一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方 法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌（Haemophliusparasuis，HPS)是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏 阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科（Pastteurellacea)嗜血杆菌属（Haemophilus),有15种血 清型，还有20%的菌株血清型无法确定。该菌能够引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜 炎，由该菌引起的副猪嗜血杆菌病又称为猪革拉斯氏病（Glkser'sdisease)。HPS可以影 响2周龄~4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，常见于5~8周龄，发病率可 达40%，严重时死亡率可达50%。随着我国规模化养猪场的发展，HPS感染有明显增加趋势， 已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，每年给我国养猪业造成巨大经 济损失。因此，建立一种副猪嗜血杆菌的检测技术，对于监控该菌的繁殖、疾病发生和流行 以及疾病的及时防治都具有重要的意义。
[0003] 常规的生理生化方法虽然可以准确鉴定待检菌株，但是操作繁琐，耗时长。中国专 利CN102220426A公开了副猪嗜血杆菌PCR检测试剂盒，该试剂盒是针对传统的16SrRNA序 列设计的引物，对巴氏杆菌科及嗜血杆菌属的其他成员（如巴氏杆菌、副禽嗜血杆菌等）特 异性效果欠佳，且其灵敏度仍需改善。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、耗时 短、检测准确、有效的副猪嗜血杆菌的检测试剂盒。
[0005] 本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为： 本发明提供了一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括序列如SEQIDN0: 1-2所示的引物对F1、R1各100ML、2XPCRMix1.25mL、阳性对照副猪嗜血杆菌DNA200ML 和ddH20 2X1. 25mL; 所述引物对序列为： mviN-Fl5'GGTATGACCCTACTTTCTCG3' mviN-Rl5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT3' 上述检测试剂盒内为100次含量。
[0006] 进一步的，所述PCRMix包括PCR缓冲液，dNTP，PfuDNA聚合酶。
[0007] 本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌的检测方法，该检测方法为使用上述提供的检 测试剂盒进行副猪嗜血杆菌的检测。
[0008] 上述检测方法包括以下步骤： a、 提取样品DNA:提取待检样品中的DNA备用； b、 基因扩增：将提取的样品DNA加入检测试剂盒中，对待检样品中的DNA进行PCR扩 增； C、结果检测：对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0009] 进一步的，步骤a中，所述待检样品为细菌分离培养物、组织研磨液或血液样品。
[0010] 进一步的，步骤b中，PCR扩增条件为：95°C5min;95°C45s，55°C45s，72°C90s， 32 个循环；72°C10min;4°C保存。
[0011] 本发明中所述的检测试剂盒中，阴性对照为灭菌水（ddH20)，阳性对照为副猪嗜血 杆菌DNA。
[0012] 本发明设计的特异性好、灵敏度高的引物是实现所述目的的关键因素，为了克服 传统的针对16SrRNA序列设计的引物对于巴氏杆菌、副禽嗜血杆菌等特异性结果欠佳的弊 端，本发明针对mviN基因序列，设计出特异性好、灵敏度高的引物，mviN基因有其自身的独 特性，存在于许多对人、动物及植物致病的微生物中，且mviN基因具有高度保守区域，因此 用于HPS的检测时准确度高。
[0013] 本发明的优点及有益效果为：本发明针对具有高度保守区域的mviN基因序列设 计的引物，具有特异性好，能够准确的区别副猪嗜血杆菌LC株同副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺 炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌；且本发明提供的试剂盒 灵敏度高，可检测副猪嗜血杆菌DNA不低于100Xl(T5ng/ML的待检样本，耗时短且检测准 确、有效。
【附图说明】
[0014] 图1为检测引物的选择结果。
[0015] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :固体培养物（引物对F1/R1) ;2 :液体培养物（引物对 F1/R1) ;3 :固体培养物（引物对F2/R2) ;4 :液体培养物（引物对F2/R2) ;5 :阳性对照；6 :阴 性对照。
[0016] 图2为副猪嗜血杆菌mviN基因PCR特异性试验结果。
[0017] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :副猪嗜血杆菌LC株；2 :副禽嗜血杆菌；3 :猪胸膜肺炎 放线杆菌；4 :巴氏杆菌；5 :化脓隐秘杆菌；6 :金黄色葡萄球菌；7 :猪链球菌；8 :阴性对照。
[0018] 图3为副猪嗜血杆菌mviN基因PCR灵敏度试验结果。
[0019] M：MarkerDL2000 ；1 ： 100XlO^ng/l^L；2 ： 100X10_2ng/m；3 ： 100XlO^ng/M'L；4 ： 100Xl(T4ng/ML;5 :100Xl(T5ng/ML;6 :100Xl(T6ng/ML;7 :100Xl(T7ng/ML;8 :阴性对照。
[0020] 图4为死亡猪组织样品中副猪嗜血杆菌的检测结果。
[0021] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :死亡猪1号组织样品；2.死亡猪2号组织样品；3 :阴 性对照；4 :阳性对照。
[0022] 图5为死亡猪1号的组织扩增产物测序结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例的具体实例方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但 不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。
[0024] 本发明所需材料、试剂 1.菌株 副猪嗜血杆菌LC株、副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、 金黄色葡萄球菌、猪链球菌等均由本实验室分离、鉴定及保存。
[0025] 2?试剂 TSA培养基称取40gTSA粉末加入940ml蒸馏水中，经121°C灭菌15分钟。冷却至 50°C左右，加入50ml新生牛血清和10ml过滤除菌的浓度为0. 1%的辅酶（NAD)溶液，充分 摇匀后倒平皿。
[0026] TSB培养基称取30gTSB粉末加入940ml蒸馏水中，经121°C灭菌15分钟。临 用前加入50ml新生牛血清和10ml过滤除菌的浓度为0. 1%的NAD溶液，混合均匀后配制而 成。
[0027] PCRMix(PCR 缓冲液 800ML，dNTP 400ML，Pfu DNA 聚合酶 5〇ML)，SDS 溶液，蛋白 酶K，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇。
[0028] 实施例1 1. DNA模板的制备： 液体培养物取副猪嗜血杆菌LC株菌液10000r/min离心5min，弃上清液，用灭菌水重 悬后，于沸水中煮沸lOmin，-20°C冻结，融化后，10000r/min离心5min，取上清液作为DNA模 板。
[0029] 固体培养物挑取若干个菌落悬浮于100ML灭菌水中，吹吸混匀后，于沸水中煮沸 lOmin，-20°C冻结，融化后，10000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板。
[0030] 2.引物设计 根据GenBank公布的故5mviN基因序列（CP001321. 1)，设计两对特异性引物，送上海 生工生物工程技术服务有限公司合成，PCR引物对序列见表1。
[0031] 表1PCR引物对序列
【主权项】
1. 一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒，其特征在于：包括序列如SEQIDNO: 1-2所示的 引物对FI、R1各100ML、2XPCRMix1. 25mL、阳性对照副猪嗜血杆菌DNA200ML和ddH20 2X1. 25mL； 所述引物对序列为： mviN-Fl5'GGTATGACCCTACTTTCTCG3' mviN-Rl5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT3'。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述PCRMix包括PCR缓冲液， dNTP，PfuDNA聚合酶。
3. -种副猪嗜血杆菌的检测方法，其特征在于：使用权利要求1所述的检测试剂盒进 行副猪嗜血杆菌的检测。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： a、 提取样品DNA:提取待检样品中的DNA备用； b、 基因扩增：将提取的样品DNA加入检测试剂盒中，对待检样品中的DNA进行PCR扩 增； c、 结果检测：对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，所述待检样品为细菌分离 培养物、组织研磨液或血液样品。
6. 根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：步骤b中，PCR扩增条件为： 95°〇51^11;951：458,551：458,721：9〇8,32个循环 ；721：1〇111111;41：保存。
【专利摘要】本发明涉及一种副猪嗜血杆菌的检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域，该检测试剂盒包括引物对、PCR Mix、阳性对照和ddH2O。本发明针对具有高度保守区域的mviN基因序列设计的引物对，特异性好，能够准确的区别副猪嗜血杆菌LC株同副禽嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌；且本发明提供的试剂盒及检测方法灵敏度高，耗时短且检测准确，对于监控该菌的繁殖、疾病发生和流行以及疾病的及时防治都具有重要的意义。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公开号】CN104711359
【申请号】CN201510120697
【发明人】于江, 王金宝, 吴家强, 张玉玉, 杜以军, 李俊, 陈智
【申请人】山东省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月19日