基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，特别是涉及高发遗传性肠癌易感基因无创检测的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国恶性肿瘤的发病率呈现明显的上升趋势，相比于70年代中期增加了 83. 1%。统计数据显示，我国平均的患癌率为286/10万人，死亡数达到181/10万人，这就 意味着我国每年新发的癌症病例达235万人，每分钟就有6个人被诊断为癌症。研宄表明， 癌症的形成与外界环境、生活习惯以及自身遗传等多个因素有关，其中遗传因素约占到癌 症发病人群的10%左右。遗传性的癌症主要分为两类，一种是将癌症遗传给下一代，常见 的有肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤，它们都属遗传性疾病，由异常的基因决定，80%~90% 带有这些异常基因的后代将患这类癌症；另一种是将患癌的风险遗传给下一代，对于这种 情况，子女携带的突变基因意味患某种肿瘤风险和可能性相比于不携带突变基因的正常人 大大增加。肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，肠癌的发病率男女均处 于恶性肿瘤的第3位，其中在西方发达国家，肠癌的发病率处于第2位。根据国际癌症研 宄组织（IARC) 2005年提供的数据显示，在一些相对发达的西亚国家，肠癌的发病率呈现快 速增长趋势，其肠癌的发病率与西方国家非常接近。在日本男性肠癌年龄标准化发病率为 49. 3/10万，韩国为24. 7/10万，新加坡为35. 1/10万，而在北美和西欧则分别为44. 4/10万 和42. 9/10万。在我国，随着生活水平的不断提高，饮食习惯的改变，肠癌的发病率呈上升 态势，排在恶性肿瘤和致死因素的第4位，并且中国的结直肠癌每年发病递增速度为世界 平均数的两倍。我国肠癌的高发区主要是长江三角洲地区、珠江三角洲地区以及港澳台地 区，苏浙沪三地是最高发区。在发病年龄上，我国肠癌的平均发病年龄逐渐增大，已从20世 纪60年代的48岁上升到90年代的55岁，这可能与中国社会的人口老龄化有关。已发现 达到50岁者，其罹患肠癌的风险明显增加，并且每增长10岁其风险增加1倍。然而，青年 患者中恶性程度较高的黏液腺癌和印戒细胞癌的比例显著高于老年患者。
[0003] 结肠癌的发生是遗传和环境因素长期相互作用的结果，是由结肠粘膜的病变（非 典型增长腺瘤等）演变而来。研宄表明，结肠癌的形成可能需要10年的时间，仅从内镜下可 辨认的腺瘤发展成侵袭性癌就需要5年左右的时间。早期结肠癌可无症状，但早期的结肠 癌是可以治愈的，而进展期的结肠癌则预后较差，术后5年生存率仅60%左右。结肠癌的早 期诊断已不再是仅仅发现体积较小的癌肿，而是可以诊断刚形成或发生癌变的结肠癌。及 时发现可治愈的癌前病变或早期癌具有相当重要的临床意义。
[0004] 目前，基因诊断技术的发展为大肠癌早期诊断提供了可能性。分子生物学研宄显 示：大肠癌的发生涉及多种癌基因的激活及抑癌基因的失活，在肿瘤克隆形成过程中，基因 改变早于形态改变，对这些基因及其产物进行检查，将有助于早期诊断。在人群普查开展得 比较好的国家，结直肠癌死亡率相对较低，例如英国、丹麦、瑞典等国家。提高早期诊断率是 提高结直肠癌患者存活率的关键。此外高危人群应视为结直肠癌筛查的重点人群，但自然 人群普查是发现早期结直肠癌的最有效的方法之一，既可以提高患者的长期生存率，又可 以降低发病率。
[0005] 研宄表明大肠癌是一种遗传倾向比较明显的恶性肿瘤，其发病既受遗传因素的影 响又受环境因素的控制。遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC)主要与遗传因素有关，呈常染 色体显性遗传，外显率高达70% -80%。它发病的分子遗传学基础是一系列错配修复（MMR) 基因的种系突变所致，其中hMLHl和hMSH2在HNPCC的发病中起主要作用，占所有突变的 90%。该基因的表达产物错配修复蛋白是一种核酸水解酶，可以水解DNA复制过程中错配 的碱基对以及可能出现的小片段的碱基插入和缺失，从而保证DNA复制的准确无误，使人 类遗传的稳定性和保守性得以实现。此种基因一旦发生突变，错配修复蛋白的表达量就会 减少或缺失，结果使DNA复制过程中错配的碱基对增加，表现为DNA简单重复序列的扩增或 缺失，即微卫星不稳定性（MSI)，从而导致肿瘤的发生。MSI可以说是MMR基因突变的表现 型，hMLHl和hMSH2的蛋白表达和MSI可以间接地反映MMR基因突变情况。我国每年有近 数十万人被诊断出遗传性癌症，其中大多数人被诊断出时已经是癌症晚期，错过了最佳的 治疗时间，因此，对遗传性癌症的早发现和早治疗是提高肿瘤患者生存率的最重要的途径， 其中早期诊断是关键，是提高肿瘤患者的治愈率，延长生存期的首要环节。
[0006]目前，市场上对于遗传性肿瘤的诊断方法多数停留在单个肿瘤单个或几个位点的 检测水平，检测方法多为荧光PCR、芯片法等方法，这些方法都存在不同的缺陷，例如操作 繁琐、引物或探针设计复杂、结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多，联合基因数目较 少、通量低等问题，难以满足目前检测样本数量大，检测位点多、分布广、检测准确性高等 检测要求，因此急需一种新型的检测手段以满足市场和医疗的需求。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种基于LifeTechnologies公司的IonTorrentPGM二代测序平 台对国内发病率较高的遗传性肠癌的10个易感基因热点SNP位点无创检测的试剂盒，该试 剂盒检测通量高、灵敏度高、特异性强，一次检测能够覆盖245个热点SNP位点。
[0008] 为实现上述技术目标，本发明的技术方案是基于二代测序技术的无创多基因遗传 性肠癌检测试剂盒，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括SEQ N0 :1~SEQN0 :272 的引物；
[0009] 所述SEQN0 :1~SEQN0 :272的引物见表1。
[0010] 所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括：MasterMix llyl、包含所述SEQN0:1~SEQN0:272引物的引物panel5.5yl、待测DNA样品4.5yl。
[0011] 所述SEQNO:1~SEQNO:272引物在引物panel的浓度均为100nM。
[0012] 优选的，所述MasterMix组成为：PCRbuffer(5X) 4u1、MgCl2 1. 5u1、Taq酶 1. 5y1、ddH20 4yl〇
[0013] 优选的，所述基于二代测序