专利名称:重组crm197的高水平表达的制作方法
重组CRM197的高水平表达
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年3月30日提交的题目为“重组CRM197的高水平表达”的美国专利申请序列号61/319，152的优先权。
发明背景
白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素。产毒菌株含有携帯毒素基因的噬菌体溶素原。DT被合成为535个氨基酸的多肽，其经历蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫键连接的两个亚基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亚基使DT能够结合细胞膜并通过细胞膜进入到胞质中。一旦进入细胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亚基催化延伸因子
2(EF-2)的ADP核糖基化。其结果是，EF-2被灭活、蛋白质合成停止和细胞死亡。白喉毒素 是高度细胞毒性的，单个分子可以致死细胞，且10ng/kg的剂量可以杀死动物和人。
CRM197蛋白是DT的无毒的、免疫学交叉反应的形式。已研究了其作为DT增强剂或疫苗抗原的潜在用途。CRM197是通过由产毒的P棒状杆菌噬菌体的亚硝基胍诱变构建的非产毒噬菌体P 197tQX_感染的白喉杆菌产生的。CRM197蛋白具有与DT相同的分子量，但在A亚基中有单碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)的差异。这ー单碱基变化导致氨基酸置换(谷氨酸置換为甘氨酸)，并消除了 DT的毒性性质。
使用CRM197作为载体蛋白的结合多糖疫苗已批准人体使用。疫苗包括MenVe0 (Novartis Vaccines and Diagnostics)(标明用于预防由脑膜炎球菌亚群A、C、Y和W-135引起的侵袭性脑膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate (Novartis Vaccines)(脑膜炎双球菌C群结合疫苗)、和Prevnar (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)(革巴向于肺炎链球菌的七种血清型的儿童肺炎疫苗)和HibTITER (Wyeth)(流感嗜血杆菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉的增强抗原的潜力并正在研究作为用于其它疫苗中的载体蛋白。
用于批准的治疗和研究用途的CRM197高水平表达的方法尚未见报道。CRM197已在例如白喉杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中以数十mg/L的水平表达。单剂Prevnar结合疫苗含有大约20ii g CRM197。因此，用于经济地以约lg/L或以上的水平生产CRM197的方法将极大地促进疫苗研究和生产。
发明概述
本发明涉及用于在假单胞菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括将编码与指导CRM197蛋白转移到周质的分泌信号融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中；用所述表达载体转化假单胞菌宿主细胞；并在适合重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的假单胞菌的宿主细胞；其中所得的可溶性CRM197的产率是每升约I至约12克。
在实施方式中，假单胞菌宿主细胞是至少ー种蛋白酶表达缺陷的，或假单胞菌宿主细胞过表达至少ー种折叠调节因子。在某些实施方式中，假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和aprA-。在实施方式中，假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和 aprA_,并且分泌前导序列是 Azu、IbpS31A、CupA2 或 PbpA20V。在其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和aprA-，并且分泌前导肽序列是Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V或Pbp。在其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞是Serralysin、HslU、HslV、Prcl、DegPl、DegP2或AprA表达缺陷的,或假单胞菌宿主细胞过表达 DsbA、DsbB、DsbC 和 DsbD。
在具体实施方式
中，宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且分泌前导序列是Azu。在其它具体实施方式
中，宿主细胞是Serralysin表达缺陷的，并且分泌前导序列是Pbp或Azu。在某些实施方式中，宿主细胞是HslU和HslV表达缺陷的，且分泌前导序列是Pbp或Azu。在再其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞是野生型的，且分泌前导序列是Pbp或 Azu0
在实施方式中，分泌前导序列是Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。在其它实施方式中，分泌前导序列是Azu、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。
在实施方式中，CRM 197核苷酸序列已对于在假单胞菌宿主细胞中的表达进行优化。
在实施方式中，获得的可溶性CRM197的产率为约0. 5g/L、约0. 6g/L、约0. 7g/L、约0. 8g/L、约 0. 9g/L、约 lg/L、约 I. 5g/L、约 2g/L、约 2. 5g/L、约 3g/L、约 3. 5g/L、约 4g/L、约4. 5g/L、约 5g/L、约 5. 5g/L、约 6g/L、约 6. 5g/L、约 7g/L、约 7. 5g/L、约 8g/L、约 8. 5g/L、约9g/L、约 9. 5g/L、约 10g/L、约 10. 5g/L、约 I lg/L、约 12g/L、约 0. 5g/L 至约 lg/L、约 0. 5g/L至约 2g/L、约 0. 5g/L 至约 3g/L、约 0. 5g/L 至约 4g/L、约 0. 5g/L 至约 5g/L、约 0. 5g/L 至约6g/L、约 0. 5g/L 至约 7g/L、约 0. 5g/L 至约 8g/L、约 0. 5g/L 至约 9g/L、约 0. 5g/L 至约 IOg/L、约 0. 5g/L 至约 I lg/L、约 0. 5g/L 至约 12g/L、约 lg/L 至约 2g/L、约 lg/L 至约 3g/L、约lg/L 至约 4g/L、约 lg/L 至约 5g/L、约 lg/L 至约 6g/L、约 lg/L 至约 7g/L、约 lg/L 至约 8g/L、约 lg/L 至约 9g/L、约 lg/L 至约 10g/L、约 lg/L 至约 llg/L、约 lg/L 至约 12g/L、约 2g/L至约3g/L、约2g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L、约2g/L至约6g/L、约2g/L至约7g/L、约2g/L至约8g/L、约2g/L至约9g/L、约2g/L至约10g/L、约2g/L至约I lg/L、约2g/L至约12g/L、约 3g/L 至约 4g/L、约 3g/L 至约 5g/L、约 3g/L 至约 6g/L、约 3g/L 至约 7g/L、约 3g/L 至约 8g/L、约 3g/L 至约 9g/L、约 3g/L 至约 10g/L、约 3g/L 至约 I lg/L、约 3g/L 至约 12g/L、约4g/L至约5g/L、约4g/L至约6g/L、约4g/L至约7g/L、约4g/L至约8g/L、约4g/L至约 9g/L、约 4g/L 至约 10g/L、约 4g/L 至约 I lg/L、约 4g/L 至约 12g/L、约 5g/L 至约 6g/L、约5g/L至约7g/L、约5g/L至约8g/L、约5g/L至约9g/L、约5g/L至约10g/L、约5g/L至约llg/L、约 5g/L 至约 12g/L、约 6g/L 至约 7g/L、约 6g/L 至约 8g/L、约 6g/L 至约 9g/L、约 6g/L 至约 10g/L、约 6g/L 至约 llg/L、约 6g/L 至约 12g/L、约 7g/L 至约 8g/L、约 7g/L 至约 9g/L、约 7g/L 至约 10g/L、约 7g/L 至约 llg/L、约 7g/L 至约 12g/L、约 8g/L 至约 9g/L、约 8g/L至约10g/L、约8g/L至约11^/し、约88/し至约12g/L、约9g/L至约10g/L、约9g/L至约Hg/L、约 9g/L 至约 12g/L、约 10g/L 至约 llg/L、约 10g/L 至约 12g/L 或约 llg/L 至约 12g/L。
本发明涉及用于在假单胞菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括将编码与指导CRM197蛋白转移到周质的分泌信号融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中，用该表达载体转化假单胞菌宿主细胞，并在适合重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的假单胞菌宿主细胞；其中所得的可溶性CRM197的产率是每升约I至约12克；并且还包括在活性分析中測定重组CRM197蛋白的活性，其中产生的可溶性CRM197的约40%至约100%是活性的。在相关的实施方式中，活性分析是免疫学分析或受体结合分析。
在实施方式中，表达载体包含可操作地连接到蛋白编码序列上的Iac衍生启动子(derivative promoter),且其中所述培养包括使用浓度为约0. 02至约I. OmM的IPTG诱导启动子，诱导时的细胞密度是约40至约200个吸光度単位(AU)的光密度，培养物的pH为约6至约7. 5，和生长温度为约20至约35°C。
在某些实施方式中，宿主细胞是突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
通过引用引入
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用引入本文，正如各个出版物、专利或专利申请都特别地和単独地说明通过引用引入本文一祥。
附图简述
本发明的新颖特征在所附的权利要求
书中详细说明。參照下面给出的利用了本发明原理的说明性实施方式的详细说明和附图可以更好的理解本发明的特征和优势。
图I.示例性的优化CRM197基因的氨基酸和DNA序列。A.氨基酸序列(SEQ IDNO: 1)B. DNA 序列(SEQ ID NO 2)
图2. CRM197的高通量表达分析。用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析使用如图IB所示的DNA序列表达的CRM 197蛋白。测试的40个CRM197表达菌株的可溶性部分显示于由SDS-CGE数据产生的凝胶样图像。如表6中描述的菌株名称列于各道上方。荧光假单胞菌表达的CRM197在SDS-CGE上作为约为58kDa的单一条带迁移(箭头)。
发明详述
CRM197
交叉反应物质197(CRM197)是由具有错义突变的DT基因产生的白喉毒素变异体。CRM197缺乏ADP-核糖基转移酶(ADPRT)活性，且因此是无毒的。CRM197的基因具有单碱基置換，导致谷氨酸替代甘氨酸结合在第52位残基上(见，例如Bishai等，1987，“High-Level Expression of a Proteolytically sensitive Diphtheria Toxin Fragmentin Escherichia coli，，，J. Bact. 169 (11) :5140-51, Giannini 等，1984, “The Amino-AcidSequence of Two Non-Toxic Mutants of Diphtheria Toxin CRM45 和 CRM197，，，NucleicAcids Research 12(10) :4063-9 和 GenBank Acc. No. 1007216A,全部通过引用引入本文)。
可以通过本领域中已知的方法或通过在白喉杆菌或其它微生物中表达以低水平制备CRM197蛋白。可以从可由很多公开来源包括美国典型培养物保藏中心得到的产生毒素的菌株中获得天然存在的或野生型的白喉毒素。用于在白喉杆菌中产生CRM197蛋白的质粒系统由例如美国专利 No. 5，614，382,“Plasmid for Production of CRM Protein andDiphtheria Toxin”的描述,其以其整体通过引用引入。
核苷酸序列可使用重组DNA技术(由例如Sambrook等，Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19899 描述)制备，且也可以基于由棒状杆菌噬菌体P携帯的白喉毒素的野生型结构基因的已知DT核苷酸序列通过定点诱变技术制备(參见，例如，Greenfield 等，1993, “Nucleotide Sequence of thestructural Gene for Diphtheria Toxin Carried by Corynebacteriophage 18，，， ProcNat Acad Sci80 :6953_7，其通过引用引入)。核苷酸序列可如本文其他地方所述进行优化。[0029]密码子优化
在异源表达系统中，优化步骤可以提高宿主产生外源蛋白的能力。蛋白质表达是由一系列包括那些影响转录、mRNA加工及翻译的稳定性和起始的因素的许多因素控制的。多核苷酸优化步骤可以包括提高宿主产生外源蛋白能力的步骤，以及辅助研究人员有效地设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括,例如,翻译起始区的修饰、mRNA结构元件的改变和不同密码子偏倚性的使用。优化核酸序列以提高在细菌宿主中异源蛋白的表达的方法在本领域中是已知的，并在文献中描述。例如，用于假单胞菌宿主菌株中表达的密码子优化描述在美国专利申请公开号2007/0292918，“Codon Optimization Method”中，其全部内容通过引用并入本文。
因此，优化可以处理异源基因的多种序列特征中的任意ー种。作为具体的实例，稀有密码子引起的翻译中止可导致异源蛋白表达的降低。稀有密码子引起的翻译中止包括在目标多核苷酸中存在很少在宿主生物体中使用的密码子可能对蛋白质的翻译有负面影响，因为它们在可用的tRNA池中的缺少。提高宿主生物体中最佳翻译的方法包括可导致稀有 宿主密码子从合成的多核苷酸序列中去除的密码子优化。
替代的翻译起始也可以导致异源蛋白表达的降低。替代的翻译起始可包含偶然地包含能够作为核糖体结合位点(RBS)发挥功能的基序的合成多核苷酸序列。这些位点可引起从基因内部位点起始截短蛋白的翻译。降低产生截短蛋白(其可能难以在纯化过程中去除)的可能性的ー种方法包括从优化的多核苷酸序列中消除推定的内部RBS序列。
重复引起的聚合酶滑脱可以导致异源蛋白表达的下降。重复引起的聚合酶滑脱涉及表明会引起可产生移码突变的DNA聚合酶的滑脱或ロ吃(stuttering)的核苷酸序列重复。这样的重复序列也能引起RNA聚合酶的滑脱。在具有高G+C含量偏倚性的生物体中，可以有更高程度的由G或C核苷酸重复构成的重复序列。因此，降低引起RNA聚合酶滑脱的可能性的ー种方法包括改变G或C核苷酸的延伸重复序列。
干扰ニ级结构也可能导致异源蛋白表达的下降。ニ级结构可以隔离RBS序列或起始密码子，且与蛋白质表达的下降相关。茎-环结构也可以參与转录中止和减弱。优化的多核苷酸序列在核苷酸序列的RBS和基因编码区中可以含有最少的ニ级结构以允许转录和翻译的改善。
另ー种可能影响异源蛋白表达的特征是限制性位点的存在。可以通过除去可能干扰随后转录单位亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点优化多核苷酸序列。
例如，可以通过识别由宿主异源表达所需的氨基酸序列开始优化过程。可以从该氨基酸序列设计候选多核苷酸或DNA序列。在设计合成DNA序列时，密码子选择的频率可以与宿主表达有机体的密码子选择进行比较和稀有宿主密码子可以从合成序列中除去。此夕卜，合成的候选DNA序列可以被修饰以除去不想要的限制性酶切位点，以及添加或移除任何所需的信号序列、接头或非翻译区。可以分析合成DNA序列中可能会干扰的翻译过程的ニ级结构的存在，如G/C重复序列和茎-环结构。在候选DNA序列合成之前，可以检验优化的序列设计以确认该序列正确编码所需的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技术合成候选DNA序列，如本领域中已知的那些合成技术。
在本发明的另ー个实施方式中，可以使用宿主生物体如荧光假单胞菌中的通用密码子选择来优化异源多核苷酸序列的表达。可以评估在宿主表达系统中被视为对于特定氨基酸优选的稀有密码子的百分比和分布。5%和10%的选择率值可作为确定稀有密码子的临界值。例如，表I中列出的密码子在荧光假单胞菌MB214基因组中的计算出现率小于5%，因而通常避免用于在荧光假单胞菌宿主中表达的优化基因中。
表.I荧光假单胞菌MB214中出现率低于5%的密码子
SSS使用的密码子%出现率^
—GGly ~GGA3.26
IIleATA3.05
LLeuCTA1.78
CTT4.57
TTA1.89
RArgAGA1.39
AGG 2.72CGA 4.99_S SerTCT _428_
本发明考虑使用任何CRM197编码序列，包括已针对在所使用的假单胞菌宿主细胞中表达进行优化的任何序列。预想使用的序列可以进行任何程度的优化，包括，但不限干，优化以消除在假单胞菌宿主细胞中出现率小于5%的密码子、在假单胞菌宿主细胞中出现率小于10%的密码子、稀有密码子引起的翻译中止、推定的内部RBS序列、G或C核苷酸的延伸重复序列、干扰性ニ级结构、限制性位点或它们的组合。
此外，在本发明的实施中任何有用的分泌前导序列的氨基酸序列可以由任何合适的核酸序列编码。
表达系统
用于在假单胞菌宿主细胞以及可用于本发明的方法中的宿主细胞中表达异源蛋白质的方法(包括可用的调控序列(例如，启动子、分泌前导序列和核糖体结合位点))在下列文献中有描述，例如，题目均为“Method for Rapidly Screening Microbial Hosts toIdentify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expressionof Heterologous Proteins”的美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请系列号12/610，207、题目为“Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescensパ的美国专利申请公开号2006/0040352和题目为“Process for Improved ProteinExpression by Strain Engineering”的美国专利申请公开号2006/0110747,通过引用将所有这些文献全文引入。这些出版物中，还描述了可用于实施本发明方法的细菌宿主菌株，其已被工程化以过表达折叠调节因子或其中为了增加异源蛋白质的表达，已引入蛋白酶突变(包括缺失)。
前导序列
前导序列在下列文献中有详细描述美国专利申请公开号2008/0193974和2010/0048864,题目均为 “Bacterial Leader Sequences for Increased Expression，，及美国专利申请公开号2006/0008877,题目为“Expression systems with Sec-secretion”，其全部通过引用引入本文，以及美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请系列号 12/610，207。
表2.示例性分泌前导序列
权利要求
1.用于在假单胞菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括 将编码与指导CRM19转移到周质的分泌信号融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中； 用该表达载体转化所述假单胞菌宿主细胞； 在适合所述重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的假单胞菌宿主细胞； 其中得到的可溶性CRM197的产率为约O. 5克每升至约12克每升。
2.权利要求
I所述的方法，其中所述假单胞菌宿主细胞具有至少ー种蛋白酶表达的缺陷，或其中所述假单胞菌宿主细胞过表达至少ー种折叠调节因子。
3.权利要求
2所述的方法，其中所述假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和 aprA-o
4.权利要求
3所述的方法，其中所述分泌前导序列是Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V或Pbp。
5.权利要求
2所述的方法，其中所述假单胞菌宿主细胞具有Serralysin、HslU,HslV,Prcl、DegPl、DegP2或AprA表达的缺陷，或其中所述假单胞菌宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC 和 DsbD。
6.权利要求
5所述的方法，其中所述宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且分泌前导序列是Azu。
7.权利要求
5所述的方法,其中所述宿主细胞是Serralysin表达缺陷的,且分泌前导序列是Pbp或Azu。
8.权利要求
5所述的方法，其中所述宿主细胞是HslU和HslV表达缺陷的，且分泌前导序列是Pbp或Azu。
9.权利要求
I所述的方法，其中所述假单胞菌宿主细胞是野生型的，且分泌前导序列是 Pbp 或 Azu。
10.权利要求
I所述的方法，其中所述分泌前导序列是Azu、Pbp>IbpS31A、CupA2或PbpA20Vo
11.权利要求
I所述的方法，其中所述CRM197核苷酸序列已对于在假单胞菌宿主细胞中表达进行优化。
12.权利要求
I所述的方法，其中所获得的可溶性CRM197的产率是约O.5g/L、约O. 6g/L、约 O. 7g/L、约 O. 8g/L、约 O. 9g/L、约 lg/L、约 I. 5g/L、约 2g/L、约 2. 5g/L、约 3g/L、约 3. 5g/L、约 4g/L、约 4. 5g/L、约 5g/L、约 5. 5g/L、约 6g/L、约 6. 5g/L、约 7g/L、约 7. 5g/L、约 8g/L、约 8. 5g/L、约 9g/L、约 9. 5g/L、约 10g/L、约 10. 5g/L、约 I lg/L、约 12g/L、约 O. 5g/L 至约 Ig/L、约 O. 5g/L 至约 2g/L、约 O. 5g/L 至约 3g/L、约 O. 5g/L 至约 4g/L、约 O. 5g/L 至约 5g/L、约O. 5g/L 至约 6g/L、约 O. 5g/L 至约 7g/L、约 O. 5g/L 至约 8g/L、约 O. 5g/L 至约 9g/L、约 O. 5g/L 至约 10g/L、约 O. 5g/L 至约 I lg/L、约 O. 5g/L 至约 12g/L、约 lg/L 至约 2g/L、约 lg/L 至约3g/L、约 lg/L 至约 4g/L、约 lg/L 至约 5g/L、约 lg/L 至约 6g/L、约 lg/L 至约 7g/L、约 lg/L至约 8g/L、约 lg/L 至约 9g/L、约 lg/L 至约 10g/L、约 lg/L 至约 I lg/L、约 lg/L 至约 12g/L、约2g/L至约3g/L、约2g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L、约2g/L至约6g/L、约2g/L至约7g/L、约 2g/L 至约 8g/L、约 2g/L 至约 9g/L、约 2g/L 至约 10g/L、约 2g/L 至约 llg/L、约 2g/L 至约 12g/L、约 3g/L 至约 4g/L、约 3g/L 至约 5g/L、约 3g/L 至约 6g/L、约 3g/L 至约 7g/L、约3g/L至约8g/L、约3g/L至约9g/L、约3g/L至约10g/L、约3g/L至约llg/L、约3g/L至约12g/L、约4g/L至约5g/L、约4g/L至约6g/L、约4g/L至约7g/L、约4g/L至约8g/L、约4g/L 至约 9g/L、约 4g/L 至约 10g/L、约 4g/L 至约 llg/L、约 4g/L 至约 12g/L、约 5g/L 至约6g/L、约 5g/L 至约 7g/L、约 5g/L 至约 8g/L、约 5g/L 至约 9g/L、约 5g/L 至约 10g/L、约 5g/L至约llg/L、约5g/L至约12g/L、约6g/L至约7g/L、约6g/L至约8g/L、约6g/L至约9g/L、约 6g/L 至约 10g/L、约 6g/L 至约 llg/L、约 6g/L 至约 12g/L、约 7g/L 至约 8g/L、约 7g/L至约9g/L、约7g/L至约10g/L、约7g/L至约llg/L、约7g/L至约12g/L、约8g/L至约9g/L、约 8g/L 至约 10g/L、约 8g/L 至约 llg/L、约 8g/L 至约 12g/L、约 9g/L 至约 10g/L、约 9g/L 至约 llg/L、约 9g/L 至约 12g/L、约 lOg/L 至约 llg/L、约 lOg/L 至约 12g/L 或约 llg/L 至约 12g/L。
13.权利要求
I所述的方法，还包括在活性分析中測定重组CRM197蛋白的活性，其中约40%至约100%所产生的可溶性CRM197确定为活性的。
14.权利要求
13所述的方法，其中所述活性分析是免疫学分析或受体结合分析。
15.权利要求
I所述的方法，其中所述表达载体包含可操作地连接到所述蛋白编码序列的Iac衍生启动子，且其中所述培养包括使用浓度为约O. 02至约I. OmM的IPTG诱导启动子，诱导时的细胞密度是约40至约200个吸光度単位(AU)的光密度，培养物的pH是从约6至约7. 5，和生长温度为约20至约35°C。
16.权利要求
I所述的方法，其中所述宿主细胞是荧光假单胞菌。
专利摘要
本发明涉及在细菌宿主中生产重组蛋白的领域。特别是，本发明涉及用于从细菌宿主获得高水平的重组CRM197蛋白的制备方法。
文档编号C12P21/02GKCN102858981SQ201080066026
公开日2013年1月2日 申请日期2010年4月9日
发明者D·M·雷塔拉克, L·周, H·金 申请人:菲尼克斯公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan