的任何痕量污染物。在BIAcore 分析中，本发明的抗体特异性结合人MN，Kd范围在InM(I X 10_9M)到大约 50nM(5. OX 10_8nM)(图 5)。实施例5 :结合MN的Fab和IgG的鉴别使用表面等离子共振技术在BIAcore 3000仪器(BIAcore, Uppsala,瑞典)上分析丽蛋白与本发明抗体之间的结合相互作用。对于全长IgG(le4、laal和3ee9)的结合来说，使用标准胺偶联试剂盒(BIAcore,Uppsala,瑞典)将山羊抗人IgG Fe高密度地共价偶联到CM5生物传感器上。然后使用捕获分析法将这些IgG结合到固定了抗人IgG Fe的表面上，目标是3000个应答单位的BIAcore信号。在25°C下操作BIAcore，流速是10 μ 1/min 流动缓冲液，其中含有 PBS/0. 05% 吐温 20 或含有 IOmM Na-HEPES, pH 7. 5/150mM NaCl/3mM EDTA/0. 005%吐温20。配体结合之后，然后将流速增加到25 μ 1/min,让各种浓度的MN分析物(例如50nM到InM的范围)流过表面10分钟以便能够监测缔合阶段。然后进行离解 35分钟，接着用100 μ I的IOmM磷酸以100 μ Ι/min再生固定了抗人IgG Fe的表面。使用 I I Langmuir结合模型拟合传感曲线以计算速率常数。类似地确定Fab与丽的结合， 不同之处是将抗人Fab的IgG固定在芯片上并在MN结合评估之前用来捕获Fab。图5显示了对于所公开抗体与纯化MN蛋白之间的结合来说得到的结合常数。每个结合MN的抗体都显示出了 0. 15到50nM范围的Kd值。实施例6 :构津HuCAL免疫球蛋白表汰载体用于在293F细胞中瞬时表汰抗体重链表达载体。去除pcDNA3.1+ (Invitrogen,Carlsbad,CA)的多克隆位点(Nhel/ ApaI)，插入与用于HuCAL的限制性位点相容的位点，进行前导序列(Nhel/EcoRI)、VH结构域(EcoRI/BlpI)和免疫球蛋白恒定区(Blpl/Apal)的连接。前导序列(EMBL M83133)具有 Kozak 序列(Kozak, Nucleic Acid Res. 15 :8125-8148,1987)。将人 IgGl (PIR J00228)、 IgG4 (EMBL K01316)和血清IgAl (EMBL J00220)的恒定区切成大约70个碱基长度的重叠寡核苷酸。引入沉默突变以去除与HuCAL设计不相容的限制性位点。通过重叠延伸PCR剪接寡核苷酸。轻链表达载体。用两个不同位点取代pcDNA3. 1/Zeo+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) 的多克隆位点。K -位点提供了用于K -前导序列(Nhel/EcoRV) ,HuCAL-scFv Vk-结构域 (EcoRV/BsiffI)和K-链恒定区(BsiWI/Apal)插入的限制性位点。λ-位点中的相应限制性位点是Nhel/EcoRV (I-前导序列)、EcoRV/Hpal (VI-结构域)和Hpal/Apal ( λ -链恒定区)。K-前导序列(EMBL Z00022)以及λ -前导序列(EMBL L27692)都具有Kozak序列。 人K-链(EMBL J00241)和λ-链(EMBL Μ18645)的恒定区通过上述重叠延伸PCR进行组装。来自Fab的全长IgG的产生。通过用Mfel/BlpI酶切，将包含在大肠杆菌表达载体 pM0RPHx9_Fab_FH中的Fab重链序列切下，连接到上述已经被EcoRI/BlpI酶切过的重链表达载体中。用EcoRV/BsiWI将包含在pM0RPHx9_Fab_FH中的Fab κ轻链序列切下，连接到也已经被EcoRV/BsiWI酶切过的κ轻链表达载体中。用EcoRV/Hpal将包含在pM0RPHx9_ 813_ !1中的？313入轻链序列切下,连接到上述λ表达载体中。全长IgG 的大规模瞬时表达。将 Cellbag 20L/0 (Wave Biotech LLC, Somerset, NJ)以 O. 25xl06 个 293F 细胞 /ml (Invitrogen)接种到 9. 3L 的 Freestyle 293 表达培养基(Invitrogen)中。将细胞培养到lX106/ml的密度,通过将编码全长抗体的5mg的每种轻链表达载体和重链表达载体加入到含有293fectin试剂(Invitrogen)的350ml Optimem(Invitrogen)中进行转染。在37°C发酵96小时后,通过离心收获细胞培养物上清液，无菌过滤，通过切向流过滤进行浓缩，将PH调节到7. 6，然后进行标准蛋白A柱层析 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)。实施例7 :细朐贴壁分析将五十(50) μ L的I μ g/mL的PBS中的纯化丽溶液吸附到未处理的96孔板上， 4°C过夜。除去溶液，用PBS冲洗孔3次。用RPMI1640培养基中的200 μ L 50%FBS封闭孔I小时。然后用含有1% BSA的PBS中的100μ gle4抗丽抗体、含有I % BSA的PBS中的对照IgG或者含有I % BSA的PBS进行处理。用PBS漂洗之后，向孔中加入5000个MaTu 细胞(MN+细胞)，在37°C和5% CO2下过夜温育平板。用PBS漂洗之后，分析抗丽抗体阻断MaTu细胞贴壁到丽包被孔上的能力。该实验的例子示于图6中，其中IOOyg的抗丽抗体le4显示出了细胞贴壁，而对照IgG或缓冲液赋形剂则不显示细胞贴壁。实施例8 :带有免疫缀合物的皮下异种移植癌症模型使用本领域已知的方案(例如Liu，et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. 93 :8618-8623, 1996.)将抗MN抗体缀合到细胞毒性小分子上。将人乳腺异种移植物MaTu细胞作为贴壁培养物培养在补充了 10% FBS 的 RPMI 中。用 0. ImL 的 80% matrigel/20% HBSS 中的 5X IO6 个细胞皮下接种在Ncr裸鼠(8-12周龄)的右胁腹。当肿瘤达到约180mg的平均大小时(6 天)，开始进行处理。将缀合到细胞毒性小分子上的单克隆抗体静脉注射给药，以10mg/kg 的剂量每四天给药一次(Q4Dx3)。对照小鼠用PBS或未缀合的单克隆抗体进行处理。对每只动物的健康状况每天进行检测。每个实验组由10只小鼠组成，剂量体积是0. lmL/10g体重。通过使用电子卡尺每周测量2-3次每个肿瘤的长度和宽度，根据公式[长度(mm) X宽度(mm)2]/2计算肿瘤重量(mg)。记录整个研究过程中获得的所有数据包括每日观察结果。 肿瘤生长抑制(TGI)计算为1-T/CX 100，其中T =来自处理组的最终肿瘤重量，C=来自对照组的最终肿瘤重量。图7显示了缀合到细胞毒性药物上的单克隆IgGl le4在30mg/kg 免疫缀合物时产生了显著的抗肿瘤功效，而未缀合的抗体没有效果。这些数据证明了针对 MN蛋白的抗体作为载体用于将细胞毒性药物输送到肿瘤的治疗用途。实施例9 :荧光激活细胞分诜分析(FACS分析)
可分析细胞的MN表达来作为诊断工具。用PBS溶液中的I : 10胰蛋白酶/Versene 处理5到10分钟，将贴壁的表达丽的PC-3mm2细胞和不表达丽的DLDl细胞从它们的瓶中分离下来。将细胞进行旋转(1000rpm，5分钟)，用冰冷的RPMI 10% FBS漂洗一次，以 6xl06个细胞/ml重悬浮在冰冷的染色缓冲液(不含Ca+Mg+的PBS，2% BSA, O. 05%叠氮化钠)中。将25 μ g/mL的一抗，即人抗丽IgGl或者对照的人IgGl抗体与6xl05个细胞在冰上保温I小时。用冰冷的染色缓冲液将未结合的抗体从细胞上漂洗下去。用PBS中的2% 甲醛固定细胞10分钟,然后用染色缓冲液漂洗两次。将细胞沉淀重悬浮在100 μ I的冰冷染色缓冲液中，其中含有抗人Alexa fIuor 488 二抗(终浓度I : 200,Molecular Probes/ Invitrogen, Carlsbad, CA)，在冰上保温I小时。用流动缓冲液(含2% BSA的PBS)漂洗两次将未结合的抗体从细胞上漂洗下来，将细胞重悬浮在ImL的流动缓冲液中。在Beckman FACS Caliber设备上进行重悬浮细胞的FACS分析。图8显示，根据FACS分析，PC_3mm2人前列腺癌细胞表达了 MN，而DLD-I细胞不表达。实施例10 :抗体依赖的细胞介导的细胞毒性分析(ADCC分析)抗丽IgG的抗肿瘤活性可能是通过ADCC活性介导的。将表达丽的PC_3mm2细胞和不表达MN的HCT-116细胞与250ng/mL、1000ng/mL或2000ng/mL的人抗MN IgGl或者对照的人IgGl抗地高辛抗体一起保温。将人PBMC加入到这些细胞中，效应物靶的比例为50 1、25 : I和5 : I。进行铬-51释放分析来确定靶细胞裂解的水平。在存在DLD 和PC-3_2细胞时用对照抗体或者没有抗体保温时，观察到了少量裂解。这种自发裂解水平对于50 1、25 I和5 I的靶效应物比来说分别是10-15%、5-10%或2-3%。类似地，不表达丽的DLD细胞在与抗丽抗体保温时，它的裂解在0-10 %的范围。然而，当 PC-3mm2细胞与人抗丽IgG保温时，它的裂解比对照明显更高。当以50 : I靶效应物比使用250ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL时，观察到了 40、50和60%的裂解。类似地，在 25 I的比时观察到了 30、33和38%的裂解，最后，在5 I的靶效应物比时观察到了 8、10和15%的裂解。这些实验显示，人抗丽抗体介导了抗肿瘤的ADCC活性，可用于癌症治疗。实施例11 :免疫缀合物制备使用编码多种人Fab的噬菌体展示文库(Morphosys)来产生针对MN细胞表面抗原的人抗体。将该抗体缀合到单甲基金抑素E(MMAE) (Fransisco et al.，Blood，2003，102 1458-1465)上(图 9)。体外活性和选择性通过针对包含101°个人Fab片段(Fab是抗体的抗原结合部分)的MorphoSys曬菌体文库进行人MN的纯化细胞外结构域的体外“淘选”，鉴别到了 3ee9/MMAE的抗体部分 (3ee9)。进一步检测活性Fab在加入到MN阳性细胞上时的选择性结合并进行内化的能力。 然后将所得到的活性Fab转变成全长人IgGl抗体，在CHO细胞中表达、纯化，然后缀合到毒性簇 MMAE(Liu et al, Proc Natl Acad Sci，1996，93 :8618-8623)上。然后测试缀合抗体杀死表达MN的细胞的能力。在所测试的一组七个全长抗体中,根据其体外和体内分析中的结合性质、选择性和效力，选择到了 3ee9/MMAE。表面等离子共振(Biacore)材料和方法
在BIAcore 3000设备(Acore, Uppsala,瑞典)上使用表面等离子技术分析表达人丽蛋白的HKBll和人全长抗丽Mab之间的结合相互作用。对于芯片制备来说，使用标准胺偶联试剂盒(BIAcore, Uppsala,瑞典)将山羊抗人IgG Fe共价偶联到CM5生物传感器芯片上。然后使用捕获分析将感兴趣的抗体结合到固定了抗人IgG Fe的表面上，目标是 300个应答单位的BIAcore信号。在25°C下操作BIAcore，流速是10 μ 1/min流动缓冲液， 其中含有 IOmM Na-HEPES, pH 7. 5/150mM NaCl/3mMEDTA/0. 005%吐温 20。配体结合之后， 将流速增加到25 μ 1/min，让丽分析物(50nM到InM)流过表面10分钟以便能够监测缔合阶段。然后进行离解35分钟，接着用IOmM磷酸以100 μ Ι/min再生固定了抗人IgG Fe的表面。使用I : I Langmuir结合模型拟合传感曲线以计算速率常数(表I,如下)。表I通过表面等离子共振(Biacore)确定的来自淘选的抗体对可溶性MN的亲和力
权利要求
1.具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体或抗体片段，其中所述抗原结合位点包括[3ef2]SEQ ID NO :58、64、71、107、109 和 111 ;或 [le4]SEQ ID NO :59、65、72、107、109 和 111 ;或 [3a4]SEQ ID NO :60、66、73、108、110 和 112 ;或 [3ab4]SEQ ID NO :61、67、74、87、91 和 95 ;或 [3ahlO]SEQ ID NO :61、68、75、88、92 和 96 ;或 [3bb2]SEQ ID NO :62、69、76、98、100 和 102 ;或 [laalJSEQ ID NO :77、78、79、86、90 和 94 ;或 [5a6]SEQ ID NO :80、82、84、99、101 和 103 ;或 [5aa3]SEQ ID NO :81、83、85、104、105 和 106。
2.权利要求I的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以约O.15nM至约50nM的离解常数结合于所述MN蛋白。
3.权利要求1-2任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体为IgG，优选IgGl、IgG2a、 IgG2b、IgG3 ；IgM ；IgD ；IgE ；IgA ；IgM ;Fab 片段；F(ab’)2 片段；scFv 片段；Fv 片段；双抗体； 线性抗体；单链抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；或者多特异性抗体。
4.权利要求1-3任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源化的。
5.权利要求1-5任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段缀合于细胞毒性试剂。
6.权利要求6的抗体或抗体片段，其中所述细胞毒性试剂选自单甲基金抑素-E或其功能性类似物、单甲基金抑素-F或其功能性类似物、阿普立丁、氮杂尿苷、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替左米、薯司他丁-I、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡氮芥、塞来西布、苯丁酸氮芥、顺钼、伊立替康(CPT-Il)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、环磷酰胺、 阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、葡糖苷酸柔红霉素、正定霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表阿霉素、炔雌醇、雌氮芥、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3'，5' -O-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟利坦、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、 L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、罗氮芥、氮芥、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托恩醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、强的松、甲基苄肼、紫杉醇、喷托他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷、紫杉醇、丙酸睾酮、沙立度胺、巯基鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春花碱、长春瑞宾、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素以及它们的组合。
7.一种用于治疗患有MN相关癌症的受试者的组合物，任选地其中所述癌症是以下器官的肿瘤或源自以下器官的肿瘤乳腺、呼吸道、肺、脑、生殖器、消化道、结肠、泌尿道、肾、 食道、子宫颈、眼、肝、皮肤、头部、颈部、甲状腺和甲状旁腺，所述组合物包含权利要求1-6 任一项的抗体或抗体片段以及抗癌试剂。
8.权利要求8的组合物，抗癌试剂选自博莱霉素、多西他赛(肽帝索)、阿霉素、依达曲沙、厄洛替尼(特罗凯)、依托泊苷、非那雄胺(保列治)、弗利坦(氟他胺)、吉西他滨(健择)、吉非替尼(易瑞沙)、醋酸性瑞林(诺雷德)、格雷西隆(凯特瑞)、伊马替尼(格列卫)、伊立替康(开普拓/开普拓沙)、奥丹西隆(枢复宁)、紫杉醇(他克唑)、培加帕酶(培门冬酶)、盐酸毛果芸香碱(匹罗卡品)、卟吩姆钠(光敏素)、白介素_2 (普罗白精)、利妥希单抗(利妥希玛)、拓扑替康(盐酸拓扑替康)、司徒曼布(赫赛汀)、特立平、长春新碱、 酒石酸长春瑞宾(诺维本)、制管张素、贝伐单抗(阿瓦斯丁 )、索拉非尼(多吉美 )、杆抑素、癌抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-I抗体、 抗-Flt-I抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-i3、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、酰胺基三唑、CM101、马马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156EU6K促乳素片段、罗喹美克、沙立度胺、己酮可可碱、染料木素、ΤΝΡ-470、 内皮抑制素、紫杉醇、阿卡丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板第四因子和米诺环素。
9.一种药物组合物，包含权利要求1-6任一项的抗体或其片段以及药学可接受载体。
10.权利要求1-6任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗原结合位点包括SEQIDNO133的重链可变区和SEQIDNO134的轻链可变区-或SEQIDNO135的重链可变区和SEQIDNO136的轻链可变区-或SEQIDNO137的重链可变区和SEQIDNO138的轻链可变区-或SEQIDNO139的重链可变区和SEQIDNO140的轻链可变区-或SEQIDNO141的重链可变区和SEQIDNO142的轻链可变区-或SEQIDNO143的重链可变区和SEQIDNO144的轻链可变区-或SEQIDNO147的重链可变区和SEQIDNO148的轻链可变区-或SEQIDNO149的重链可变区和SEQIDNO150的轻链可变区-或SEQIDNO151的重链可变区和SEQIDNO152的轻链可变区。
11. 一种由SEQ ID NO : 153的核苷酸序列编码的抗丽IgG抗体。
全文摘要
本发明提供了具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体，以及使用这些抗体治疗和诊断MN相关病症的方法。
文档编号C12N15/11GK102585001SQ20121004186
公开日2012年7月18日 申请日期2006年12月12日 优先权日2005年12月12日
发明者G·兰杰斯, L·阿德南, P·坦布里尼, P·特雷尔, S·哈, T·麦凯布 申请人:拜尔健康护理有限责任公司