一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因表达分析技术领域，特别设及一种基于二代测试平台的中通量基 因表达分析方法。
【背景技术】
[0002] 在后基因组学时代，基因组学研究重屯、已开始从掲示生命的所有遗传信息转移到 在分子整体水平对功能的研究上。研究者们通过分析基因表达水平，可从中获取基因转录 基因调控信号转导通路核酸和蛋白质结构功能及其相互联系等相关信息；掲示基因在时 间、空间上的表达及调控模式，为研究基因功能，阐释复杂性状提供新的方法。
[0003] 分析目的基因表达量的常用技术有如下几种:传统的Nodhern blot分析和核糖 核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay)灵敏度低，过程繁琐，通量低（Parker, R.M.&Barnes,N.M.(1999)Methods Mol.Biol.106,247-283&Hod,Y.(1992)BioTechniques 13,852-854);基因忍片表达谱(DNA chip)具有高通量的优势，但难W避免高成本，重复性 较差的缺点；通常来说，实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)和竞争性PCR (competitive PCR)被认定为灵敏度最高的定量PCR方法化ivak，K.J.，Flood，S.J.， MarmaroJ. ,Giusti,W.&Deetz,K. (1995)PCR Methods Appl.4,357-362&Becke;r-Andre, M.&Hahlbrock，K.(1989)Nucleic Acids Res.17,9437-9446)。
[0004] 然而，在面对大量样本时，Real-time PCR的实验成本让许多研究者难W接受；另 一个短处是Real-time PCR很难矫正在扩增期间管与管的差异，从而影响最终稳定性 (Siebert，P. D.化arrick，J. W. (1992)NaUire 359，557-558)。竞争性PCR利用目标模板与内 参照模板共用同一对引物的特点，实现了同引物在同条件下的竞争性扩增，有着更高的稳 定性和低廉的价格化orena Zentilin，Mauro Giacca(2007)NATURE PROTOCOLS 2,2092-2104)。但是目前的竞争性PCR也存在一些弊端:利用琼脂糖凝胶电泳定量产物时面临动态 检测范围低，通量低，稳定性差的问题(Bustin ,S.A. (2000) J. Mol. Endocrinol. 25,169-193);利用质谱定量则要引进单碱基延伸反应(base extension reaction)，增加了实验成 本，并且多基因产物均一'性不好，对于低丰度的基因分辨率低（化unming Ding,畑arIes R.Cantor(2003)PNAS.100，3059-3064)。
[0005] 近十年来，高速发展的二代测序技术已广泛应用于全基因组和扩增子(PCR产物） 测序中，与Sanger测序相比，数据量急剧上升，而成本大幅下降，2014年，Illumina公司的 化seq X平台已经实现了 1000美金一个人类基因组测序的目标，比十年前的30亿美金降低 了300万倍(Watson M.(2014)Genome Biology. 15(2))。在分析基因表达方面，二代测序平 台也得到了应用，例如基于转录组测序的数字基因表达谱(RNA-seq)，但是该技术序列数 (Reads)的测序深度很难区别许多低丰度和中等丰度基因的差异化信息（Simon J.Furney, Malin Pedersen. (2013)CANCER DISCOVERY 10,1122-9)，并且，研究者往往只需对自己感 兴趣的基因进行表达差异分析，因此，一种具有高准确度，通量适中，成本低廉的基因表达 分析方法亟待建立。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于二代测试平台的中通量基因表达分 析方法，该方法通过多重竞争性PCR对目标基因CDNA构建文库，再基于二代测序平台检测的 中通量基因表达分析方法，W降低现有基因表达分析技术的成本，并具有较高的准确度和 稳定性。
[0007] 本发明的一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：
[0008] (1)按照多个基因的相对表达量将基因相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引 物浓度比例;其中，多个基因包括看家基因和目标基因；
[0009] (2)将步骤（1)中每个基因的两组逆转录引物A和B，W标准品RNA为模板分别进行 A，B两组多重逆转录反应，构建标准品A，B竞争性模板；W待测样品RNA为模板进行B组多重 逆转录反应，构建待测样品B竞争性模板；
[0010] (3)利用步骤(2)中的标准品A，B竞争性模板和待测样品B竞争性模板进行S轮多 重竞争性PCR;
[0011] (4)混合所有步骤(3)中得到的第=轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序， 提取数据并计算测定序列数，根据标准品梯度比例数据绘制标准曲线，校准待测样本数据， 将看家基因归一化处理后，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。
[0012] 所述步骤(1)中多个基因为8个基因，包括5个目的基因和3个看家基因。
[0013] 所述步骤（1)中基因的相对表达量是通过Real-Time PCR检测，根据Ct值的高低将 PCR引物分为两组。
[0014] 所述步骤(1)中调整引物浓度比例满足多个基因产物均一性为差异在35倍W内。 [001引所述调整引物浓度为将相对表达量较高的基因特异性PCR引物浓度下调1倍至4 倍。
[0016] 所述步骤(2)中逆转录引物A和B中引入相邻两个位点单碱基突变，逆转录后得到 两种单碱基差异的cDNA。
[0017] 所述基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法应用于基因表达分析实验中。
[0018] 所述步骤(3)中S轮多重竞争性PCR包括：
[0019] 将标准品A，B竞争性模板按体积梯度比例混合，将待测样品B竞争性模板与标准品 A竞争性模板等体积混合，作为第一轮多重竞争性PCR模板，混入低表达基因对应的引物，进 行第一轮多重竞争性PCR反应；
[0020] 将第一轮多重竞争性PCR反应得到的第一轮多重竞争性PCR产物原液作为第二轮 的模板，混入高表达基因对应的引物，进行第二轮多重竞争性PCR反应；
[0021] 将第二轮多重竞争性PCR产物原液作为模板，加入接头引物和测序引物，进行第S 轮多重PCR反应。
[0022] 所述梯度比例为化L 16化，化L 12化，化L ，1化^ ，1化^ 。
[0023] 所述待测样本B竞争性模板与标准品A竞争性模板等体积比为化
[0024] 本发明设及的竞争性PCR模板的构建方法，包括:针对目的基因设计各含有一个不 同突变位点的两种逆转录引物，分别进行逆转录反应后，得到两种不同的单位点突变竞争 性CDNA模板。
[OO巧]本发明设及的S轮多重竞争性PCR方法，包括:按照ReaI-t ime PCR的Ct值对多个 基因分为表达量高低两组，在组内进行对应引物浓度比例调整；向混有多个基因的不同竞 争性模板管中，加入低表达基因对应的引物，进行第一轮有限PCR扩增；W第一轮PCR产物原 液为模板，加入高表达基因对应的引物，进行第二轮有限PCR扩增；W第二轮PCR产物稀释液 为模板，添加接头引物和测序引物，进行第S轮PCR扩增。其中，S轮的PCR循环数优选分别 为 10 轮(cycle), 20 轮，15 轮。
[0026] 具体而言，本发明包括：
[0027] 特异性PCR引物设计：针对基因cDNA序列化ttp : //asia . ensembl. org/)，利用 ?1'；[1116^在线软件化1：19:/7；1^1'0(10.'\￥；[.111；[1：.6山1/91'；[1116^/)进行设计，并在上下游引物5'端 分别添加上下游通用序列，进而合成引物(2化P左右）。
[002引特异性逆转录引物A，B设计：参照CDNA序列，将上述特异性PCR引物3'端延伸14个 碱基(bp)，并分别在第3、4位进行碱基颠换突变，作为A，B两种特异性逆转录引物。
[0029] 接头引物设计:接头引物包含=部分序列，从5'端开始依次是二代测序接头引物、 条形码(barcode)序列、通用序列。条形码序列的作用是区分不同的样本。
[0030] 引物分组:利用Real-time PCR检测多个基因在标准品中表达差异，按照Ct值高低 将相应PCR引物分为两组。具体过程为：
[0031] (1)化g D化Se 1处理过的标准品RNA加入到11.5化逆转录酶体系中，其中逆转录 酶体系包含2mM dNTPs，5XRT buffer 2化，20011/化逆转录酶0.化LJOUAiL RNA酶抑制物 和0.任意一组特异性逆转录引物;反应程序为：25 °C 5min; 42 °C 60min，70°C 5min，逆转录 完成后将cDNA置于4°C临时保存备用。上述体系和反应程序可W依照常规逆转录反应条件 或试剂盒进行适当调整。
[0032] (2)将上述CDNA稀释5倍，针对每个基因分别取2.扣L作为模板，混入Real-time PCR 15化体系，包含特异性PCR引物8pM，dd出0 2.化L，10iiL Mix，0.化L Rox;反应程