一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记KpnI-1及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记KpnI-1及应用，属于分子 生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可 以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分 子育种。分子标记辅助选择成功的关键在于所获得的分子标记是否与待分析的性状相连锁 以及是否在同一物种的不同材料间具有通用性。
[0003] 西瓜的果肉颜色是西瓜品质构成的一项重要指标，西瓜果实中含有番茄红 素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质等多种色素，不同色素的组成及含量的多少使西 瓜果肉呈现出不同颜色。同时，西瓜果肉中的色素也具有对人体有益的生理功能， 有研宄表明，番茄红素具有高效的抗氧化活性，能有效的降低癌症和心脑血管的发 病率，并可以作为一种功能性色素广泛的应用于功能食品、药品和化妆品中（Sahin K,TuzcuM,SahinN,etal.Nrf2/H〇-lsignalingpathwaymaybetheprimetarget forchemopreventionofcisplatin-inducednephrotoxicitybylycopene.Food ChemToxicol, 2010, 48(10):2670-2674；MortensenA,SkibstedLH,SampsonJ,et al.Comparativemechanismsandratesoffreeradicalscavengingbycarotenoid antioxidants.FEBSLett, 1997,418(12):91-97)。0-胡萝卜素可以减少脂质过氧化保护 有机体不被破坏（OlsonJA.Molecularactionsofcarotenoids.In:CanfieldLM(ed). CarotenoidsinHumanHealth,NewYork.AcademyofSciences, 1993. 156-166)，叶黄素 对维护视力有着重要的作用。因此通过分子标记辅助选择的方法高效的选育不同果肉颜色 的西瓜品种是当前西瓜育种工作的主要部分。
[0004] 随着DNA分子标记技术的快速发展，利用与植物相关基因紧密连锁的分子标记进 行辅助选择，可以极大的加速主要性状的筛选和基因定位，从而大大提高育种选择效率。但 是，西瓜的遗传距离较为狭窄，目前文献已公布的可用的分子标记数目较少且多态性较低， 严重制约了西瓜主要农艺性状基因定位及相关分子标记的开发。
【发明内容】
[0005] 为提供一个CAPS分子标记，用以对含有番前红素和不含有番前红素的西瓜植株 进行分子标记辅助选择，本发明采取了以下技术方案：
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记KpnI-1，通 过该分子标记扩增出的PCR产物片段大小为517bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述标记位于西瓜番茄红素环化酶cds区段，该区段的GenBank登录号为 ABM90917. 1，与西瓜番茄红素0-环化酶基因紧密连锁。
[0008] 所述标记的鉴别引物对正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 所述分子标记KpnI-1应用于鉴定和辅助筛选西瓜的果肉颜色。
[0010] 所述应用是提取待测样品的DNA后，利用鉴别引物对进行PCR扩增，再利用限制性 内切酶对扩增产物进行酶切，最后利用电泳对酶切产物进行检测。
[0011] 所述应用的步骤如下：
[0012] 1)提取待测样品的DNA ;
[0013] 2)以待测样品的DNA为模板，利用鉴别引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0014] 3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
[0015] 4)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤3)所得的酶切产物进行检测。
[0016] 步骤2)所述鉴别引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，反向引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0017] 优选地，步骤2)所述PCR扩增，采用降落PCR，扩增程序为：94°C预变性7min，94°C 变性30s，60 °C退火30s，每循环降低0. 5 °C，72 °C延伸40s，30个循环；94°C变性30s，45 °C退 火30s，72°C延伸40s，10个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0018] 优选地，步骤4)所述对酶切产物进行检测，是利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后 的产物条带是否为517bp，含有517bp条带的样品含有番茄红素，果肉颜色为红色；不含有 517bp条带的样品不含有番茄红素，果肉颜色为黄色。
[0019] 本发明的另一目的在于提供一种所述分子标记KpnI-1的获得方法，该方法的步 骤如下：
[0020] 1)选择一个浅黄色西瓜品系和一个红色西瓜品系；
[0021] 2)利用高通量测序技术对步骤1)所选的两个品系的西瓜进行测序，并将所得 序列与西瓜番茄红素环化酶基因cds区段的序列进行比对，获得存在西瓜番茄红素 0-环化酶基因cds区段的序列的染色体区间；
[0022] 3)在步骤2)所得染色体区间内查找存在SNP突变的碱基区段，并分析SNP位点的 酶切信息，获得存在CAPS突变的序列；
[0023] 4)针对步骤3)所得的序列，设计引物；
[0024] 5)利用步骤4)所得的引物以西瓜基因组DNA为模板进行TD-PCR扩增，获得扩增 产物；
[0025] 6)利用限制性内切酶对步骤5)所得的扩增产物进行酶切验证。
[0026] 本发明利用CAPS分子标记引物通过PCR扩增获得与西瓜果肉颜色相关的DNA片 段，再利用限制性内切酶对获得的片段进行酶切反应，由于两种不同颜色的西瓜材料在所 获得的DNA片段中存在酶切位点的单碱基突变的差异。因此，存在单碱基突变的位点不会 被限制性内切酶切开而获得一条大小为517bp的片段，不存在碱基突变位点的片段会被限 制性内切酶切开，获得389bp及128bp的两个片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰的将两中 不同果肉颜色的西瓜材料进行区分。
[0027] 本发明获得的CAPS分子标记，在不同的果肉颜色的西瓜材料中可以进行很好的 区分，通过对分子标记所在染色体附近序列进行Blast比对的结果可知，该标记与西瓜番 茄红素0_环化酶紧密连锁，因此，本发明获得了一个可以高效区分不同西瓜果肉番茄红 色有无的分子标记，为今后西瓜番茄红素相关主效基因的定位奠定基础。
[0028] 本发明获得的有益效果如下：
[0029]CAPS分子标记是以酶切位点单碱基突变产生多态性的分子标记，以其分布范围广 泛、变异稳定成为基因定